PRACTICA 1.

METODOLOGA

Cuenta total Estndar.

Se pidi el material para el grupo y el material por equipo, de lo cual se esterilizo en la autoclave donde se pusieron los tubos con tapa rosca, los frascos con solucin salina y tambin la pipetas. X

Despus iniciamos con la preparacin de la muestra de diluciones. Se pes 10g del pescado en condiciones aspticas, lo mezclamos con los 90ml de solucin salina, se mezcl durante un minuto, hasta hacerla homognea.

Se hizo la inoculacin por la tcnica de extensin superficial en la placa, se inoculo 0.1 ml de cada dilucin en las placas de agar estndar, sobre la superficie con la varilla de vidrio en ngulo y por ltimo se incubaron las cajas por 35C por 24 y 48 hrs-

Ya que obtuvimos correspondi a 10 1.

la

que

Se tomaron 0.1ml de la dilucin 10-1 y se transfiri a un tubo de 0.9 ml de solucin salina 10-2 y se repita con las soluciones 10-3 , 104 y 10-5.

Despus de la incubacin seleccionamos las placas que tenan entre 30 a 300 colonias. Y se contaron las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas.

Prueba presuntiva para coliformes.

Inoculacin de los tubos con las diluciones decimales, se inocularon una serie de tres tubos conteniendo 10 ml de caldo lauril sulfato con campana de Durham, con 1 ml de dilucin, y se hace de igual manera con los tubos 10-2 y 103.

Se incubaron los tubos por 48hrs a 35C , se revisaron a las 24 hrs. Si la produccin de gas es positiva despus pasamos al refrigerador.

Se elaboraron y esterilizaron medios: EMB y RVB.

los siguientes

Determinacin de E.coli

Despus se inocularon dos placas de cada miedo por estra cruzada a partir de los tubos que nos dieron positivos de EC. Y posteriormente se incubaron por 24 hrs. A 35C.

Identificacin

Bioqumica

Se elaboraron los siguientes medios: Agar SIM, Agar citrato de Simmons y Caldo RM- VP y se esterilizaron al igual que los tubos con rosca que utilizamos tambin se elaboraron algunos colorantes.

Aqu se inocularon los tubos, de las placas se seleccionaron las colonias aisladas de coliformes que son negras con brillo metlico en el medio EMB y rojas en el medio RVB.

Despus se inocularon con un asa de siembra con una porcin de dichas colonias.

Se llenaron los tubos con 12ml de medio cada tubo y se esterilizaron.

Agar SIM se incubo 24hrs a 35C Agar Citrato de Simmons se incubo 48hrs a 35C Caldo RM-VP se incubo 24hrs a 35

Por ltimo se realizaron las pruebas correspondientes de cada medio

CUESTIONARIO
1.- Por qu se cuentan entre 30 y 300 colonias en el mtodo de cuenta total estndar y que otro mtodo de cuantificacin en placa de microorganismos existe? Por lo general la muestra original se diluye de manera que el nmero de colonias que se desarrolla en la placa quede entre los nmeros de 30 a 300. Entre estas cantidades la cuenta es ms exacta y la posibilidad de interferencia en el desarrollo entre un microorganismo y otro es mnima. Generalmente las palcas se cuentan sobre una pantalla iluminada que tiene un gran lente de aumento. Existe otro mtodo llamado recuento microscopio directo donde un volumen medido de una suspensin bacteriana se coloca dentro de un rea definida en un portaobjeto y se agrega un colorante para que puedan verse las bateras y se distinga entre las viable y las muertas. Se usa un portaobjetos diseado especialmente denominado cmara de Petroff-Hauser. Las bacterias mviles son difciles de contar con este mtodo y las clulas muertas aun con el colorante tienen un aspecto similar al de las viva. Se necesita una concentracin elevada de clulas pero la ventaja es que no se requiere tiempo de incubacin. Michael J. Pelczar Jr., Microbiologa, Editorial Mc Graw Hill, 4 edicin, 2 edicin en espaol, ao 1982, pagina 111-113, numero de paginas 826. Tortora, Funke, Case, Introduccin a la microbiologa, 9 edicin, editorial panamericana, ao 2007, numero de paginas 963

2.- Explique si las colonias observadas provienen de grupos de bacterias o de una sola clula Qu significa el trmino de Unidad Formadora de Colonia (UFC)? Se da por supuesto que cada organismo viable se desarrolla y se reproduce hasta formar una colonia cuya transferencia puede hacerse fcilmente. Los aislamientos pueden hacerse con placas sembradas por vertido sucesivas diluciones del inoculo. De tal manera que la cuenta de colonias en la placa, nos seala el nmero de bacterias viables del inoculo. Supone que la suspensin bacteriana es homognea y no hay conglomerados de clulas. Si las clulas tienden a formar conglomerados (ejemplo: racimos de cocos) la cuenta resultante ser menor que el nmero de clulas individuales ya que cada conglomerado de clulas producir una colonia. Por eso se reporta como UFC/mL.

Michael J. Pelczar Jr., Microbiologa, Editorial Mc Graw Hill, 4 edicin, 2 edicin en espaol, ao 1982, pagina 111-113, numero de paginas 826.

3.- Por qu las pipetas deben de cambiarse entre cada dilucin? Cuando se siembra una serie de diluciones a partir del mismo cultivo, se debe cambiar por otra pipeta esterilizada de inoculacin antes de inocular la dilucin siguiente. Cualquier arrastre de materia orgnica puede originar resultados falsos positivos o errneos, ya que llevara una concentracin mayor de la dilucin anterior. http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simmonscitagar.htm

4.- Cules son las caractersticas generales de los coliformes y cul es su importancia como indicadores sanitarios? Las enfermedades entricas causadas por bacterias coliformes se transmiten casi exclusivamente por contaminacin fecal de aguas y alimentos. La transmisin por contaminacin de suministros de agua resulta la forma de infeccin ms importante, habiendo sido causa de epidemias masivas de infecciones entricas

ms graves (fiebre tifoidea y clera). Este problema se erradico en pases por un control sanitario adecuado, una parte esencial de esto fue el desarrollo de mtodos bacteriolgicos para detectar la existencia de contaminacin fecal en aguas y alimentos. Para demostrar la existencia de contaminacin fecal basta poner de manifiesto que la muestra contiene bacterias de las que habitan normalmente en el tracto intestinal, incluso aunque no sean agentes causantes de enfermedad. Las bacterias que principalmente han servido para ese fin son estreptococos fecales y E.coli. Roger Y. Stainer, Microbiologa, 4 edicin, editorial Repla, s.a., ao 1986, pag 603, nmero de paginas 836

5.- Cul es el fundamento bioqumico de los diferentes medios empleados en la prctica y como es el desarrollo tpico de los coliformes en cada uno de ellos? Cuenta total estndar de microorganismos mesfilos aerobios El agar Mtodos Estndar se formula con los ingredientes originales. El extracto de levadura y la peptona de casena han sido utilizados en medios diseados para estudiar la presencia de microorganismos termoflicos. La peptona de gelatina y el extracto de levadura proporcionan la fuente de carbono y nitrgeno. La dextrosa es el carbohidrato fermentable y el agar es adicionado como agente solidificante. Prueba presuntiva para coliformes Caldo Lauril Sulfato con campana Durham

Medio rico en nutrientes, que permite un rpido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la lactosa, an de los fermentadores lentos. La triptosa es la fuente de nitrgeno, vitaminas, minerales y aminocidos, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora acompaante. Por la fermentacin de la lactosa, se produce cido y gas, ste ltimo se evidencia al utilizar las campanas Durham.

Frmula (en gramos por litro) Triptosa 20.0 Lactosa 5.0 Cloruro de sodio 5.0 Lauril sulfato de sodio 0.1 Fosfato dipotsico 2.75 Fosfato monopotsico 2.75 pH final: 6.8 0.2

Un mtodo para determinar E. coli es inocular dilucin en caldo lactosado para ver produccin de acido y gas, ya que estas bacterias forman acido o acido y gas a partir de glucosa. La prueba positiva fue turbidez y formacin de gas en la campana Durham.

Prueba confirmativa de coliformes fecales Caldo EC

El contenido de lactosa en este medio, favorece el crecimiento de bacterias lactosa positivas, parecido al caldo lauril sulfato pero las sales biliares inhiben el crecimiento de gran parte de la flora acompaante. Frmula (en gramos por litro) Triptena 20.0 Lactosa 5.0 Sales biliares N 3 1.9 Fosfato dipotsico 4.0 Fosfato monopotsico 1.5 Cloruro de sodio 5.0 pH final: 6.9 0.2

Determinacin de EC EMB (agar eosina azul de metileno) A partir de tubos positivos se inocula en medios solido especial con composicin que facilita reconocimiento de E. coli. Uno de los medios ms comn es el agar con lactosa y peptona que contiene 2 colorantes: eosina y azul de metileno (EMB). Forma colonias negro-azulados con brillo metlico, mientras que el otro miembro principal del grupo de fermentadores de lactosa con produccin de acido y gas Enterobacter aerogenes (que no

necesariamente indica contaminacin fecal) forma colonias mucosas de color rosa plido y sin brillo. Para la diferenciacin entre estos dos se realizan pruebas bioqumicas (Pruebas IMViC). RVB (agar rojo neutro-cristal-violeta bilis) En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y el rojo neutro es el indicador de pH. Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el medio y producen un viraje del indicador de pH al color rojo intenso. Debido a esto, se observan como colonias de color rojo prpura, de 1 a2 mm de dimetro, rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada. La prueba positiva es turbidez del medio con produccin de gas en campana Durham. Frmula (en gramos por litro) Extracto de levadura 3.0 Peptona 7.0 Sales biliares 1.5 Lactosa 10.0 Cloruro de sodio 5.0 Agar 15.0 Rojo neutro 0.03 Cristal violeta 0.002 pH final: 7.4 0.2

Identificacin bioqumica Agar sim Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae. Frmula (en gramos por litro) Triptena 20.0 Peptona 6.1 Sulfato de hierro y amonio 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Agar 3.5

pH final: 7.3 0.2 1. Produccin de H2S: El medo tiene tiosulfato, el cual libera cido sulfhdrico que es un gas. ste reacciona con la sal de Hierro y forma un precipitado negro que es sulfuro ferroso dando un color negro en la prueba positiva. 2. Movilidad: pueden ser inmviles o mviles con flagelos peritricos. Dan turbidez al medio ya que se difundi por todo el tubo, no solo donde se inocul. 3. Produccin de indol (Reactivo Kovacs): La prueba de formacin de indol a partir de triptfano (grupo funcional indol) que se lleva a cabo en cultivos en medio con peptona rica en triptfano, detecta la produccin de triptofanasa, una enzima que rompe el triptfano en indol, piruvato y amoniaco. Esta enzima est presente en muchas bacterias entricas incluyendo E.coli, pero no se encuentra en Enterobacter aerogenes. Si se libera el indol, ste reacciona con Paradimetil Benzaldeido (Reactivo de Kovacs) dando una prueba positiva color rojo.

Citrato de Simmons: Asimilacin de citrato como fuente de carbono. En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa. -Si se usa un inculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado.

Frmula (en gramos por litro) Citrato de sodio 2.0 Cloruro de sodio 5.0 Fosfato dipotsico 1.0 Fosfato monoamnico 1.0 Sulfato de magnesio 0.2 Azul de bromotimol 0.08 Agar 15.0 pH final: 6.9 0.2

Caldo RM-VP Para la diferenciacin entre estos dos se realizan pruebas bioqumicas (Pruebas IMViC) utilizando clulas de una colonia aislada. De estas pruebas la de rojo de metilo y la de Voges Proskaeur son las ms significativas, porque constituyen una indicacin indirecta de la forma de fermentacin de azucares. Ambas se llevan a cabo sobre cultivos con glucosa-peptona.

Frmula (en gramos por litro) Pluripeptona 7.0 Glucosa 5.0 Fosfato dipotsico 5.0 pH final: 6.9 0.2

1. Oxidacin de acetoina a diacetilo: Voges Proskaeur (o.6ml naftol y 0.2ml KOH): La prueba de Voges Proskaeur consiste en la deteccin de acetoina, compuesto intermediario en la formacin de butanodiol a partir de acido piruvico. Por lo tanto se da la fermentacin butanodioica. Prueba positiva viraje del medio al color rosa o rojo. 2. Acidificacin del medio o produccin de acetoina y diacetilo (Rojo de metilo): La prueba rojo de metilo aporta una medida del pH final: este indicador presenta color amarillo a pH de 8.5 o superior y rojo para valores inferiores. La prueba positiva (color rojo) indica que hay una produccin intensa de cidos caractersticos de la fermentacin acido mixta.

Muchas bacterias sin ser enterobacterias crecen en caldo lactosado con produccin de acido y gas por lo que usar nicamente ese mtodo es muy inespecfico. Existe una alternativa la cual se llama mtodo Eijkman que consiste en inocular en caldo glucosado e incubar a 44C, este mtodo elimina Enterobacter aerogenes y la mayor parte de microorganismos que fermentan lactosa con produccin de gas pero permite crecimiento de E. coli. Tabla 1. Pruebas IMViC para diferenciar entre E. coli y Enterobacter aerogenes. Indol E. coli Enterobacter aerogenes + Rojo de metilo + Voges Proskeaur + Citrato +

Roger Y. Stainer, Microbiologa, 4 edicin, editorial Repla, s.a., ao 1986, pag 603, nmero de paginas 836 http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20METODO%20ESTANDAR.pdf http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lauril.htm

6.- Cules son las ventajas y desventajas del mtodo del nmero ms probable frente al mtodo de cuenta total estndar? Nmero ms probable Ventajas Ms preciso y ms sencillo 5% de error. Es ms probable que los resultados coincidan entre laboratorios a diferencia del recuento en placa. Con medios selectivos y diferenciales se puede determinar el nmero de microorganismos a qu grupo pertenecen.

Desventajas Gran cantidad de material No se puede observar la morfologa de las colonias y se puede confundir el cultivo con otro microorganismo. Puede haber mezcla de microorganismos porque no estamos aislando.

Roger Y. Stainer, Microbiologa, 4 edicin, editorial Repla, s.a., ao 1986, nmero de paginas 836

7.- Cules son los posibles errores que se podran cometer en los mtodos de cuenta estndar y en el mtodo del nmero ms probable que podra afectar su precisin? Mtodo de cuenta estndar 1. Si se inocula en superficie es menos probable que queden homogneamente distribuidas. 2. Si depositamos la muestra y luego le depositamos el agar se homogeniza ms que inoculando en la superficie. 3. Mtodos de muestreo 4. Distribucin de los microorganismos en el alimento 5. Naturaleza de la flora del alimento 6. Naturaleza del alimento 7. Antecedentes del alimento previos al examen 8. Temperatura y tiempo de incubacin Numero ms probable 1. Se ser otro microorganismo el que da los mismos resultados ya que no estamos seguros de que sea el microorganismo deseado. 2. Puede haber mezcla de microorganismos que alteren los resultados. Roger Y. Stainer, Microbiologa, 4 edicin, editorial Repla, s.a., ao 1986, nmero de paginas 836

8.- Cul es el lmite permitido para mesfilos aerobios reportados en las NOM para el producto analizado? 10.1 Clculo del mtodo. 10.1.1 Despus de la incubacin, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias, usando el contador de colonias y el registrador. Las placas de al menos una de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando slo una dilucin est en el intervalo apropiado, vase el cuadro 2, ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilucin y reportar. 10.1.2 Cuando dos diluciones estn en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada por cada dilucin antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro.

http://www.salud.gob.mx/unidades/cofepris/bv/mj/noms/092-ssa1.pdf

9.- Se puede utilizar el mtodo de cuenta total estndar para mesfilos aerobios para predecir la vida de anaquel de producto? Generalmente estiman la duracin de la vida de anaquel de un producto, ya que existe una relacin directa entre el grado de descomposicin y el contenido microbiano. Adems como ya lo vimos E.coli y otros mesfilos aerobios son productores de cido, este le da un sabor malo a lo comida y es indicador de rancidez. http://es.scribd.com/doc/67818942/Practica-Aerobios-Mesofilos-en-Agar

PRACTICA 2.
METODOLOGIA PREENRIQUECIMIENTO Transferir asepticamente 25ml o 25g de la muestra a un matraz con 225 ml de agua peptonada

Licuar durante un minuto en caso de ser necesario

Incubar a 35 C durante 24h.

ENRIQUECIMIENTO Transferir 0.1 ml del cultivo anterior a un tubo con 9.9 ml de caldo Rapapport Vassiladis .

Sembrar dos tubos

Incubar 24 h a 35 C

SALMONELLA Y SHIGELLA

Sembrar por estria simple 2 placas de agar

Agar BGA el color del medio debe de ser rojo brillante para el aislamiento de salmonella .

Incubar 24h a 35C. Seleccionar colonias rosa a blanco y opacas.

Incubar 24h a 35 C. Seleccionar colonias incoloras con centro negro.

Agar ASG el color del medio debe de ser rosaanaranjado para el aislamiento de salmonella .

Para el aislamiento de Shigella. Incubar 24h a 35 C. Seleccionar colonias incoloras

Agar AML el color del medio es rojo. Para el aislamiento de Salmonella

Incubar 24h a 35C. Seleccionar colonias rojas con centro negro.

Para el aislamiento se Shigella , incubar 24h a 35 C. Seleccionar colonias rojas o incoloras.

Incubar 24h a 35 C. Seleccionar colonias incoloras.

Agar XLD el color del medio es rojo cafe. Para el aislamiento de Shigella

SALMONELLA

Sembrar por estria simple 2 placas de agar XLD y 2 placas de BGA.

Invertir las cajas e incubar 24h a 35 C

A partir del crecimiento en los medios anteriores, identificar una colonia caracteristica de Shigella.

SHIGELLA

Sembrar por estria simple 2 placas de agar ASG, 2 placas de agar AMC y 2 placas de agar AHK.

Invertir las cajas e incubar 24h a 35 C.

A partir del crecimiento en los medios anteriores, identificar una colonia caracteristica de Shigella.

IDENTIFICACION BIOQUIMICA

Seleccionar 2 colonias sospechosas que se encuentren en cada placa.

Transferir con el asa una porcion de las colonias seleccionadas a la siguiente serie de tubos.

Agar TSI , para la identificacion de Salmonella y Shigella sembrar por picadura en el fondo y por estria en la superficie

Incubar 24h a 35C.Si sale positiva la superficie es roja y el fondo del medio amarillo y negativa no hay cambio en el medio.

Incubar 24h a 35C. Si sale positiva la superficie del medio es purpura y el fondo del medio purpura y negativa no hay cambio en el medio

Agar ALH, para la identificacion de Salmonella sembrar por picadura en el fondo y por estria en la superficie.

Para la identificacion de Shigella sembrar por picadura en el fondo y por estria en la superficie

Si sale positiva la superficie del medio va hacer purpura y el fondo del medio amarillo y negativa no hay cambio de color en el medio.

Agar AHK , para la identificacion de Salmonella y Shigella sembrar por picadura en el fondo y por estria en la superficie

Incubar 24h a 35C. Si sale positiva la superficie de medio es roja y el fondo del medio amarillo y negativa no hay cambio en el medio

CUESTIONARIO 1. Cul es el fundamento bioqumico de los diferentes medios empleados en la prctica? Indique como es el desarrollo tpico de Salmonella y Shigella en cada uno de ellos. AGAR VERDE BRILLANTE BGA Medio selectivo para el aislamiento de Salmonella (excepto S. Tyfhi y Shigella) La selectividad de este medio, se basa en la concentracin del verde brillante, que inhibe las bacterias Gram positivas y la gran mayora de los Gram negativos.

La lactosa y la sacarosa permiten diferencia la flora acompaante lactosa positiva y lactosa negativa-sacarosa positiva, basndose en caractersticas de Salmonella de no degradar dichos carbohidratos. Las colonias tpicas de Salmonella son traslcidas, ligeramente rojas a rosa con halo rojo brillante. Los organismos fermentadores de lactosa y sacarosa que desarrollan en el medio se diferencian fcilmente por la formacin de colonias amarillo verdosas rodeadas de una zona amarillo verdosa intensa.

AGAR MAC CONKEY Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia enterobacterias desarrollan en el mismo . En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla d e s a l e s biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin de las colonias y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa colonias incoloras. Las colonias sospechosas de Shigella en Agar MacConkey son incoloras y transparentes. En este medio las colonias de otros microorgani smos que fermentan la lactosa (coliformes) son colonias rojizas.

AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO XLD La presencia del desoxicolato de sodio es el agente que inhibe a los microorganismos Gram positivos. La xilosa es fermentada por casi todos los microorganismos entricos a excepcin de Shigella. La lactosa y la sacarosa inducen la produccin de cido por los coliformes. El tiosulfato de sodio y el citrato frrico de amonio constituyen el sistema indicador de la formacin de cido sulfhdrico produciendo un precipitado negro en el centro de las colonias.

Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter y algunas especies Proteus pueden utilizar ms de un carbohidrato y producen colonias amarillo brillante. El gnero Salmonella desarrolla colonias rojas con centro negro por la produccin de cido sulfhdrico. Shigella, Providencia, y algunas especies Proteus no utilizan ningn carbohidrato y desarrollan colonias traslucidas. Citrobacter desarrollas colonias amarillas con centro negro.

AGAR TRIPLE AZCAR DE HIERRO TSI Para diferenciacin de Enterobacterias basndose en las capacidad para utilizar la glucosa, lactosa y sacarosa los cual permite el reconocimiento y exclusin del genero Proteus. Se puede observar formacin de sulfuros. La fermentacin de la lactosa y sacarosa se observa en la superficie y de la glucosa en el fondo, con formacin de cido que se manifiesta por cambio de color del indicador Rojo de fenol que vira de anaranjado rojizo a amarillo. La combinacin del citrato frrico de amonio y tiosulfato de amonio permite la deteccin de sulfuro de hidrogeno por la formacin de un precipitado negro.

AGAR ALH AGAR HIERRO LISINA El AHL es muy til en el pesquisaje de Hafnia spp. y de ciertas cepas de E. coli, Proteus y Providencia. El AHL debe ser inoculado con un pinchazo en el tope y estriando la cua. Despus de la incubacin durante 1824 horas a 35C37C, los microorganismos que producen lisina descarboxilasa en el AHL causan una reaccin alcalina (de color prpura) en el tope del medio de cultivo y tambin en la cua (vase la Figura 41). Un ennegrecimiento del medio indica la produccin deH2S Los microorganismos que descarboxilan deficientemente la lisina producen una cua alcalina (prpura) y un tope cido (amarillo), no producen gas, ni H2S. Las especies de Proteus y Providencia con frecuencia producen una cua roja causada por la desanimacin de la lisina. El agar hierro lisina debe ser preparado de manera que los tubos tengan un tope profundo (aproximadamente de 3,5 cm). Las Shigella son lisina negativas y de manera caracterstica producen una cua alcalina (prpura), un tope cido (amarillo), no producen gas, ni H2S en AHL. Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, est dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.

Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito caldo (B02120-05).

Microorganismos Salmonella typhimurium ATCC 14028 Shigella flexneri Shigella sonnei Proteus mirabilis ATCC 43071 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Enterococcus faecalis ATCC 29212

Colonias Transparentes, centro negro Incoloras Incoloras Transparentes, centro negro Rosadas a rojas Rosadas cremosas y mucosas Incoloras, de muy escaso crecimiento

HIERRO DE KLIGLER Y AGAR HIERRO TRIPLE AZCAR Para obtener reacciones verdaderas en AHK, AHTA u otras pruebas bioqumicas, se debe usar un cultivo puro para inocular el medio. Seleccione cuidadosamente al menos una colonia bien aislada de cada tipo en cada tipo de placa de las que fueron estriadas para aislamiento (por ejemplo, si hay colonias sospechosas no fermentadoras de la lactosa que difieren en apariencia macroscpica, debe hacerse una prueba separada para cada una de ellas). Con una aguja de inoculacin toque ligeramente solo el centro de la colonia sin tocar el resto de la colonia ni la superficie de la placa porque si lo hace, puede tomar contaminantes que podran estar en la superficie del agar. Si tuviera dudas de que una colonia especfica est suficientemente aislada de las colonias que la rodean, purifique la colonia sospechosa estrindola en otra placa de agar; despus de lo cual se puede inocular la superficie inclinada (cuas) del AHK o de AHTA. En cada medio de prueba solo debe inocularse una colonia. Para inocular los tubos de AHK y AHTA se pincha el extremo (tope) y se estra la superficie de la cua. Despus de incubar por 18 a 24 horas a 35C37C, se debe observar la superficie inclinada del agar para ver las reacciones tpicas de Shigella. En la mayora de las pruebas bioqumicas se deben soltar las tapas de los tubos antes incubador. Esto es especialmente importante cuando se usa AHK y AHTA. Si las tapas estn muy apretadas y existen condiciones de anaerobiosis en el AHK o en el AHTA, las reacciones caractersticas de Shigella pueden no ocurrir y podra obtenerse un resultado errneo. Adems, los tubos de AHK y AHTA deben prepararse de manera que el tope sea profundo (aproximadamente 3,5 cm) y la cua larga (aproximadamente 2,5 cm). De manera caracterstica, la Shigella produce una cua alcalina (roja) y un fondo cido (amarillo); produce poco o nada de gas y no produce H2S .Solo unas pocas cepas de S. flexneri serotipo 6 y cepas muy raras de S. boydii producen gas en AHK o AHTA. 2. Por qu es importante detectar la presencia de salmonella y Shigella en los alimentos? Por que causan enfermedad en el ser humano por ejemplo. La Shigelosis es una enfermedad transmitida tanto por el agua como por los alimentos y es la causa ms comn de diarrea de origen bacteriano. Un factor importante es el rol de los

manipuladores de alimentos en la propagacin de la contaminacin mediante los malos hbitos higinicos. La principal va de transmisin fecal-oral es la forma ms comn de transmisin de este patgeno y una caracterstica importante es su rpida propagacin a travs de la poblacin, esto es debido a la baja dosis infectante (10 -200 microorganismos). Salmonella spp. perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, es uno de los principales microorganismos implicados en las enfermedades transmitidas por alimentos. La infeccin conocida como salmonelosis se puede manifestar como dos procesos patolgicos diferentes, la fiebre tifoidea o la gastroenteritis. 3. Indique las caractersticas generales de Salmonella y Shigella.

SALMOMELLA El gnero salmonella pertenece a la familia enterobacteriaceae. Siendo fiel as nombre, esta familia se compone de bacterias que se multiplican en el intestino, siendo varios los gneros de enterobacteriaceae que incluye especies patgenas. Adems de salmonella, tambin se trasmite por los alimentos, la salmonella est formado por bacteria gram negativa flageladas y forma bacilar .Las salmonellas son microorganismos anaerobios facultivos, presentando las dos rutas metablicas, la oxidativa y la fermentativa. Son oxidasa negativos, fermentan la glucosa generando acido y gas, cresen en citrato como nica fuente de energa, de carboxilan la lisina y la ornitina suele producir sulfuro de hidrogeno y no hidroliza la urea .Una de las caractersticas de este gnero es que la mayor parte de sus integrantes no pueden fermentar la lactosa ni la sacarosa. Hasta el momento se distinguen las siguientes especies: Salmonella bongori, Salmonella choleraesuis, Salmonella entrica, Salmonella enteritidis, Salmonella nyanza, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella virginia.

SHIGELLA Shigella es un gnero bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriacene, que se encuentra estrechamente relacionada con el gnero Escherichia, por sus propiedades bioqumicas, serolgicas y por similitudes genticas. Integrada por grmenes de forma bacilar, no esporulados, inmviles, pero animados de movimiento pendular. Son gram negativos, aerobios-anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos. Fermentan la glucosa sin produccin de gas; no obstante, debido a su afinidad con E.coli, se han encontrado biotopos que producen gas de la glucosa. No decarboxilan la lisina. Se caracteriza por no fermentar la lactosa, no produce lisina decarboxilasa y raramente produce gas a partir de hidratos de carbono.

No utilizan el citrato como nica fuente de carbono. No crecen en el medio cianuro potsico. Su actividad bioqumica es muy reducida. El gnero Shigella se divide en cuatro especies que pertenecen a subgrupos serolgicos distintos: Subgrupo A B kC D Especie Sh. dysenteriae Sh. flexneri Sh. boydii Sh. sonnei

4. Qu condiciones promueven el crecimiento de Salmonella y Shigella en alimentos y como se puede retardar su crecimiento? Cuando los microorganismos llegan a un alimento encuentran en l los nutrientes necesarios para su desarrollo. Pero es importante tener presente que, como seres vivos que son, necesitan tambin una temperatura apropiada y un tiempo para reproducirse. Temperatura y tiempo son dos factores esenciales que determinan el nmero de microorganismos que puede haber en un alimento. A una temperatura favorable un solo microorganismo se multiplica cada veinte minutos y, a las siete horas, se pueden haber producido millones. y se puede retardar su crecimiento con el correcto uso de los alimentos ante su preparacin.

5. Mencione 3 ejemplos diferentes de enfermedades causadas por la ingestin de alimentos contaminados por Enterobacterias. Shigelosis: Es una infeccin aguda del revestimiento del intestino. La shigelosis es causada por un grupo de bacterias llamadas Shigella. Existen varios tipos de Shigella:

La Shigella sonnei, tambin llamada Shigella del grupo D, es responsable de la mayora de los casos de shigelosis en los Estados Unidos. La Shigella flexneri, o Shigella del grupo B, causa casi todos los dems casos. La Shigella dysenteriae tipo 1 es rara en los EE. UU., pero puede llevar a brotes mortales en pases en desarrollo.

Las personas infectadas con la bacteria la excretan en sus heces. Las bacterias se pueden diseminar desde una persona infectada hasta contaminar el agua o los alimentos, o directamente a otra persona. Recibir tan slo un poquito de la bacteria Shigella en la boca es suficiente para causar sntomas. Los brotes de shigelosis estn asociados con condiciones sanitarias deficientes, agua y alimentos contaminados, al igual que condiciones de vida en hacinamiento. La shigelosis es

comn entre los viajeros a pases en desarrollo y obreros o residentes de campos de refugiados. La afeccin se observa ms comnmente en guarderas y lugares de vivienda en grupos. Los sntomas generalmente se desarrollan alrededor de 1 a 7 das (con un promedio de 3 das) despus de que uno est en contacto con la bacteria. Los sntomas abarcan:

Dolor abdominal agudo (sbito) o calambres Fiebre aguda (sbita) Sangre, moco o pus en las heces Dolor rectal con clico (tenesmo) Vmitos y nuseas Diarrea acuosa

Pruebas:

Deshidratacin con frecuencia cardaca rpida y presin arterial baja Sensibilidad abdominal Conteo de glbulos blancos elevado Coprocultivo Glbulos blancos en las heces

El objetivo del tratamiento es reponer los lquidos y electrlitos (sal y minerales) perdidos a causa de la diarrea. Por lo general, no se administran medicamentos para detener la diarrea, ya que pueden provocar que la infeccin tarde ms en desaparecer. Una de las medidas de cuidados personales para evitar la deshidratacin es tomar soluciones electrolticas para reponer los lquidos que se pierden debido a la diarrea. Ahora hay disponibilidad de diversas variedades de estas soluciones electrolticas sin necesidad de receta mdica. Los antibiticos pueden ayudar a acortar la duracin de la enfermedad y a impedir que se disemine hacia otras personas que viven en grupos o en guarderas. Tambin se pueden recetar para pacientes con sntomas graves. Los antibiticos de uso frecuente abarcan: sulfametoxazol y trimetoprima (Bactrim), ampicilina, ciprofloxacina (Cipro) o azitromicina. Si usted tiene diarrea y no puede tomar lquidos por va oral debido a las nuseas podran requerir atencin mdica y lquidos a travs de una vena (intravenosos). Esto es especialmente comn en nios pequeos. Es posible que las personas que toman diurticos necesiten suspenderlos si tienen un episodio agudo de enteritis por Shigella. Sin embargo, nunca deje de tomar ningn medicamento sin consultarlo primero con el mdico. Con frecuencia la infeccin es leve y desaparece espontneamente. El pronstico es excelente para la mayora de los pacientes, excepto en los nios desnutridos y con sistemas inmunitarios dbiles.

YERSINIOSIS La yersiniosis es una enfermedad bacteriana que generalmente afecta el tracto intestinal. Es una enfermedad relativamente rara y generalmente se presenta como un hecho individual aislado. Ha habido informes de brotes epidmicos ocasionales debidos a la exposicin comn. Los grmenes que causan la yersiniosis han estado presentes por muchos aos. Slo en aos recientes se ha reconocido que constituye una infeccin importante, aunque poco comn. Debido a que esta enfermedad no es habitual, muchos laboratorios no realizan en forma rutinaria las pruebas especficas para identificarla. Esta enfermedad puede ser contrada por cualquier persona, su

incidencia es mayor en nios. Se contagia a travs del consumo de alimentos o agua contaminados y por el contacto con personas o animales infectados. Sntomas Las personas infectadas pueden presentar diarrea leve o severa, fiebre y calambres abdominales. En algunas ocasiones, la infeccin por yersinia puede ser similar a la apendicitis, los sntomas aparecen entre tres y siete das despus de la exposicin. Se encuentra principalmente en los animales. Los desechos fecales de animales (sobre todo de los cerdos) pueden contaminar el agua, la leche y los alimentos, que se convierten en una fuente de infeccin para las personas y otros animales. El germen ha sido encontrado en intestinos de cerdo, leche cruda, lagos, arroyos, helados, leche de chocolate pasteurizada en forma incorrecta, tofu, mariscos, animales silvestres y domsticos. El germen se elimina en las heces durante el perodo en que la persona tiene diarrea y en algunos casos, durante unas pocas semanas o meses despus de la diarrea. Por esta razn, las personas infectadas deben ser muy cuidadosas y lavarse muy bien las manos despus de haber utilizado el bao. La mayora de los casos de yersiniosis sanan sin que sea necesario el tratamiento. Generalmente las personas que presentan sntomas graves o infeccin del torrente sanguneo deben ser tratadas con antibiticos. Evite beber leche cruda y agua superficial que no haya sido tratada en forma adecuada. Siga las precauciones adecuadas al manipular productos de carne a fin de evitar la contaminacin cruzada de carnes crudas a alimentos ya cocidos o listos para ser consumidos. Lave cuidadosamente las superficies de contacto de la comida y sus manos antes y despus de preparar los alimentos Gnero de bacterias que pertenece a la familia de las enterobactericeas. Son patgenos de animales, de donde pasan al ser humano produciendo enfermedades, siendo la ms destacada la peste. Las Yersinias son bacilos del tipo gramnegativos aerobios y anaerobios facultativos; son motiles a 22C, pero no a 37C, por flagelos anfitricos, o peritricos, forman pilis, y fimbrias. No forman cpsulas de gran espesor ni esporas. El gnero Yersinia incluye tres especies: Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis.

BOTULISMO: Es una enfermedad rara pero grave, causada por la bacteria Clostridium botulinum. Las bacterias pueden entrar al organismo a travs de heridas o pueden vivir en alimentos mal enlatados o mal conservados. El Clostridium botulinum se encuentra en los suelos y en las aguas impotables de todo el mundo. Produce esporas que sobreviven en los alimentos mal conservados o mal enlatados, donde generan la toxina. Al ingerirla, incluso cantidades pequesimas de esta toxina pueden provocar intoxicacin grave. Los alimentos que suelen contaminarse con mayor frecuencia son las verduras enlatadas en casa, carne de cerdo y jamn curados, el pescado crudo o ahumado y la miel o el jarabe de maz. El botulismo tambin ocurre si la bacteria penetra a travs de heridas abiertas y produce la toxina all. El botulismo infantil ocurre cuando el beb ingiere esporas y las bacterias se multiplican dentro de su tubo digestivo. Su causa ms comn la constituye la ingestin de miel o jarabe de maz. El Clostridium botulinum tambin se puede encontrar normalmente en las heces de algunos bebs. Los sntomas generalmente aparecen entre 8 y 36 horas despus de consumir los alimentos contaminados. No se presenta fiebre con esta infeccin. En los adultos, los sntomas pueden abarcar:

Clicos abdominales

Dificultad respiratoria que puede llevar a una insuficiencia respiratoria Dificultad al deglutir y al hablar Visin doble Nuseas Vmitos Debilidad con parlisis (igual en ambos lados del cuerpo)

Pruebas El mdico llevar a cabo un examen fsico. Puede haber signos de:

Ausencia o disminucin de los reflejos tendinosos profundos Ausencia o disminucin del reflejo nauseoso Prpado cado Prdida de la sensibilidad/actividad muscular Intestino paralizado Problemas del habla Retencin de orina con incapacidad para orinar

Se pueden llevar a cabo exmenes de sangre para identificar la toxina y tambin se puede ordenar un coprocultivo. Asimismo, se pueden hacer pruebas de laboratorio en los alimentos implicados para confirmar el botulismo. Tratamiento Recibir el medicamento para combatir la bacteria, llamado antitoxina botulnica, deber permanecer en el hospital si tiene dificultad respiratoria. Se puede introducir una sonda a travs de la nariz o la boca dentro de la trquea con el fin de suministrar una va area para el oxgeno. Asimismo, usted puede necesitar un respirador. Los pacientes que tengan dificultades para tragar pueden recibir lquidos intravenosos. Igualmente, se puede introducir una sonda de alimentacin. Los profesionales de la salud deben notificarle a las autoridades estatales de salud o a los Centros de Control y Prevencin de Enfermedades (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) respecto a los pacientes con botulismo, de tal manera que se puedan retirar los alimentos contaminados de las tiendas. A algunas personas les dan antibiticos, pero stos no siempre sirven. El tratamiento oportuno reduce significativamente los riesgos de muerte. Complicaciones

Infeccin y neumona por aspiracin Debilidad prolongada Problemas del sistema nervioso hasta por un ao Dificultad respiratoria