UADY

FACULTAD DE QUMICA Campus de Ciencias De la Salud

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE YUCATN FACULTAD DE QUMICA

CURSO DE VERANO 2013

BACTERIOLOGA

Pruebas treponmicas y no treponmicas

Elaborado por DAVID POOT PECH

Docente M. en C. Claribel Huchin Chan

FECHA DE ENTREGA

MRIDA, YUCATN A VIERNES 21 DE JUNIO DE 2013

1. Pruebas serolgicas La sfilis se diagnostica en la mayor parte de los pacientes mediante las pruebas serolgicas. especficas.1 Las pruebas no treponmicas se emplean para la deteccin selectiva porque se realizan con rapidez y son poco costosas. La positividad de una de estas pruebas se confirma con una prueba treponmica.1 Se utilizan dos tipos generales de pruebas, las pruebas

biolgicamente inespecficas (no treponmicas) y las pruebas treponmicas

Estos grupos son complementarios, no mutuamente excluyentes. Las pruebas no treponmicas son muy tiles como estudios de cribado. Las pruebas treponmicas deben reservarse como estudios confirmatorios cuando una prueba no treponmica es positiva o cuando la sospecha clnica de sfilis es alta, a pesar de que una prueba no treponmica sea no reactiva.2

2. Pruebas serolgicas inespecficas con antgeno de cardiolipina Las pruebas no treponmicas determinan los anticuerpos de IgG e IgM (anticuerpos reagnicos) desarrollados frente a los lpidos que se liberan de las clulas daadas durante la fase precoz de la enfermedad. El antgeno que se usa para las pruebas no treponmicas es la cardiolipina, la cual se obtiene del corazn de las vacas. Las pruebas que se usan con frecuencia son la prueba Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) y la prueba de rapid plasmid reagin (RPR).1 Ambas pruebas consiste en una reaccin entre un antgeno de lecitina, colesterol y cardiolipina purificada que se mezcla con el suero y/o diluciones del mismo. La presencia de anticuerpos antirreaginas produce una aglutinacin de partculas, esta deben observarse al microscopio.3 Ambas pruebas se pueden efectuar de forma rpida, aunque se debe inactivar el complemento en el suero 30 minutos antes de que se pueda realizar la prueba del VDRL, esta prueba solo puede utilizarse para analizar el lquido cefalorraqudeo de los pacientes con sospecha de neurosfilis. Otras pruebas no treponmicas utilizan la reagina srica no

calentada (USR) y la prueba de suero no calentada con rojo de toluidina (TRUST).1 2.1. VDRL (Venereal Disease Research Laboratory)

2.1.1. Fudamento Es una reaccin de floculacin, donde el antgeno utilizado est compuesto por colesterol, lecitina y cardiolipina. Esta prueba no treponmica mide anticuerpos antilipdicos; IgG e IgM, los cuales son formados por el husped en respuesta al material lipdico liberado de las clulas husped daadas en la infeccin por TP y material lipdico de la superficie celular treponmica. Tiene gran sensibilidad y baja especificidad, utiliza controles para su sofisticacin (vase Cuadro 1).4 2.1.2. Metodologa para VDRL5 a) Reaccin cualitativa (deteccin). 1. Obtener suero o plasma para utilizarse fresco o descomplementado. 2. Dejar que el ltex VDRL alcance la temperatura ambiente. 3. Agitar frasco antes de su empleo y durante el reparto utilizar el cuentagotas para repartir el ltex retirarlo del frasco y tapar. 4. En la reparticin dejar caer la gota en forma vertical. 5. Agitar seis minutos en el agitador. 6. Leer inmediatamente al microscopio.5
Cuadro 1. Controles para la prueba cualitativa VDRL. Reaccin cualitativa (deteccin ) Depositar en una placa de Kline Suero o plasma Control positivo suero Suero fisiolgico Ltex VDRL (con contador de gotas calibrado) Pozuelo No. 1 Testigo antgeno 30 L 1 gota Pozuelo No. 2 Control positivo titulado 30 L 1 gota Pozuelo No. 3 3 a 24 sueros o plasmas pacientes 30 L 1 gota

b) Reaccin cuantitativa preparar varias disoluciones con el suero de control positivo titulado o los sueros de pacientes, con solucin salina isotnica (de 1:2 hasta 1:128). Realizar la reaccin con cada una de estas disoluciones (como en la reaccin cualitativa).5

2.1.3. Interpretacin de resultados La formacin de cmulos de las partculas de ltex (en masas vase Figura 1) se considera una reaccin positiva, reportndose como Reactiva. Es una prueba negativa o no reactiva, si se observan las partculas de ltex repartidas uniformemente.5

Figura 1. Prueba VDRL: las reacciones en esta prueba se evalan microscpicamente. (A) Suero no reactivo. Las partculas de antgeno VDRL se encuentran dispersas de forma uniforme, sin agruparse. (B) Suero reactivo: las partculas de antgeno VDRL estn fuertemente aglutinadas por este suero sifiltico. Las partculas aisladas se agrupan en cmulos y grandes grumos. 100 x.
2

2.2.

RPR (Prueba rpida de reagina plasmtica)

2.2.1. Fundamento Es una suspension estabilizada que contiene cardiolipina, lecitina y colesterol. a la cual se le ha adicionado particulas de carbon.6 La prueba RPR es rpido, barato, y fcil de usar. Es excepcionalmente til en la deteccin. Al igual que su contraparte no treponmico mayor, la VDRL, que puede ser cuantificada. Estas pruebas son muy sensibles, es decir, hay pocos falsos negativos, excepto como se discute a continuacin.7

2.2.2. Equipos, materiales y reactivos Aguja calibre 20 descartable, sin bisel, tratada con silconas, frasco de plstico para distribuir antgeno. De 3,89 g, tarjetas RPR recubiertas de plstico con diez crculos, de aproximadamente 18 mm de dimetro cada uno, dispositivos plsticos desechables (Dispenstir). para distribucin-agitacin, que libera 50 L.2

Placa rotatoria mecnica, de velocidad tija o regulable a 100 2 rpm, que describa un crculo de 1,8 cm de dimetro en el plano horizontal. Cubierta humectante para la placa rotatoria. Lmpara incandescente de alta intensidad. Dispositivo de seguridad para pipetear, con puntas descartables de 50 L. Recipientes para residuos y desinfectantes. Guantes de ltex desechables. anteojos de seguridad y ropa protectora. Suspensin de antgeno RPR (una variante del antgeno para VDRL): combinacin estabilizada de cardiolipina al 0,003%, lecitina al 0,020-0,022%, colesterol al 0,09%. cloruro de colina al 10%, EDTA 0.0125M, carbn al 0,1875%, Na2HP04 0,1 M,2

KH,P04 0,01 M, timerosal al 0,1% y agua destilada. Muestras de suero control: sueros liofilizados sobre una tarjeta reactivo (R), de reaccin mnima (MR) y no reactivo (N). Solucin fisiolgica al 0.9% como diluyente. 2.2.3. Mtodos para la detencin de RPR 2.2.3.1. Mtodo cualitativo 1. Perforar el inserto del frasco y colocar la aguja calibrada.5 2. Mezclar perfectamente el frasco del antgeno por agitacin ligera antes de cada determinacin. 3. Con el tubo gotero colocar en un crculo de la tarjeta una gota del suero o plasma del paciente, extendiendo la gota en el rea de reaccin, con la parte posterior del tubo gotero o de polietileno. 4. Con el frasco gotero en posicin vertical y con la aguja hacia abajo agregar una gota de antgeno a la gota colocada en el paso 3.

No mezclar las dos gotas5 5. Mantener la tarjeta en rotacin por 8 minutos a 100 rpm. 6. Al trmino de la rotacin interpretar los resultados en un periodo de 1 minuto.5 2.2.3.2. Interpretacin de resultados

Reactivo: aparicin de partculas de carbn aglutinado.

No reactivo: presencia de una suspensin homognea de color gris, en ocasiones aparece el botn central, o algunas partculas de carbn migran al borde del crculo, permaneciendo la suspensin homognea en ambos casos el resultado se reporta como negativo o no reactivo.5

2.2.3.3.

Mtodo cuantitativo

Pruebas cuantitativas RPR se reportan como "no reactivo" o "reactivo" en diluciones de 1:01, 1:02, 1:04, 1:08, 1:16, 1:32, 1:64, etc Si bien gran confianza puede ser colocado en las pruebas RPR o VDRL, recuerde que los pacientes con sfilis primaria activa infecciosa con frecuencia tienen VDRL no reactivo y las pruebas de RPR (vase Figura 2).7

Figura 2. Reacciones de RPR pruebas cualitativas y cuantitativas.

2.3.

Reaccin en suero no calentado. USR (Unheated Serum Reagin)

2.3.1. Principios de la prueba La USR es una prueba microscpica, no-treponmica y de floculacin en placa. El antgeno de USR detectara anticuerpos (reaginas) antilipoidales en muestras de suero de personas con otras condiciones agudas y crnicas.

La prueba de microfloculacin USR usa una suspensin de antgeno de VDRL modificado que contiene cloruro de colina, la cual incrementa la reactividad del anticuerpo en suero no calentado. Semejante a la VDRL, la prueba se lee microscpicamente y es rpido y fcil de hacer. Sin embargo, a diferencia de la VDRL, la suspensin antignica de la USR no debe ser preparada o descartada diariamente.4

2.3.2. Materiales 2.3.2.1. Reactivos

1. Suspensin antignica USR. Una combinacin estabilizada de cardiolipina, colesterol y lecitina en una solucin resuspendida de EDTA, cloruro de colina, fosfato y timerosal. La suspensin antignica se guarda a 2 8 C. Suspensiones no abiertas son estables al menos por 1 ao desde la fecha de manufactura o hasta la fecha de expiracin.2 2. Alcohol, Etanol 95% 3. Acetona 2 2.3.2.2. Preparados

1. Muestras de suero control. Reactivo (R), dbil reactivo (D) y no reactivo (NR). 2. Solucin salina 0,9%. Agregar 0,9 g de cloruro de sodio seco (ACS) a 100 ml de agua destilada. 2.3.4. Procedimientos 2.3.4.1. Prueba Cualitativa

1. Las pruebas de floculacin en placa para sfilis, son afectadas por la temperatura. Para obtener resultados confiables y reproducibles, la suspensin antignica de USR, los controles y la muestra a analizar deben estar a temperatura ambiente (23 29 C) cuando se realiza la prueba.2 2. Colocar con una pipeta automtica 50 l de suero no calentado en un anillo de parafina o cermica de la placa. No usar placas de vidrio con concavidades, pocillos o anillos de vidrio.

3. Resuspender suavemente la suspensin de antgeno de USR. 4. Sostener la aguja dispensadora de la suspensin antignica y la jeringa en posicin vertical, dispensar varias gotas para eliminar el aire de la aguja; luego agregar exactamente 1 gota (22 l) de suspensin antignica a cada crculo conteniendo suero. 5. Colocar la placa sobre el rotador mecnico. Rotar la placa por 4 minutos a 180 2 rpm. Cuando se realiza la prueba en un clima seco, cubrir las placas con un cobertor humidificante durante la rotacin para prevenir la evaporacin excesiva. 6. Inmediatamente despus de la rotacin, sacar la placa del rotador y leer los resultados. 7. Realizar la prueba cuantitativa en todas las muestra de suero que produzcan un resultado reactivo, dbil reactivo o no reactivo rugoso en la prueba cualitativa.2 2.3.4.1.1. Lectura e informe de los resultados cualitativos Leer las reacciones usando un microscopio equipado con ocular de 10X y objetivo de 10X. Informar los resultados de la siguiente manera (vase cuadro 2):2 Cuadro 2. Interpretacin de resultados pruebas USR Lectura Grumos grandes o medianos Grumos pequeos Sin grumos o muy ligera rugosidad 2.3.4.2. Prueba Cuantitativa Informe Reactivo (R) Dbil reactivo (D) No reactivo (NR)

Diluir hasta un ttulo de punto final todas las muestras que produzcan resultados reactivo, dbil reactivo o no reactivo rugoso en la prueba cualitativa. Analizar la muestra de suero no diluida y diluida 1:2, 1:4 y 1:8. Se pueden realizar en una sola placa las pruebas cuantitativas hasta diluciones 1:8 de tres muestras de suero (vase Figura 3 y Cuadro 3 para la interpretacin del resultado).4, 6

Figura 3. Prueba cuantitativa parea USR Cuadro 3. Informe de los resultados cuantitativos en suero Suero no diluido (1:1) R R R D N (rugoso) D Resultado en diluciones del suero 1:2 D R R D D N 1:4 N D R R R N 1:8 N N D R R N 1:16 N N N D R N 1:32 N N N N N N Reactivo, no diluido (1 dil) Reactivo, 2 dils Reactivo, 4 dils Reactivo, 8 dils Reactivo, 16 dils Dbil Reactivo, 1 dil
4,6

Inforeme

A continuacin se reporta en el Cuadro 4, la sensibilidad de las pruebas no treponmicas en los diferentes estadios de la enfermedad de sfilis.
Cuadro 4. Sensibilidad y Especificidad de las Pruebas No-Treponmicas Sensibilidad (%) por estadio de sfilis no tratada (rango) Prueba Primaria 78 (74-87) 86 (77-99) 80 (72-88) 85 (77-86) 100 Secundaria Latente 96 (88-100) 98 (95-100) 95 (88-100) 98 (95-100) Tarda 71 (34-94) 73 Especificidad No-sfilis % (rango) 98 (96-99) 98 (93-99) 99 99 98-99)

VDRL RPR USR TRUST

3. Pruebas serolgicas especficas con antgeno treponmico 3.1. Prueba de absorcin de anticuerpos treponmicos fluorescentes

(FTA-ABS)

La prueba treponmica ms empleada era la prueba de absorcin de anticuerpos treponmicos fluorescentes (FTA-ABS) la cual es una prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos. Las clulas de T. pallidum inmovilizadas en el portaobjetos se utilizan como antgeno. El portaobjetos se recubre de suero del paciente, que se ha mezclado con un extracto de treponemas no patgeno. A continuacin se aaden antibiticos antihumanos marcados con fluorescena con el propsito de detectar la presencia de anticuerpos especficos en dicho suero.1

3.1.1. Materiales y equipo

Estufa de incubacin de 35 a 37 C, bao de agua regulable a 56 C, dispositivo de seguridad para pipetas. micropipeteadores graduables de 10 a 200 L, Ansa bacteriolgica estndar de platino de 2 mm calibre 26, papel absorbente, soporte para portaobjetos con cmara hmeda y toallas de papel, placas de coloracin, de vidrio o plstico, con soporte para portaobjetos desmontable, portaobjetos de 2,5 x 7,5 cm, con un extremo mate, de 1 mm de espesor, con dos crculos grabados, de 1 cm de dimetro interno, cubreobjetos, tubos de ensayo (12 x 75 mm) y gradillas, recipientes para descartar el material y desinfectantes, guantes de ltex descartables, anteojos de seguridad y ropa protectora, microscopio de fluorescencia equipado para microscopia con fluorescena, agitadora B.2

3.1.2. Reactivos Comerciales Antgeno de T. pallidum: una suspensin de T. pallidum (cepa Nichols) obtenida en tejido testicular de conejo y lavada con solucin salina tamponada. para eliminar las globulinas de conejo.2 Suero anti-IgG humana marcado con FITC.2 Absorbente: preparado de cultivos de treponemas de Reiter no patgenos, habitualmente sin el agregado de conservantes. A menudo se venden fraccionados en cantidades de 5 mL y liofilizados, aunque tambin se venden en estado lquido.

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Suero control reactivo: una mezcla de muestras de suero humano obtenidas de dadores sifilticos que son reactivos 4+. Se utilizan para preparar sueros control 4+ y controles mnimamente reactivos 1+. El control 1+ muestra el grado mnimo de fluorescencia informado como reactivo y se utiliza como estndar de lectura.

Suero control inespecfico: una mezcla de sueros obtenida de individuos no sifilticos. Sin agregado de conservantes. Este control muestra una reactividad inespecfica > 2+ en una dilucin 1:5 en buffer de fosfatos (PBS) y casi no se tie cuando se diluye 1:5 en absorbente.

Aceite: aceite de inmersin de baja fluorescencia, no secante, tipo A, Cargille 1248. Acetona: reactivo grado ACS.2 PBS, pH 7,2.2 Tween 80 (polisorbato 80) al 2% en PBS. Calentar los reactivos en bao Mara a 56 C. Agregar a 49 mL de PBS esteril 1 mL de Tween 80, medido desde el extremo de una pipeta, lavando la pipeta con la mezcla. Controlar el pH y llevarlo a 7,2 con NaOH 1 N. Desechar si se forma un precipitado o el pH cambia.

3.1.3. Reactivos preparados

3.2.

Medio de montaje: agregar una parte de PBS a 9 partes de glicerina (reactivo proanlisis). Agua destilada. Preparacin de los reactivos de la prueba Rehidratar el antgeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante.2 Los frascos ampolla abiertos, conservados a 2 a 8 C, son estables durante una semana.2

3.2.1. Antgeno de T. pallidum

Para preparar los portaobjetos, mezclar completamente la suspensin del antgeno en una agitadora durante 10 segundos. Determinar por microscopia de fondo oscuro que los treponemas estn adecuadamente dispersos antes de realizar los frotis para la prueba FTA-ABS.

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Limpiar los portaobjetos con una gasa limpia para eliminar las panculas de polvo. Limpiar los portaobjetos por vibracin snica o frotndolos con alcohol si los treponemas no se ven con claridad despus de la coloracin.

Preparar frotis muy delgados de T. pallidum dentro de cada circulo mediante un ansa de alambre de 2 mm. Colocar el antgeno contenido en un ansa dentro de dos crculos de 1 cm. Dejar secar al aire al menos durante 15 minutos.

Fijar los portaobjetos en acetona durante 10 minutos y secar al aire. No fijar ms de 60 portaobjetos con 200 mL de acetona. Conservar los frotis fijados con acetona a - 20 C. No descongelar y congelar nuevamente los frotis. Conservar los frascos ampolla de antgeno no abiertos a 2 a 8 C. El antgeno no abierto es estable hasta la fecha de vencimiento. 2

3.2.2. Titulacin de la anti-IgG humana Rehidratar el conjugado de acuerdo con las instrucciones. Si esta turbio, centrifugarlo a 500 g durante 10 minutos. Fraccionar en alcuotas pequeas y conservar a -2 0 C. No congelar nuevamente el conjugado descongelado; conservarlo a 2 a 8C.2 Preparar diluciones 4+ y 1+ del suero reactivo de control, para determinar la dilucin de trabajo del conjugado. Correr el patrn control con una referencia o un conjugado conocido.2

3.3.

TINCION INESPECIFICA SUERO REACTIVO 4+ y 1+

3.3.1. Adsorbente Rehidratar el material liofilizado con agua destilada esteril o de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El absorbente rehidratado puede

conservarse a 2 a 8 C o a -2 0 C. Puede utilizarse todo el tiempo que se desee mientras la reactividad obtenida sea aceptable y el producto no este contaminado.2 3.3.2. Suero problema

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Seguir las medidas de seguridad recomendadas para la manipulacion de sueros humanos.2 Calentar el suero problema y el suero control a 56 C durante 30 minutos, antes de realizar la prueba. El da de la prueba recalentar el suero problema durante 10 minutos a 56 C.2

3.3.3. Suero control Rehidratar el suero de acuerdo con las instrucciones del fabricante.2 Fraccionar en alcuotas de 0,25 mL y conservar a -2 0 C durante todo el tiempo en que la reactividad sea aceptable. Preparar los siguientes controles para cada determinacin: o Suero control reactivo (R) 4+: un suero sifiltico que muestre fluorescencia 4+ en una prueba sin absorcin y fluorescencia solo levemente reducida en la prueba absorbida. Para producir suero no absorbido, agregar 50 L de suero control reactivo a un tubo que contenga 200 L de PBS y mezclar bien. Para producir suero absorbido, transferir 50 L del suero control reactivo a un tubo con 200 L de absorbente y mezclar bien. o Suero control mnimamente reactivo (MR). Es una dilucin en PBS del suero control reactivo, que del mnimo grado de fluorescencia (1+) considerada reactiva. o Suero control inespecfico (NS): un suero no sifiltico que muestre fluorescencia >2+ en la prueba no absorbida. Para producir el suero no absorbido, transferir 50 L del suero control inespecfico a un tubo que contenga 200 L de PBS y mezclar bien. Para producir el suero absorbido, transferir 50 L del suero control inespecfico a un tubo con 200 |iL de absorbente y mezclar bien. o Los controles para tincin inespecfica de los conjugados consisten en un frotis de antgeno cubierto con 30 L de PBS en lugar de suero y un frotis de antgeno cubierto con 30 L de absorbente en lugar de suero.2

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3.4.

Prueba FTA-ABS

Identificar los portaobjetos preparados antes con antgeno numerndolos en el extremo mate.2 Numerar cada tubo y portaobjetos para que se correspondan con el suero problema y el suero control por utilizar. Preparar diluciones del suero control reactivo (4+), mnimamente reactivo (1+) y control inespecfico en absorbente o PBS de acuerdo con las instrucciones.

Pipetear 200 L de absorbente en un tubo de ensayo para cada suero problema. Agregar 50 L de suero problema calentado al tubo correspondiente y mezclar ocho veces. Cubrir los frotis de antgeno que corresponda con 30 L de las diluciones suero control reactivo (4+), mnimamente reactivo (1+) y control inespecfico.

Cubrir los frotis de antgeno que corresponda con 30 L de PBS y 30 L. de absorbente para los controles a y b de tincin inespecfica. Los controles deben mostrar el siguiente patrn:

Cubrir los frotis de antgeno que correspondan con 30 L de las diluciones del suero problema. Evitar la evaporacin colocando los portaobjetos en cmara hmeda e incubar a 35 a 37 C durante 30 minutos. Al finalizar la incubacin realizar los siguientes lavados:2 o Colocar los portaobjetos en los soportes para tincin y lavar 5 segundos con PBS corriente. o Colocar durante 5 minutos los portaobjetos en cubetas de coloracin que contengan PBS. o Agitar los portaobjetos sumergindolos y retirndolos del PBS al menos 30 veces. o Repetir los dos pasos anteriores con PBS nuevo.

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o Lavar los portaobjetos durante 5 segundos con agua destilada corriente y secar en forma suave con papel absorbente.

Diluir la anti-IgG humana marcada con FITC hasta su ttulo de trabajo en PBS con 2% de Tween 80 y colocar aproximadamente 30 L de conjugado diluido sobre cada frotis.

Repetir la incubacin y los lavados de los portaobjetos. Montar los portaobjetos de inmediato, colocando una pequea gota de medio de montaje y un cubreobjetos sobre cada frotis. Colocar los portaobjetos en una habitacin oscura y leer antes de transcurridas 4 horas. Controlar los frotis por microscopia de fondo oscuro, utilizando primero la lmpara de tungsteno, para verificar la presencia de treponemas en el frotis, luego leer la fluorescencia FITC (prueba).

Utilizando el portaobjetos de control mnimamente reactivo (1+) como estndar de lectura, registrar la intensidad de fluorescencia de los treponemas:

Informar los resultados de la siguiente forma (vase Cuadro 5 y Figura 4):2

Cuadro 5. Sistema de informe para la prueba FTA-ABS

Lectura inicial de la prueba Lectura de repeticin Informe 4+ Reactivo 3+ Reactivo 2+ Reactivo 1+ Reactivo Mnimamente reactivo* 1+ 1+ 1+ 1+ No reactivo 1+ 1+ No reactivo N No reactivo Fluorcencia atpica observada** Fluorescencia en rosario *En ausencia de signos de infeccin treponmica, este resultado de la prueba debe considerarse dudoso. Debe obtenerse una segunda muestra 1 a 2 semanas despus de la muestra inicial y enviarla al laboratorio para realizar pruebas serolgicas. **La fluorescencia en rosario ha sido observada en pacientes con lupus eritematoso sistmico activo o con otras enfermedades autoinmunitarias.

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Figura 4. Treponema pallidum. Este control de la prueba FTA-ABS muestra tincin 4+ de las espiroquetas. Se observan la forma helicoidal y las espirales firmemente enrolladas en algunas de las celulas bacterianas. Esta microfotografa es una preparacin con inmunofluorescencia indirecta de T. pallidum que utiliza antiglobulina humana conjugada con fluorescena (aumento original. 600x).
2

4. Otras pruebas treponmicas Otra de estas pruebas es la Treponema pallidum haemaglutination assay (TPHA) la cual consiste en un test de aglutinacin indirecto para la determinacin de anticuerpos T. pallidum en el suero/plasma humano. Una prueba de estas es la TPI (Treponema pallidum immobilizatiton) sin embargo, esta prueba ya es obsoleta debido a su baja sensibilidad en la sfilis primaria.
2

La Reaccin de inmovilizacin del T. pallidum (TPI o prueba de Nelson): esta es una prueba costosa, de ejecucin muy delicada, que ya ha sido prcticamente sustituida por la FTA-ABS, a pesar de ser la ms especfica. Se ha considerado prueba de referencia en casos dudosos y consiste en la demostracin de la inmovilizacin de T. pallidum vivos mviles por los anticuerpos especficos en el suero del paciente, despus de la segunda semana de la infeccin. Se mezclan diluciones del suero del paciente con complemento y T. pallidum vivos y activamente mviles, extrados de chancros testiculares de conejo. La reaccin se lee en el microscopio de campo oscuro y se considera positiva cuando se produce la inmovilizacin de ms del 50 % de los treponemas presentes. En suero normal, el movimiento activo contina. Esta prueba es difcil de realizar, requiere treponemas vivos y en la actualidad rara vez se practica.8

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Reaccin de hemaglutinacin pasiva (HAP) (TPHA) y microhemaglutinacin Treponema pallidum (MHA-TP): estas pruebas son de reciente introduccin; la MHATP se ha utilizado para la determinacin de anticuerpos especficos antitreponmicos. Se basa en la sensibilizacin de hemates formalinizados de pavo o de carnero, con un lisado de T. pallidum. La adicin de un suero positivo provoca la aglutinacin de los hemates. Es una prueba muy sensible, pero menos especfica que la FTA-ABS, es muy simple y de bajo costo, por lo que su uso se est generalizando. Esta prueba se hace positiva un poco ms tarde, en la evaluacin de la infeccin; es confirmatoria para el diagnstico de la sfilis, con la excepcin de la fase primaria de la enfermedad. Se han empleado ensayos que usan la reaccin en cadena de polimerasa (PCR) para la demostracin del ADN de T. pallidum en muestras clnicas, pero el papel del PCR en laboratorio clnico necesita an ser determinado.8

4.1.

Prueba rpida para determinacin de sfilis en sangre total la determinacin de sfilis son un ensayo

Las pruebas rpidas para

inmunocromatogrfico en fase slida para deteccin cualitativa de anticuerpos tipo IgG, IgM e IgA contra Treponema pallidum.4 Los tipos de muestra con que se ha estandarizado este mtodo son sangre, suero y plasma, otros fluidos no son recomendados para realizar esta prueba. Las muestras que son obtenidas prematuramente durante el periodo de infeccin, pueden tener niveles no detectables de anticuerpos. Si se obtiene un resultado negativo y la clnica del paciente es sospechosa, se debe repetir la prueba despus de un tiempo segn criterio mdico.4

4.1.1. Procedimiento

Rotular el dispositivo de prueba rpida con el nombre o nmero del paciente.4

Limpiar la zona de puncin con algodn impregnado en alcohol, secar con un algodn seco y limpio.

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Presionar el dedo seleccionado para hacer llenado capilar. Puncionar con la lanceta la parte lateral de la yema del dedo. Con la pipeta plstica o tubo capilar tomar la cantidad de sangre necesaria para la prueba.

Adicionar la cantidad requerida de sangre segn la tcnica utilizada dentro del pozo de muestra.

Agregar las gotas necesarias de diluyente (de acuerdo a la tcnica utilizada) dentro del pozo de muestra .En este paso se debe esperar a que se absorba cada gota de diluyente antes de agregar la siguiente.

Interpretar la prueba dentro del tiempo sealado en la tcnica.4

4.1.2. INTERPRETACIN En la ventana de resultados aparecer una banda de color en la lnea de control sealada con la letra C, lo que indica que la prueba est funcionando adecuadamente. En la ventana de resultados, en la lnea sealada con la letra T aparece el resultado del paciente: Negativo: Solamente aparece la banda de color en el control C. 4 Positivo: Aparecen dos bandas de color, la banda control C y la banda test T. 4 Invlido: Cuando no aparece ninguna banda de color en la lnea de control C, se debe repetir la prueba con un dispositivo de prueba nuevo. A continuacin en el Cuadro 6, se resumen las diferencias de las pruebas de serologa treponmicas y no treponmicas.
Cuadro 6. Diferencias entre las pruebas treponmicas y no treponmicas. Pruebas no treponmicas Caractersticas VDRL (Venereal Disease Research Laboratories). RPR (rapid plasma reagin). USR (Unheated serum reagin). TRUST (Toluidine red unheated serum test). Pruebas treponmicas TP-PA (Treponema pallidum particle agglutination) MHA-TP (microhaemagglutination assay for antibodies to Treponema pallidum). FTA-ABS (fluorescent treponemal antibody absorption) EIA (Nontreponemal enzyme immunoassays).
6

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Ventajas

Ampliamente difundidas y disponibles. Permiten seguimiento al poderse valorar la respuesta al tratamiento y diagnosticar infecciones recurrentes de sfilis.

Desventajas Costos Complejidad

Baja especificidad. Subjetividad. Bajos Baja

MHA-TP (microhaemagglutination assay for antibodies to Treponema pallidum). Pruebas rapidas No sirven para seguimiento. Algunas requieren instrumental y personal calificado. Las pruebas treponmicas suelen permanecer positivas para toda la vida, por lo que no permiten distinguir entre sfilis activa y pasada. La cuantificacin de las pruebas Treponmicas no es fiable. Permanece positiva de por vida. Altos Variables

5. Listado de referencias 1- Murray, P.; Rosenthal, K.; Pfaller, M. Micribiologa mdica. 6 Edicin. Editorial Elsevier, Barcelona, 2009, pp 409 2- Winn, W.; Allen, S.; Janda, W.; Koneman, E.; Procop, G.; Schrekenberger, P.; Woods, G. Koneman diagnstico microbiolgico: texto y atlas en color . 6 edicin, Ed. Mdica Panamericana, Buenos Aires, 2008, pp 1082; 1461-5. 3- Basualdo J. Torres R. Microbiologa Biomdica. Editorial Atlante S.R.L. Buenos Aires, 2006, pp. 491. 4- Malbrn, C.G. Manual de tcnicas y procedimiento para el diagnstico de sfilis. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisin Sexual. INEI-ANLIS, Argentina, 2010; pp 1-37. 5- Garibay, A. Manual de prcticas de Inmunologa. Editorial UniSon, Hermosillo, Sonora, 2006; pp 75-82 6- xx. Trejos, S.; Zambrano, J. Manual para el diagnstico de sfilis. Instituto nacional de salud. 2011. pp. 5, 23. 7- Texas department of state health service. Interpretation of Serological Tests for Syphilis. HIV-STD testing locations in Texas FACTS, 2005, 1-4.

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