IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS

Martha Murcia Aranguren INTRODUCCIN Las pruebas bioqumicas se basan en la determinacin de la presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas por el material gentico del cromosoma bacteriano. Estas enzimas (catalasas, coagulasas, decarboxilasas, deaminasas, ureasas, peroxidasas, etc) involucradas en el metabolismo bacteriano, pueden ser evidenciadas en medios de cultivo especiales que contienen los substratos (DNA, hidratos de carbono, aminocidos, etc) sobre los cuales ellas actan, junto con un sistema indicador que va a poner de manifiesto la degradacin del substrato o la presencia de un metabolito especfico (cido frmico, cido lctico, cido succnico, indol, etc). Las pruebas bioqumicas tambin evalan: la capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a frrico), la presencia o ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la produccin o no de hemolisinas, el requerimiento o no de algunos factores especiales (protenas sricas), la produccin o no de algunas toxinas con capacidad virulenta (toxina diftrica, toxina botulnica, etc). IMPORTANCIA CLINICA Cuando se han aislado las bacterias causantes de un proceso infeccioso, stas deben ser identificadas hasta llegar a GENERO Y ESPECIE, para lograrlo se debe evaluar su actividad bioqumica o metablica. Del microorganismo aislado depender el tipo de tratamiento que debe ser administrado al paciente. Las enterobacterias son las responsables del 50% de todos los aislamientos clnicamente significativos, producen el 50% de los casos de septicemia, del 60 al 70% de la enteritis bacterianas, el 90% de las infecciones urinarias. Son causa importante de infeccin nosocomial.

OBJETIVOS 1. Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioqumicas tiles en la identificacin de bacterias bacilares Gram negativas. 2. Determinar gnero y especie de la cepa problema.

MATERIALES Cepas bacterianas: cepas de bactrias bacilares Gram negativas Mdios de cultivo: Agar TSI (triple azcar hierro), agar LIA (lisina, hierro, agar) agar UREA, agar CITRATO DE SIMMONS, caldo MR (rojo metilo), caldo VP (voges proskauer), caldo FENIL ALANINA-malonato, medio SIM (sulfuro, indol, movilidad), medio OF GLUCOSA (oxidacin, fermetacin).

Otros: reactivo de oxidasa (dimetil para fenilne diamina o tetrametil para feniline diamina), aceite mineral, rojo de metilo, reactivo de Erlich, KOH 40%, alfa naftol 5%, cloruro frrico 10%.

MTODOS Sembrar la cepa problema en toda la batera disponible de acuerdo a la siguiente instruccin: central hasta el fondo del

1- AGAR TSI: siembre el agar TSI haciendo una puncin tubo y estra en superficie.

Principio: en TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos de carbono GLUCOSA, LACTOSA y/o SACAROSA, con produccin o no de gases (CO2 y H2), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H2S). Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Se lee un quebrado, la reaccin ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reaccin ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia) La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color rojo) Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas: Fermentacin de la glucosa (K/A). Fermentacin de glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A) No fermentacin de los carbohidratos (K/K), la bacteria no utiliza los hidratos de carbono, produciendo aminas que alcalinizan el fondo y la superficie del medio. Algunas bacterias no fermentadoras solamente atacan la peptona aerbicamente dando un TSI: K/N, es decir no hay cambio en el fondo del tubo. Produccin de gas: ruptura del medio. Produccin de H2S:ennegrecimiento del medio LECTURAS AGAR TSI

A/A K/A K/K A/A K/A

El agar TSI tiene tres azcares: glucosa (1 g/L), lactosa (10 g/L) y sacarosa (10 g/L). Como indicador de PH tiene ROJO DE FENOL el cual vira al color amarillo en presencia de acidez y al color rojo en presencia de alcalinidad. Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para que las bacterias puedan producir H2S y como indicador de H2S, SULFATO FERROSO el cual reacciona con el H2S produciendo un precitado negro e insoluble de sulfato ferroso. Para que se produzca H2S, se requiere de un medio cido por lo que dicha produccin generalmente est limitada al fondo del medio, razn por la cual un fondo negro debe leerse como A (cido), aunque el color amarillo usual est tapado por el color negro (Tabla 1). 2- AGAR LIA: Sembrar con asa recta, por doble picadura hasta el fondo del tubo y en superficie. Principio: en agar LIA se determina la capacidad de un microorganismo para atacar el aminocido LISINA descarboxilndolo o desaminndolo, la fermentacin de glucosa, la produccin o no de gases (CO2), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H2S). Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas si es necesario) a 37C. Se lee un quebrado, la reaccin ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reaccin ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia). La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color prpura). Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas: a- Fermentacin de la glucosa (K/A), la bacteria no ataca el aminocido solo fermenta la glucosa. b- Descarboxilacin de la lisina: (K/K) c- Desaminacin de la lisina: R/A) rojo/ amarillo d- Produccin de gas: ruptura del medio e- Produccin de H2S: ennegrecimiento del medio LECTURAS AGAR LIA

R/A K/K K/K K/A

El indicador del PH del medio es PRPURA DE BROMOCRESOL, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color prpura. Por contener pequea cantidad de Glucosa (1 g/ L) al ser fermentada al fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina.

Muchas bacterias poseen descarboxilasas que atacan el aminocido lisina, con liberacin de aminas de reaccin alcalina y con produccin de CO2. Para que acten las descarboxilasas se requiere PH cido que se obtiene por la fermentacin de la glucosa que tiene el medio. La desaminacin de la lisina es un proceso oxidativo que se manifiesta por la aparicin de color rojo en el tendido, siendo el fondo del tubo amarillo por fermentacin de la glucosa que posee el medio. Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para las bacterias puedan producir H2S y como indicador H2S, CITRATO FERRICO DE AMONIO el cual reacciona con el H2S produciendo un precipitado negro e insoluble de sulfato ferroso. Para que se produzca H2S se requiere de un medio cido por lo que dicha produccin generalmente est limitada al fondo del medio, razn por la cual un fondo negro debe leerse como A (cido), aunque el color amarillo usual est tapado por color negro. (Tabla 2). 3- AGAR CITRATO DE SIMMONS: sembrar con asa recta, solamente en superficie. Principio: en agar CITRATO DE SIMNONS se determina la capacidad de un microorganismo de emplear el citrato como nica fuente de carbono en ausencia de fermentacin de azcares o de produccin de cido lctico. Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas s es necesario) a 37C. Fundamento: Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El medio utilizado contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo capaz de utilizar el citrato como nica fuente de cabono tambin es capaz de utilizar las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NH ) con la consiguiente alcalinidad del medio. El indicador de PH es el AZUL DE BROMOTIMOL el cual en presencia de alcalinidad vira al color azul indicando que la prueba es POSITIVA. Cuando no hay cambio de color ni crecimiento se dice que la prueba es NEGATIVA. Si no hay cambio de color, pero s hay crecimiento la prueba es DUDOSA.

LECTURAS AGAR CITRATO

+d -

4- AGAR UREA: Sembrar con asa recta, solamente en superficie. Principio: en agar UREA se determina la capacidad de un microorganismo de producir UREASA y desdoblar la urea, formando 2 molculas de amoniaco.

Lectura. Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Fundamento: El sustrato urea es una diamina del cido carbnico, denominada carbamida. Todas las amidas (RCO- NH2) son rpidamente hidrolizadas. La hidrlisis de la urea es catalizada por una enzima especfica que es la ureasa es una enzima microbiana importante, relacionada con la descomposicin de los compuestos orgnicos. Las enzimas bacterianas se clasifican en adaptativas o constitutivas. Una enzima adaptativa o inducida es aquella que es producida por una bacteria solamente cuando se encuentra presente su sustrato especfico. La ureasa es una enzima constitutiva ya que la sintetizan ciertas bacterias sin tener en cuenta si hay o no el sustrato urea. El indicador de PH es rojo de fenol, el cual en alcalinidad vira a un color violeta indicando una prueba POSITIVA. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA. LECTURAS AGAR REA

+d -

5- AGAR SIM: sembrar con asa recta, por picadura central hasta la mitad del tubo. Principio: EN AGAR SIM se determina la capacidad e un microorganismo de moverse (presencia e flagelos), de producir INDOL y H2S. Lectura: Se efecta de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Agregar 10 gotas de reactivo de ERLICH. Fundamento: el INDOL es uno de los productos del metabolismo del aminodico TRIPTOFANO. Las bacterias que poseen la enzima TRIPTOFANASA son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amoniaco. El indol se puede detectar en un medio adecuado observando el desarrollo de un color rojo despus de agregar el reactivo de Erlich o de Kovacs indicando una prueba POSITIVA, debido a que el indol reacciona con el grupo aldehdo del p- dimetilaminobenzaldehido. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA. EL SIM es un medio semislido sin hidratos de carbono que inhiban la produccin de H2S y tiene TIOSULFATO DE SODIO fuente de azufre y HIERRO PEPTONADO como indicador de H S, lo que lo hace ms sensible en la deteccin de H2S por produccin de un precipitado negro de sulfuro ferroso. La MOVILIDAD BACTERIANA es otra caracterstica importante en la identificacin final de especie, se realiza en medios semislidos como el SIM, debindose leer antes que la prueba de indol porque al agregar el reactivo de Erlich sta se puede enmascarar. La prueba de motilidad se interpreta realizando un cuidadoso examen macroscpico del medio para observar una zona de desarrollo difuso que parte de la lnea de inoculacin.

LECTURAS AGAR SIM

I: + I: - I: - I: + I: M:+ M:+ M: - M:+ M:+ H2S:-H2S:+H2S:-H2S:+H2S:-

6- CALDOS MR-VP: sembrar en cada caldo con asa recta. Principio: En el caldo MRVP se determina por qu va metablica fermenta la glucosa la bacteria. Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Agregar 10 gotas de ROJO DE METILO al tubo MR, la aparicin inmediata de un color rojo indica que la prueba es positiva para MR, la aparicin de un color amarillo indica que la prueba es NEGATIVA. Al tubo VP agregar 10 gotas de KOH al 40% y 5 gotas de ALFA NAFTOL al 5%, mezclar fuerte despus de la adicin de cada reactivo, esperar 15 minutos y leer, la aparicin de un color rojo indica una prueba de VP POSITIVA, la aparicin de un color amarillo o caf indica una prueba de VP NEGATIVA. Fundamento: La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA ACIDA MIXTA con produccin de metabolitos como cido lctico, frmico y succnico, los cuales van a hacer descender el pH inicial del medio de 6.9 a 4.2, lo cual se visualiza al agregar el indicador de pH ROJO DE METILO, el cual a pH cido vira a un color rojo. La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA BUTILEN GLICOLICA con produccin de productos neutros como el ACETIL METIL CARBINOL (ACETOINA), el 2,3 BUTILEN GLICOL y el DIACETIL. El producto final ms frecuente es el 2,3 BUTILEN GLICOL, que es fcilmente oxidado a ACETIL METIL CARBINOL y luego a DI-ACETIL. El VP realmente es una bsqueda de DI- ACETIL. El VP realmente es una bsqueda de DI-ACETIL, ya que las condiciones de la prueba convierten fcilmente los otros dos componentes en diacetil. Las 3 sustancias son neutras con el resultado de que PH del medio no baja sensiblemente y por lo tanto la bacteria es MR negativa y VP positiva. La bioqumica de la fermentacin de la glucosa hace muy poco probable encontrar cultivos MR y VP positivos. Lo s es ms probable es encontrar las 2 pruebas negativas en el caso de bacterias no fermentadoras.

LECTURAS CALDO MR-VP LECTURAS

MR

VP

SR

7- CALDO FENIL ALANINA- MALONATO: Sembrar con asa recta. Principio: En el caldo FENIL ALAININA MALONATO se determina la capacidad que tiene una bacteria de desaminar la FENILALANINA y de utilizar el MALOTO como nica fuente de carbono. Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Primero se lee la prueba de malonato si cambia al color azul indica que la PRUEBA es POSITIVA, si continua de color verde la PRUEBA es NEGATIVA. Para leer la prueba de la FENIL ALANINA agregar 10 g0tas de CLORURO FERRICO al 10%, MEZCLAR FUERTE. La aparicin de un color verde oscuro indica que la prueba es FENIL ALANINA POSITIVA. Si el color es amarillo castao la PRUEBA es NEGATIVA. Fundamento: la bacteria puede utilizar el MALONATO de SODIO como nica fuente de carbono con la consiguiente alcalinidad del medio. El indicador de PH es AZUL DE BROMOTIMOL que en alcalinidad vira al color azul. Algunas bacterias tienen la capacidad de desaminar la FENIL ALANINA produciendo ACIDO FENIL PIRUVICO por su actividad enzimtica, con la consiguiente acidez resultante. Este cido se visualiza al agregar el cloruro frrico. 8- MEDIO OF GLUCOSA (OXIDACIN FERMENTACIN de HUGH Y LEIFSON) : sembrar por duplicado con asa recta POR PICADURA CENRAL. A uno de los dos tubos agregar 1 ml de aceite mineral estril. Principio: Determinar si una bacteria presenta metabolismo FERMENTATIVO u OXIDATIVO de un hidrato de carbono. Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Fundamento: Algunas bacterias pueden metabolizar un hidrato de carbono (produccin de cido) solo en condiciones aerbicas, mientras que otras producen cido aerbica y anaerbicamente.

La FERMENTACIN es un proceso ANAERBICO que requiere la fosforilacin inicial de la glucosa previa a su degradacin, mientras que la OXIDACIN en ausencia de compuestos inorgnicos como nitrato y sulfatos es un proceso estrictamente AEROBIO, que comprende la oxidacin directa de una molcula de glucosa no fosforilada (inicialmente). La fermentacin produce una acidez ms elevada que la producida por la oxidacin. El medio OF contiene una elevada concentracin de hidrato de carbono, con una baja concentracin de peptona, para obviar la posibilidad de que un organismo aerbico utilice la peptona, produciendo as una condicin alcalina que neutraliza la ms ligera acidez producida por una bacteria oxidativa. La baja concentracin de agar permite observar la movilidad del microorganismo, adems de la capacidad oxidativa o fermentativa, ya que permite la difusin por todo el tubo de la acidez. El indicador de PH es el AZUL DE BROMOTIMOL el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color azul. Cuando la bacteria es fermentadora los 2 tubos el tapado (tubo con aceite mineral) y el destapado van a presentar color amarillo). Cuando la bacteria es oxidadora el tubo tapado permanece de color verde y la superficie del medio destapado vira al color amarillo. Si la bacteria es NO SACAROLITICA (ni oxida ni fermenta) los dos tubos son de color verde, aunque el tubo destapado en una superficie puede presentar un color azul por degradacin de peptonas producindose aminas. 9- GLUCOSA, LACTOSA y SACAROSA: sembrar cada tubo de hidrato de carbono con asa recta. Principio: Determinar si una bacteria FERMENTA o no stos hidratos de carbono. Con o sin produccin de gas. Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Se debe observar cuidadosamente la campana de fermentacin o campana de DURHAM, para precisar si hay o no produccin de gas por desplazamiento de lquido de la campana. Fundamento: algunas bacterias pueden metabolizar (fermentar) diversos hidratos de carbono con produccin de cido, anaerbicamente. El indicador de PH es el ROJO DE FENOL que en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color rojo. 10- PRUEBA DE OXIDASA: coloque sobre las colonias 5 gotas de reactivo de OXIDASA. Observe la reaccin. Principio: determinar la presencia de las enzimas OXIDADAS. Lectura: se efecta despus de 10 a 15 SEGUNDOS despus de agregado el reactivo. Fundamento: la prueba de la oxidasa est basada en la produccin bacteriana de una enzima OXIDASA. Esta reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema CITOCROMOOXIDASA que activa la oxidacin del citocromo reducido por el oxgeno

molecular, el que a su vez acta como aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema de transferencia de electrones. Todas las bacterias aerbicas obtienen su energa por la respiracin, proceso responsable de la oxidacin de algunos sustratos . El oxgeno molecular oxida un sustrato con la intervencin del sistema de transporte de electrones. El oxgeno es el aceptor de hidrgeno final, produciendo a partir del H agua o perxido de hidrgeno, segn la especie bacteriana y su sistema enzimtico. El sistema citocromo slo se encuentra por lo general en los aerobios, lo que los hace capaces de utilizar el 02 como un aceptor de H2 final para reducir el O2 molecular en H202, el ltimo enlace de la cadena de la respiracin aerbica. Los diversos colorantes para la prueba de oxidasa son aceptores de electrones artificiales. La aparicin de un color violeta a negro indica la POSITIVIDAD de la prueba. Compare sus resultados con los de sus compaeros, observe las diferentes lecturas en cada uno de los medios de identificacin. 11Identificacin del microorganismo: identifique el microorganismo que le correspondi con la ayuda de la tabla.

BIBLIOGRAFIA

Koneman Elmer W. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology. 5. Edicin, Washington Square: Lippincott Raven Publishers, 1997: 173- 203 Mac Faddin J. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Panamericana , 1980 Koneman Elmer W. Enterobacteriaceae en Diagnstico Microbiolgico. Panamerica , 1.983: 152 185

Tabla 1 REACCIONES DE ENTEROBACTERIAS EN TSI GENERO Y ESPECIE Escherichia Shigella S. typhi Otras salmonellassi Arizona Citrobacter Edwardsiella Klebsiella Enterobacter Hafnia Serratia P. vulgaris P. mitbilis Morganella Providencia Yersinia. Pestis Y, pseudotuberculosis Erwinia Pectobacterium K= TENDIDO A (K) K K K K (A) K (A) K A A KoA KoA A (K) K (A) K K K K (A) A A (K) FONDO A A A A A A A A A A A A A A A A A A A GAS + (-) + + + + ++ ++ -0 + + + - (+) +0- (+) H2S + (-) +++ (-) +++ +++ +++ +++ -

Alcalinidad . A= Acidez ( ) = Reacciones ocasionales

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Tabla 2 REACCIONES DE ENTEROBACTERIAS EN LIA GENERO Y ESPECIE Escherichia Shigella Salmonella S. typhi S. paratyphi Arizona Citrobacter Edwardsiella Klebsiella Enterobacter cloacae Enterobacter aergenes Hafnia Serratia P. vulgaris P. mitbilis Morganella Providencia Yersinia Erwinia Pectobacterium TENDIDO K K K K K K K K KoN KoN K K KoN R R KoR R K K K FONDO KoN A KoN K A KoN A K KoN A KoN KoN KoN A A A A A A A GAS -O +) +o_ -o+ -o+ +o+o+(-) _ _ H S + (-) + o- o+ + (-) +o+ - (+) - (+) _ _

K= Alcalinidad A = Acidez ( ) = Reacciones ocasionales R = Deaminacin oxidative N = Neutro

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