Tcnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) Mayo 20, 2009

Tcnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)

Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Laboratorio de Inmunologa L-121, Campus I Prez Prez Jos Manuel1 ____________ Prez Sevilla Alma Beatriz2 ____________ Equipo 3, Grupo 2802

Introduccin:
La tcnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) es un procedimiento de ensayo inmunoenzimtico. Se basa en la deteccin antgeno (Ag) o anticuerpo (Ac), inmovilizado sobre una fase slida y mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reaccin, la prueba recurre al empleo de inmungenos, haptenos anticuerpos marcados con una enzima cuyo producto colorido, puede ser medido espectrofotomtricamente. Este principio tiene las propiedades de un inmunoensayo ideal: es verstil, robusto, simple en su realizacin, emplea reactivos econmicos y consigue, mediante el uso de la fase slida, de una separacin fcil entre la fraccin retenida y la fraccin libre. Las enzimas utilizadas se muestran en el cuadro 1.
Cuadro 1 Cromogenos utilizados para las enzimas fosfatasa alcalina y Peroxidasa y el color que se obtiene Enzima Cromogeno Color Fosfatasa p-nitrofenil fosfato (pNPP) amarillo Alcalina 5-bromo-4-cloro-3indolil fosfato/nitro Purpura azul de tetrazolium (BCIP/NBT) Naftol AS-TR fosfato/fast red RC Rojo Peroxidasa 2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6 verde acido sulfonico o-fenilamino (OPD) Naranja 3,35,5-tetrametilbencidina base o Azul dihidrocloruro (TMB) 3,3-deaminobencidina (DAB) Marrn 3-amino-9-etilcabazole (AEC) Rojo 4-cloro-1-naftol (4C1N) Azul

Fases de realizacin de una ELISA Sensibilizacin de la placa. Bloqueo de espacios vacos. El Ag o el Ac se fija a una superficie. Aplicacin del espcimen de prueba. Controles positivo y negativo Deteccin y caracterizacin por Ac. 2 marcado. Incubacin con la muestra. Incubacin con el sistema de deteccin. Adicin del sustrato. Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacin: Anticuerpos Marcados ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA Sandwich o Doble (DAS) o Heterologo (HADAS) Antgenos Marcados ELISA Competitivo ELISA Directo. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado

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Elaboro,

Reviso,

Tcnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) Mayo 20, 2009 para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Sndwich Sandwich). DAS (Double Antibody capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Sndwich HADAS. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado. Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Competitivo. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de

Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea
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Elaboro,

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Tcnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) Mayo 20, 2009 ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema en la muestra. Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos: ELISAs para detectar antgenos: ELISAs sndwich. ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos. La fase slida debe ser de un tipo que permita un fcil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unin de antgenos o anticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350L son especialmente ventajosas para procesar un elevado nmero de muestras y un vez tapizadas, el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estriles y con o sin tapa. Las tcnicas de ELISA se realizan mediante la adicin secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado. Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacin de todas y cada una de las etapas. Esta completa automatizacin se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nmero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados. La enzima escogida como marcador debe unirse fcilmente a antgenos y anticuerpos, encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromognico o fluorognico conveniente y de fcil preparacin. Las enzimas ms utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa de rbano y -galactosidasa; a continuacin se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una as como los substratos que se emplean con cada una de ellas. La bsqueda de la concentracin ptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado;
1.

para cualquier ELISA que utilice anti-anticuerpos conjugados, se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antgeno a concentracin idne a. Aquella dilucin del conjugado que produzca menor reaccin inespecfica (menor color de fondo o background) con muestras negativas e implique una clara distincin de las muestras positivas, ser la ptima. La eleccin de una concentracin de conjugado ptima va completamente ligada a planteamientos econmicos en los que se ha de procurar el mayor aho rro del conjugado an a costa de aumentar el tapizado. La eleccin del substrato es de gran importancia para la estandarizacin del mtodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, repetibilidad, facilidad de lectura y complejidad de preparacin, as como estabilidad despus de la parada de la reaccin. Hoy en da existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y, por lo tanto, el mtodo de deteccin de los complejos antgeno-anticuerpo como los sistemas de deteccin colorimtricos, fluorescentes y luminiscentes. Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico clnico, deteccin viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.

Objetivo:
Cuantificar el contenido de antgeno (gammaglobulina humana) y la dilucin del conjugado del Anticuerpo (antigammaglobulina) para sta tcnica. Conocer el fundamento y las fases en la realizacin de la tcnica de ELISA, y cules son las variantes de este mtodo.

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Diagrama de Flujo:
Diluir la solucin de gammaglobulinas

Resultados:
Para la tabla de resultados referirse al anexo 1, pgina 5, y la grafica en el anexo 2, pgina 6. La lectura de la placa de ELISA fue llevado acabo a 490 nm. En la tcnica de ELISA que se realizo fue estandarizada para la cantidad de 16g/mL de antgeno (gammaglobulina humana) en una dilucin del anticuerpo conjugado a 1:20000, debido a que al interpolar en la grafica 1, anexo 2, pgina 6, se obtuvo un valor de 4.3 obteniendo por anti-logaritmo el valor de 19952, debido a las complicaciones para llevar acabo una dilucin precisa y por su cercana se redondea el valor a 20000.

Rotular tubos del 1 al 7 del A al G Colocar en 6 tubos solucin de IgG acepto el A Colocar un testigo negativo en la lgG terminando en la A Colocarlos en una cmara hmeda 18hr 4C

Eliminar el sobrenadante durante 30m

Anlisis de Resultados:
Con base en los resultados obtenidos la cantidad de antgeno requerido en el ensayo por medio de ELISA es de 16g/mL de gammaglobulina con una dilucin de anticuerpo (anti-gammaglobulina) a 1:20000 para obtener una lectura adecuada ya que fue la ms alta. Aunque se observa en la tabla 1 y grafico 1 del anexo 1 y 2 respectivamente valores por encima, al obtener la pendiente el pocillo con la letra D con una concentracin de 16g/mL fue la que se obtuvo mejor lectura, evitando as otros valores que se pueden deber a la prozona y postzona. Son los factores que afectan la medida de la actividad enzimtica (temperatura, pH, fuerza inica, composicin del tampn, reduccin del substrato, desnaturalizacin de la enzima y algunos casos, exposicin a la luz), tambin el desarrollo de las diluciones que son los que ms afectan al ensayo adems de la experiencia del analista, hoy en da, son el tiempo de reaccin, la temperatura y la exposicin a la luz, los cuales al realizar de manera manual se eleva el error. Cabe sealar que ste tipo de estudios se realizan para estandarizar un mtodo de ELISA para un antgeno deseado. En sta prctica se realizo de manera demostrativa como se realiza la tcnica de ELISA

Lavar con PBS Tween 4 veces y reposar 1 min

Etiquetar 11 tubos y colocarle el conjugado Colocar regresivamente un testigo conjugado e inc a 37c 1hr

Lavar con PBS tween.

Adicionar sustrato con el cromgeno Incubar 15 min a 37C

Leer a 490 nm en lector de ELISA.

1.

Elaboro,

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Tcnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) Mayo 20, 2009 desde el pegado de antgeno a la placa, las diluciones del mismo, as como la dilucin del anticuerpo antigammaglobulina. Una vez estandarizo el mtodo se realizan los estudios de corte para saber que paciente presentan alguna enfermedad con base en un estudio estadstico al 95% de confianza, y obtener de los lmites de referencia establecidos en el estudio para pacientes que presentan enfermedad a partir del resultado obtenido y que pacientes se descartan, con esto tener la normatividad del laboratorio.

Conclusin:
Con base en el anlisis de resultados a se cuantifico la cantidad de antgeno de gammaglobulina humana obteniendo 16g/mL para la deteccin por ELISA en sta tcnica con una dilucin de anticuerpo de 1:20000. En sta prctica se conoci los fundamentos y la realizacin de la tcnica de ELISA, as mismo los factores que afectaron durante el experimento, en ste caso las diluciones, tiempo de incubacin.

Referencias:
Hudson L. C. Hay F. Inmunologa prctica. Espaa: Ed. Jims, 1979: Roitt I, et al. Inmunologa. 5 edicin. Espaa: Harcourt, 2000: Anbal Margni R. Inmunologa e inmunoqumica fundamentos. Argentina: Ed. Panamericana, 1996:

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ANEXO 1: Tabla 1, Absorbancia y dilucin de la placa de ELISA

WL= 450 nm Antigeno (g/mL) 128 64 32 16 8 4 2 1

log Dilucin pozo 1A 1B 1C 1D 1E 1F 1G 1H

2.70 3.00 3.30 3.60 3.90 4.20 4.51 4.81 5.11 5.41 5.71 Control 1:500 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000 1:32000 1:64000 1:128000 1:250000 1:512000 Negativo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3.333 2.623 2.861 1.967 1.131 0.684 0.448 0.212 0.157 0.041 0.02 0.045 3.333 3.333 3.239 2.147 1.267 0.713 0.574 0.443 0.327 0.249 0.181 0.001 3.333 3.333 3.333 1.913 1.525 0.729 0.521 0.388 0.191 0.073 0.19 0.039 3.333 3.333 1.538 2.33 1.514 0.99 0.765 0.485 0.422 0.278 0.316 0.01 3.332 3.332 3.332 1.943 1.124 0.762 0.49 0.312 0.214 0.078 0.133 0.056 3.332 3.332 2.845 1.791 1.188 0.782 0.561 0.556 0.353 0.328 0.267 0.001 3.332 3.332 2.757 1.882 1.102 0.735 0.456 0.277 0.212 0.036 0.019 0.027 1.585 1.003 1.069 0.619 0.205 0.468 0.37 0.177 0.2 0.155 0.164 0.049

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Elaboro,

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ANEXO 2: Grafico 1

Grafico 1. Curva de calibracin de absorbancia contra logaritmo de la dilucin para la concentracin optima del antigeno y dilucin detectable para ELISA
3.76
3.51 3.26 3.01 2.76 2.51 2.26 Absorbancia 2.01 1.76 1.51 1.26 1.01 0.76 0.51 0.26 0.01 2.60 2.75 2.90 3.05 3.20 3.35 3.50 3.65 3.80 3.95 4.10 4.25 4.40 4.55 4.70 4.85 5.00 5.15 5.30 5.45 5.60 5.75 5.90 6.05 6.20 Log de dilucin
1.

Pocillo de la placa de

A B C D E F G

H
Lineal (D) Lineal (E)

Elaboro,

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