Universidad de Guanajuato

División de Ciencias Naturales y Exactas

Laboratorio de Microbiología

Reporte de Práctica 3: Aislamiento y conservación de bacterias y hongos.

Metodología:
Parte I: Morfología colonial y crecimiento
Partiendo de los cultivos que ya se tenían de la actividad anterior se escogieron 4 de los cuales
3 se iban a inocular en una caja Petri para tener una reserva y seguir trabajando en las
prácticas posteriores. De las colonias escogidas se inocularon en Agar nutritivo, en Agar
Czapek y en caldo nutritivo, para analizar la morfología y si había cambios con respecto al
primer cultivo con el resembrado.
Todo esto se reportó en las tablas de resultados
Parte II: Aislamiento de bacterias anaerobias
[11:18, 10/9/2019] IBM: se tomó una pequeña porción de las heces fecales de pájaro y se
diluye con agua destilada 4 veces
de las diluciones 2 3 y 4 se inocularon en tubos de ensaye con Agar leche fierro en el cual se
compone de leche y un clavo en oxidación y después de inoculado se añadió punto 5 ML de
aceite mineral esto para evitar el paso del oxígeno de la atmósfera al medio de cultivo y
generando la anaerobiosis. se dejan inocular por 24 horas.se analizaron los cambios y se
realizaron los cálculos del número probable de unidades formadoras de colonias de acuerdo
a la cantidad de tubos con leche cortada.
Posteriormente se hicieron inoculaciones de la dilución 2 de heces fecales en cajas Petri 1
con Tioglicolato (mide el potencial redox) y otra con Agar sangre. Estas cajas se dividieron
a la mitad y en una mitad se inoculó de la dilución y la otra mitad se inoculó con la misma
dilución pero después de un calentamiento a 65 grados por 10 minutos y se metieron a una
cámara de anaerobiosis (con Becton Dickinson BD gas pack).
Se puso infusión de cerebro y corazón BHI en otros tres tubos se puso agar nutritivo y en
otros tres tubos agar de Tioglicolato en los cuales se realizaron inoculaciones de Clostridium
spp, Escheriquia coli y Bacillus subtilis respectivamente (cada microorganismo en los tres
medios distintos).
Se dejó inocular por 24 horas para ver el crecimiento y discriminar si eran aerobios
facultativos o anaerobios según la altura en el medio a la que crecieran.

Resultados:
Parte I

Se muestra en la Tabla I la descripción de la morfología colonial de las 3 colonias

seleccionadas:

o Colonia 1: Colonia seleccionada de la placa de agar nutritivo donde se sembró una

muestra de la dilución número 5 de Yakult en la práctica anterior.
o Colonia 2: Colonia de la placa de agar nutritivo donde se sembró una muestra de la
dilución número 10 de Yakult.
o Colonia 3: Colonia de la placa de harina de soya donde se sembró una muestra de la
dilución número 3 de tierra.

Tabla I: Descripción de la morfología colonial de bacterias

Característica Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3
Color Blanco Amarillo claro Blanco
Forma Redonda Redonda Ameboide
Elevación Convexa plana Elevada Convexa plana
Superficie Lisa Lisa Lisa
Aspecto Seco Seco Húmedo
Borde Suave Suave Ondulado
Luz transmitida Translúcida Opaca Translúcida
Luz reflejada Mate Mate Brillante
Consistencia Suave Suave Mucosa
Pigmento No presenta No presenta No presenta

Figura I: Placa de agar Figura II: Placa de agar Figura III: Placa de harina
nutritivo con dilución 5 nutritivo con dilución 10 de soya de dilución 3 de
Yakult. Yakult. tierra. Se resalta la colonia
seleccionada para este
análisis.
En la Tabla II se describe el crecimiento en medios de cultivo a las 72 horas, de cada una de
las tres colonias anteriores, aisladas en tres medios de cultivo diferentes: caldo nutritivo, agar
nutritivo inclinado y en una placa petri de triple compartimiento de agar nutritivo.

3 2 1

Figura V: Crecimiento de
las colonias en agar
inclinado
Tabla II: Crecimiento en medios de cultivo
Medio Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3
Blanco al fondo del Blanco al fondo del Blanco al fondo del
Caldo nutritivo
tubo tubo tubo
Agar nutritivo
Difuso Filiforme Difuso
inclinado
Placa agar nutritivo Poco crecimiento Gran crecimiento Gran crecimiento
3 2

3 2 1
1
Figura IV: Crecimiento de
las colonias en caldo Figura VI: Crecimiento de
nutritivo las colonias en placa de agar
nutritivo.
En la Tabla III se describe el crecimiento de actinomicetos en agar Czapeck. Las colonias
fueron seleccionadas de las tres colonias que se muestran en la placa de Figura VII,
perteneciente a la siembra realizada con la dilución numero 3 de la tierra.

1 Figura VII: Placa de harina de soya con

dilución 3 de tierra. Se resaltan las colonias que
se utilizaron para este análisis.

Tabla III: Crecimiento de actinomicetos en agar Czapeck

Característica Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3
Color Rosa Blanco Blanco turbio
Redonda con bordes Redonda con borde Redonda con bordes
Forma
irregulares regular radiales
Elevación Elevada Elevada Convexa rugosa
Superficie Rugosa Rugosa Rugosa
Aspecto Seco Seco Seco
Borde Ondulado Suave Lobulado
Luz transmitida
Luz reflejada Mate Mate Mate
Consistencia Butirosa Dura Suave
Pigmento No presenta No presenta No presenta

1 2 3
En la Tabla VI se describe el crecimiento en agar Czapek de las colonias mencionadas
anteriormente.

Tabla IV: Crecimiento en agar Czapek

Medio Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3
Czapek Filiforme Difuso Difuso

1 2 3

Figura VIII: Agar Czapek con

crecimiento de actinomicetos.

Parte II

Cultivo en jarra de anaerobiosis con agar Tioglicolato y agar sangre: Se muestran en la Figura
IX y X las placas de agar Tioglicolato y agar sangre, respectivamente, sembradas con la
dilución número 1 de la muestra de materia fecal antes y después de ser calentada en baño de
agua.

Se observó que en agar Tioglicolato que hay un crecimiento de colonias pequeñas blancas,

2
1 2

Figura XI: Agar tioglicolato con materia Figura X: con materia fecal: Agar sangre
fecal: 1) antes de baño de agua 2) después 1) antes de baño de agua 2) después de
de baño de agua baño de agua
redondas, con borde suave, convexas un aspecto húmedo y opacas. En ambos lados de la
placa. Es decir, antes de después del calentamiento en baño de agua, se presento una cantidad
similar de colonias, por lo que se podía decir que no hubo alguna diferencia significativa. En
el caso del agar sangre se observó, antes del calentamiento no hubo hemolisis, γ-hemolisis.
Sim embargo después del calentamiento se observa β-hemolisis en una pequeña porción del
medio. Esto podría deberse a que el calentamiento en agua de la muestra de materia fecal no
fue lo suficientemente alto, de forma que no se eliminaron los organismos anaerobios
completamente, teniendo como consecuencia estos resultados, tanto en el agar Tioglicolato
como en el agar sangre.

Estimación de Clostridium spp en una muestra fecal.

Se muestran en las Figuras XI, XII y XIII los tubos de leche-fierro de las diluciones 2, 3 y 4
de la muestra de materia fecal, y posteriormente el cálculo del número más probable de
colonias en la muestra.

Figura XI: Tubos Figura XII: Tubos Figura XIII: Tubos

inoculados con la dilución inoculados con la dilución 3 inoculados con la dilución
2 de la muestra de materia de la muestra de materia 3 de la muestra de materia
fecal. fecal. fecal.
1

2 3

Figura XV: Escherichia coli

en 1) BHI, 2) Nutritivo, 3)
tioglicolato
 Tubos positivos en la dilución
1:10 1:100 1:100 NMP
1 2 2 20.0

1
20.0 × × 10 = 2 × 105 𝑁𝑀𝑃/𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑖𝑛𝑎𝑙
10−3
Comparación del crecimiento en medios de cultivo líquidos de: Clostridium spp, Escherichia
coli y Bacillus subtilis; en tres medios de cultivo: BHI, agar nutritivo y agar Tioglicolato.

El crecimiento de Clostridium spp en el medio BHI y agar nutritivo fue apenas visible, sólo se logró

1 2 3 1 2 3

Figura XIV: Clostridium sp Figura XVI: Bacillus

en 1) BHI, 2) Nutritivo, 3) subtilis en 1) BHI, 2)
tioglicolato Nutritivo, 3) tioglicolato

observar una ligera turbidez en la parte baja del tubo, esto al ser un organismo anaerobio. Sin
embargo, en el medio de Tioglicolato no se observó algún crecimiento, lo cual se relaciona a que este
organismo es delicado y difícil de cultivar. El crecimiento de Escherichia coli en el medio BHI y agar
nutritivo se presentó a lo largo ambos medios, lo cual concuerda con la clasificación de este
organismo como facultativo. Por otra parte, en el agar Tioglicolato, sólo se observó en la parte
superior del tubo en una capa relativamente gruesa. Finalmente, el crecimiento de Bacillus subtilis en
los tres medios sólo se dio en la parte superior de ambos medios, ya que este organismo es aerobio.
Para el caso de medio BHI y agar nutritivo, el crecimiento fue mayor que en Tioglicolato.

Observaciones:
Con respecto al tiempo de incubación en todos los que tenían sembrado Yakult se prolongó
a 72 horas esto porque ya se había observado que el crecimiento de Lactobacillus casei es
más lento en los medios que estamos utilizando. En la diferenciación de las bacterias
aeróbicas y anaeróbicas en el caso de la infusión de cerebro y corazón el Agar nutritivo y el
de Tioglicolato fue un poco más complicado distinguir el crecimiento bacteriano esto por el
color de los agares y qué según la cantidad de crecimiento se podían distinguir a penas entre
BHI y Agar nutritivo.
En la prueba del Agar hierro leche de no ser por la contraluz también hubiera sido complicado
distinguir los que estaban parcialmente cuajados.
En las pruebas del Tioglicolato el Agar Tioglicolato y el Agar sangre la diferencia de
crecimiento no era tan perceptible si acaso se veían un poco más dispersas.

Conclusiones:
Con la realización de la parte I de esta práctica se resaltó la importancia de la descripción de
todas las características morfologías de las colonias y la descripción del crecimiento en
medios de cultivo como el agar inclinado o en medio líquido. Además de observaron más a
fondo las colonias obtenidas de las muestras de tierra y de Yakult, que se trabajaron en la
práctica anterior, y se realizó la resiembra de algunas de ellas.
Por otra parte, la parte II nos ayudó a identificar algunas características de bacterias
anaerobias. Se observó su comportamiento en agar Tioglicolato y agar sangre en una jarra de
anaerobiosis con el uso de Gas Pak, aunque hubo crecimiento en estos medios después del
calentamiento en agua, estos resultados se puedes comparar o validar por medio de la
investigación bibliográfica. También se logró la cuantificación del número más probable de
bacterias en una muestra de materia fecal, como un método para la cuantificación de estos
organismos anaerobios. Y como parte final se observó y comparó el crecimiento de
organismos aerobios, facultativos y anaerobios según su naturaleza y su comportamiento en
presencia de oxígeno.
Cuestionario:
Parte I

1. En las últimas estrías de un cultivo puro se observan colonias que tienen las mismas
características de morfología colonial pero que difieren en tamaño, ¿cómo explica
este hecho?

Durante el estriado, la densidad celular disminuye, lo que lleva a que cada vez menor cantidad
de células o células individuales se depositen por separado en la superficie del agar. De esta
forma las células que han sido suficientemente aisladas crecerán en diferentes colonias y su
tamaño dependerá de la cantidad de células iniciales.

2. ¿Qué relación existe entre la forma de crecimiento de las bacterias en medio líquido
y sus requerimientos de oxígeno, así como el efecto de la tención superficial del
medio de cultivo?

La capacidad o incapacidad para vivir en presencia de oxígeno se llama aerotolerancia.

Después de la esterilización del medio, el oxígeno comienza a difundirse nuevamente en él.
En los medios tubulares (tanto líquidos como sólidos) este proceso crea un gradiente de
concentraciones de oxígeno, que van desde aeróbico en la parte superior, más cercano a la
fuente de oxígeno, a anaeróbico en el fondo.
Debido a la tendencia natural de los microorganismos a proliferar donde la concentración de
oxígeno se adapta mejor a sus necesidades metabólicas, desarrollarán diferentes grados de
densidad de población en el medio, lo cual permite examinar visualmente su aerotolerancia.
● Los aerobios estrictos crecen en la parte superior donde el oxígeno es más abundante.
● Los anaerobios facultativos crecen en presencia o ausencia de oxígeno. Cuando hay
oxígeno disponible, respiran aeróbicamente. Cuando no hay oxígeno disponible,
respiran anaeróbicamente (reduciendo azufre o nitrato en lugar de oxígeno) o
fermentan un sustrato disponible. Donde existe un gradiente de oxígeno, los
anaerobios facultativos crecen en todo el medio, pero son más densos en la parte
superior.
● Los microaerófilos sobreviven solo en ambientes que contienen niveles de oxígeno
inferiores a los atmosféricos y se verán en algún lugar cerca de la región media o
media superior del medio.
● Los anaerobios estrictos, organismos para los que pequeñas cantidades de oxígeno
son letales, sólo se verán en las regiones inferiores del medio, dependiendo de qué
tan adentro del medio se haya difundido el oxígeno.

3. ¿Por qué el agar Tioglicolato tiene un potencial redox?

El medio líquido de Tioglicolato es un sistema que permite cultivar pequeñas cantidades de

bacterias anaeróbicas o microaerófilas. Es un medio formulado para promover el crecimiento
de una amplia variedad de microorganismos anaeróbicos y algunos microaerófilos. Entre los
componentes de agar se encuentran el Tioglicolato de sodio y la L-cistina, los cuales tienen
un potencial redox para reducir el oxígeno a agua; y resazurina, la cual tiene un color rosa
cuando se oxida e incolora cuando se reduce, actando como un indicador. También se incluye
una pequeña cantidad de agar para disminuir la difusión de oxígeno. En la región superior se
mantiene un color rosado, el estar oxidada y la parte inferior se mantiene incolora, al estar
reducida.

4. ¿Qué es α, β y γ hemolisis?

Varias especies de cocos grampositivos producen exotoxinas llamadas hemolisinas, que

pueden destruir los glóbulos rojos y la hemoglobina. El agar sangre permite la diferenciación
de bacterias en función de su capacidad para hemolizar los glóbulos rojos. Los tres tipos
principales de hemólisis son:
o α-hemólisis: es la destrucción parcial de los glóbulos rojos y produce una
decoloración verdosa del agar alrededor de las colonias.
o β-hemólisis: es la destrucción completa de los glóbulos rojos y la hemoglobina,
resulta en una limpieza del medio alrededor de las colonias.
o γ-hemólisis: es en realidad no hemólisis y aparece como un crecimiento simple sin
cambio en el medio
Parte II
1. Menciones 5 ambientes naturales a partir de los cuales se pueden aislar
microorganismos anaerobios estrictos (no incluya suelo ni materia fecal).
o En digestiones de aguas residuales o sedimentos lacustres anóxicos (Ej.
Methanobacterium formicicum).
o En el tracto intestinal (Ej. Variedad del género Clostridium).
o Ambientes altamente salinos (Ej. Micrococcus).
o En el rumen de intestino grueso de animales (Ej. Ruminococcus).
o En la piel, en el intestino o vagina (Ej, Peptostreptococcus).

2. Explique con fórmulas, las reacciones químicas que ocurren en el sobre de Gas Pak
dentro de la jarra de anaerobiosis, como se obtiene la atmosfera anaerobia y como
funciona el indicador de oxidorreducción.
El Gas Pak produce una atmósfera de anaerobiosis debido a que los cuándo compuestos
químicos que contiene se activan produce una atmosfera de CO2 lo que favorece a las
bacterias anaerobias, de acuerdo con las siguientes reacciones:

𝑁𝑎𝐵𝐻4 + 2 𝐻2 𝑂 → 𝑁𝑎𝐵𝑂2 + 4 𝐻2 ↑

𝐶3 𝐻5 𝑂(𝐶𝑂𝑂𝐻)2 + 3 𝑁𝑎𝐻𝐶𝑂3 𝐶𝑎𝑡𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜𝑟 𝐶𝑜𝐶𝑙2

→ 𝐶3 𝐻5 𝑂(𝐶𝑂𝑂𝑁𝑎)3 + 3 𝐶𝑂2 + 3 𝐻2 ↑
El indicador de oxido reducción es el azul de metileno es el indicador redox ya que cambia
de color al reducir su estructura en ausencia de oxígeno. El azul de metileno en su forma
oxidada es de color azul y en su forma reducida es incoloro.

3. ¿Por qué un organismo facultativo puede crecer en ambientes oxidantes o reductores?

Porque estos organismos pueden crecer en presencia o en ausencia de oxígeno, es decir
en un ambiente oxidante o un ambiente reductor, ya que cuando hay oxígeno respiran
aeróbicamente y cuando no hay oxígeno pueden respirar anaeróbicamente.

4. ¿Cómo se producen las condiciones anaeróbicas en el medio de leche-fierro?

En este medio hay presencia de caseína y de lactosa, compuestos que pueden ser fermentados,
de forma que en condiciones anaerobias permite que los microorganismos realicen la
fermentación usando como aceptor final de electrones el hierro Fe(III), reduciéndolo a Fe(II).
Estas condiciones anaeróbicas se logran colocando una capa de aceite mineral arriba del
medio, de forma que no permite la difusión del oxígeno hacia el medio.

Bibliografia:
o Midigan, M.T., Martinko, J.M., (2015), Brock biology of microorganisms, 14th
Edition, Pearson Education Inc.
o Leboffe, M. J., Pierce, B. E., (2011), A Photographic Atlas for the Microbiology
Laboratoy, 4th Edition, Morton Publishing.
o Labs Medical, (2014), GasPak System (The Anaerobic jar), Revisado el 9 de
septiembre de 2019 de http://www.medical-labs.net/gaspak-system-the-anaerobic-
jar-2914/