TINCIÓN DE GIEMSA

La tinción de Giemsa es un tipo de coloración de muestras clínicas, basada en la mezcla de

colorantes ácidos y básicos. Su creación estuvo inspirada por el trabajo realizado por Romanowsky,
donde Gustav Giemsa, químico y bacteriólogo originario de Alemania, la perfeccionó agregando
glicerol para estabilizar los compuestos.

Los cambios generados a la técnica original de Romanowsky permitieron mejorar considerablemente

las observaciones microscópicas, por lo tanto la técnica fue bautizada con el nombre de tinción de
Giemsa.

Por ser una técnica sencilla de realizar, de gran funcionabilidad y económica es actualmente muy
utilizada en el laboratorio clínico para frotis hematológicos, muestras de médula ósea y cortes de
tejido.

La técnica de tinción de Giemsa es muy útil para estudios citológicos, ya que permite la observación de
estructuras específicas de las células. Esta técnica tiñe los citoplasmas, núcleos, nucléolos, vacuolas y
gránulos de las células, pudiéndose distinguir incluso finas trazas de cromatina.

Además, se pueden detectar cambios significativos en el tamaño, forma o coloración del núcleo, donde
es posible visualizar la pérdida de la relación núcleo – citoplasma.

Por otra parte, permite identificar células inmaduras en médula ósea y sangre periférica, siendo
importante para el diagnóstico de enfermedades graves como la leucemia. También es posible
detectar hemoparásitos, bacterias extra e intracelulares, hongos, entre otros.

En citogenética es bastante utilizada, ya que es posible estudiar la mitosis de las células.

Fundamento de la coloración de Giemsa

Los colorantes tipo Romanowsky tienen como fundamento utilizar un contraste entre colorantes ácidos
y básicos, para lograr teñir las estructuras básicas y ácidas respectivamente. Como se puede observar
existe una afinidad de los colorantes ácidos a teñir las estructuras básicas y viceversa.

El colorante básico utilizado es el azul de metileno y sus derivados oxidados (Azure A y Azure B),
mientras que el colorante ácido es la eosina.

Las estructuras ácidas de las células son los ácidos nucleicos, los gránulos de los segmentados
basófilos, entre otras, por tanto serán teñidos con el azul de metileno.

En este mismo sentido, las estructuras básicas de las células son la hemoglobina y algunos gránulos
como los contenidos en los segmentados eosinófilos, entre otras; estos serán teñidos con la eosina.

Por otra parte, debido a que el azul de metileno y el azure se caracterizan por ser colorantes
metacromáticos, estos pueden brindar una tonalidad variable a las distintas estructuras de acuerdo a la
carga de polianiones que posean.

Es así como la combinación estratégica de colorantes básicos y ácidos logran desarrollar una amplio
espectro de colores, de acuerdo con las características bioquímicas de cada estructura, paseándose
por tonalidades azules pálidas, azules oscuras, lila y púrpura en el caso de las estructuras ácidas.

Mientras que la coloración que brinda la eosina es más estable, generando colores entre rojizo-
naranja y salmón.

Materiales

Materiales para la preparación de la solución madre

La preparación de la solución madre requiere pesar 600 mg de colorante Giemsa en polvo, medir 500
cc de alcohol metílico libre de acetona y 50 cc de glicerina neutra.

Modo de preparación de la solución madre

Colocar el polvo de Giemsa pesado en un mortero. Si existen grumos se deben pulverizar.

Posteriormente agregar una cantidad apreciable de la glicerina medida y mezclar muy bien. La mezcla
obtenida se vierte a un frasco color ámbar muy limpio.

El resto de la glicerina se coloca en el mortero. Volver a mezclar para limpiar el resto de colorante que
haya quedado pegado a las paredes del mortero y echar al mismo frasco.
El frasco se tapa y se lleva durante 2 horas en baño maría a 55 ºC. Mientras se encuentre en baño de
maría, realizar ligeras agitaciones de la mezcla cada media hora aproximadamente.

Posteriormente, se deja enfriar la mezcla para colocar el alcohol. Previamente, una parte del alcohol
medido se coloca en el mortero para terminar de lavar lo que quede de colorante y seguidamente se
adiciona a la mezcla junto al resto del alcohol.

Esta preparación se debe dejar madurar durante al menos 2 semanas. La porción que se vaya
utilizando de la solución madre debe ser filtrada.

Para evitar la contaminación del preparado, se recomienda pasar la porción que va a estar en
constante uso a un frasco ámbar pequeño con gotero. Recargar cada vez que se agote el reactivo.

Materiales para preparar la solución Buffer

Por otra parte, se prepara una solución buffer a pH 7,2 de la siguiente manera:

Se pesan 6,77 gr de fosfato de sodio (anhidro) (NaHPO4), 2,59 gr de fosfato dihidrógeno de potasio
(KH2PO4) y agua destilada hasta 1000 cc.

Preparación final del colorante

Para la preparación de la solución final de tinción se miden 2 cc de la solución madre filtrada y se

mezclan con 6 cc de la solución buffer. Se agita la mezcla.

Un dato relevante que hay que tener en cuenta, es que las técnicas de preparación del colorante
pueden cambiar según la casa comercial.

Materiales adicionales necesarios para realizar la coloración

A parte de los materiales descritos, se debe disponer de puentes de coloración, pisetas con agua o
buffer para el lavado, láminas porta objetos o cubre objetos, un cronómetro para controlar los tiempos
de coloración y papel secante o algún material que sirva para secar (gasa o algodón).

Técnica

Proceso de tinción

1) Previo a la coloración se debe tener listo el extendido de la muestra sobre un portaobjetos limpio.
Las muestras pueden ser sangre, médula ósea, cortes de tejidos histológicos o muestras cervico-
vaginal. Se recomienda que los extendidos sean finos y tengan 1 o 2 horas de secado antes de
colorearlos.

2) Sobre un puente de coloración se colocan todas las láminas que se tengan para colorear. Se trabaja
siempre en un mismo orden y se identifica bien cada lámina.

3) Colocar unas gotas de alcohol metílico al 100% (metanol) sobre el frotis y dejar actuar por 3 a 5
minutos, con el fin de fijar y deshidratar la muestra.

4) Descartar el metanol presente en la lámina y dejar secar al aire.

5) Una vez seco colocar con un gotero la solución final de tinción hasta cubrir la totalidad de la lámina.
Dejar actuar por 15 minutos. Algunos autores recomiendan hasta 25 min. Depende de la casa
comercial.

6) Escurrir el colorante y lavar el frotis con agua destilada o con solución buffer a 7,2.

7) Sobre un papel secante dejar secar las láminas al aire libre, dispuestas en forma vertical con ayuda
de un soporte.

8) Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para eliminar
cualquier resto de colorante.

Utilidades

La técnica de tinción de Giemsa es utilizada en diversas áreas, entre ellas: en hematología, micología,
bacteriología, parasitología, citología y citogenética.

Hematología

Es la utilidad más frecuente que se le da a esta tinción. Con ella se logran identificar todas y cada una
de las células presentes en muestras de médula ósea o sangre periférica. Así como estimar el número
de cada serie, pudiéndose detectar leucocitosis o leucopenia, trombocitopenia, etc.

Debido a que es sensible para identificar células inmaduras, es relevante en el diagnóstico de

leucemias agudas o crónicas. También es posible hacer el diagnóstico de anemias, como la anemia
drepanocítica, falciforme, entre otras.
Micología

En esta área es común su utilización para la búsqueda de Histoplasma capsulatum (hongo dimórfico

intracelular) en muestras de tejidos.

Bacteriología

En frotis hematológicos teñidos con Giemsa es posible detectar Borrelias sp en pacientes que cursan
con la enfermedad denominada fiebre recurrentis. Las espiroquetas se observan abundantes entre los
eritrocitos, en muestras tomadas en el pico febril.

También es posible visualizar bacterias intracelulares como Rickettsias sp y Chlamydia trachomatis en

células infectadas.

Parasitología

En el campo de la parasitología, la tinción de Giemsa ha permitido hacer el diagnóstico de

enfermedades parasitarias tales como la malaria, el mal de chagas y la leishmaniasis.

En las dos primeras los parásitos Plasmodium sp y el Tripanosoma cruzi respectivamente pueden

visualizarse en sangre periférica de los pacientes infectados, los mismos pueden encontrarse en
diversos estadios según la fase en la que esté la enfermedad.

Para mejorar la búsqueda de parásitos en sangre se recomienda usar la tinción de Giemsa mezclado
con el colorante de May-Grünwald.

Así mismo, la leishmaniasis cutánea puede diagnosticarse al evaluar muestras de biopsias de piel
teñidas con Giemsa, donde se encuentra el parásito.

Citología

La tinción de Giemsa también es usada para el estudio citológico de muestras endocervicales, aunque
no sea la técnica más frecuentemente usada para este fin.

Pero en casos de escasez de recursos puede emplearse, teniendo una funcionabilidad similar a la que
ofrece la técnica de Papanicolaou y a un menor costo. Sin embargo, requiere de experticia por parte
del examinante.
Citogenética

Una característica relevante de la tinción de Giemsa es su capacidad para unirse fuertemente a las
regiones ricas en adeninas y timinas del ADN. Esto permite que el ADN pueda ser visualizado durante
la mitosis de las células, en diferentes estados de condensación.

Estos estudios son necesarios para detectar aberraciones cromáticas tales como duplicaciones,
deleciones o translocaciones de las distintas regiones de los cromosomas.

Investigaciones que demuestran la eficacia de la tinción de Giemsa

Cannova y cols (2016), compararon 3 técnicas de coloración para el diagnóstico de leishmaniasis

cutánea.

Para ello, utilizaron muestras obtenidas de un animal de experimentación (Mesocrisetus

auratus) inoculado experimentalmente con Leishmanias.

Los autores demostraron que la tinción de Giemsa fue mejor que la coloración de Pap-mart® y
Gaffney. Por tanto, consideraron que la coloración de Giemsa es la ideal para diagnosticar la
leishmaniasis cutánea.

Los excelentes resultados obtenidos por los autores se deben a que la combinación de colorantes que
componen la mezcla de Giemsa presenta las condiciones necesarias para crear un contraste
favorable, permitiendo distinguir claramente las estructuras de los amastigotas, tanto intra como
extracelularmente.

Las otras técnicas (Pap-mart® y Gaffney) también lo hicieron, pero de una forma más débil y por tanto
más difícil de visualizar. Es por ello que la coloración de Giemsa se recomienda para el diagnóstico
parasitológico de leishmaniasis.

Así mismo, un estudio de Ramírez y cols (1994), evaluó la validez de las tinciones de Giemsa y
Lendrum en frotis conjuntivales para la identificación de Chlamydia trachomatis.

Los autores determinaron que la tinción de Giemsa y Ledrum poseen igual especificidad, pero Giemsa
resultó ser más sensible.

Esto explica porqué en la actualidad la tinción de Giemsa es la más frecuentemente utilizada para el
diagnóstico de infecciones por clamidias, especialmente si existen pocos recursos.
Recomendaciones para una buena tinción

No debe acelerarse el secado de las láminas. Se debe esperar el tiempo prudencial para el secado de
la misma al aire libre. Aproximadamente 2 horas.

Colorear inmediatamente pasadas las 2 horas para mejores resultados.

Para que los frotis se fijen y se tiñan mejor la muestra debe ser distribuida sobre la lámina de tal
manera que quede una capa delgada y uniforme.
La muestra de sangre preferida es la capilar, ya que el frotis se hace de manera directa de la gota de
sangre y por tanto la muestra no lleva aditivo alguno, lo cual favorece el mantenimiento de las
estructuras celulares.

Sin embargo, si se usa sangre venosa se debe usar EDTA como anticoagulante y no heparina, ya que
este último por lo general deforma las células.

Errores comunes en la coloración de Giemsa

En la práctica de esta coloración se pueden cometer errores. Los mismos se evidencian por cambios
bruscos en las tonalidades de las estructuras.

Coloración extremadamente azul

Se puede deber a:

 Frotis muy gruesos

 Exceder en el tiempo de tinción
 Lavar de forma insuficiente.
 Uso de reactivos muy por encima del pH neutro (alcalino).

Bajo estas condiciones los colores de las siguientes estructuras se distorsionan, de tal manera que los
eritrocitos en vez de teñirse de rosa-salmón se verán verdes, los gránulos de los eosinófilos que deben
teñirse de rojo ladrillo se tornarán azulados o grises y así sucesivamente habrá desviación en las
tonalidades habituales.

Coloración excesivamente rosada

Puede deberse a:

 Tiempo de tinción insuficiente.

 Lavado prolongado o excesivo.
 Mal secado.
 Empleo de reactivos muy ácidos.

En este caso en particular, las estructuras que normalmente se tiñen de azul no serán casi visibles,
mientras que las estructuras que se tiñen de rosa tendrán tonalidades muy exageradas.

Ejemplo: los eritrocitos tomarán un color rojo brillante o anaranjado fuerte, la cromatina  nuclear se
verá rosa pálida y los gránulos de los eosinófilos se teñirán de rojo brillante intenso.
Presencia de precipitados en el frotis

Las causas pueden ser:

 Usar láminas sucias o mal lavadas.

 No dejar secar bien el frotis.
 Dejar la solución fijadora por demasiado tiempo.
 Lavados inadecuados al concluir la tinción.
 Filtración inadecuada o no filtración del colorante que se está utilizando.

Presencia de artefactos morfológicos

En los frotis pueden aparecer artefactos morfológicos que dificultan la visualización e interpretación de
las estructuras presentes. Esto se debe a:

 Tipo de anticoagulante empleado, como la heparina.

 Uso de láminas sucias, deterioradas o grasientas.

Modo de almacenamiento

Después de preparado el colorante debe mantenerse a temperatura ambiente (15 – 25°C), para evitar
que el colorante precipite. Debe almacenarse en envase ámbar bien cerrado.

Referencias

1. Cannova D, Brito E y  Simons M. Evaluación de técnicas de coloraciones para el diagnóstico

de la Leishmaniasis cutánea. Salus.  2016; 20 (2): 24-29.
2. PanReac Applichem ITW  Reagents. Tinción de Giemsa. Versión 2: JMBJUL17
CEIVD10ES. Castellar del Vallés, España.
3. Clark G. Staining procedures (1981), 4thed. Williams & Willkins.
4. Química Clínica Aplicada. Colorante Giemsa para diagnóstico in vitro. Distribuidor:
cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F y Grazioso C. Validez de las tinciones de
Giemsa y Lendrum en frotis conjuntivales para la identificación de Chlamydia
trachomatis. Bol of Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Micología General. 1994.  2° Ed. Universidad Central de Venezuela,
Ediciones de biblioteca. Venezuela, Caracas.
7. «Tinción de Giemsa.» Wikipedia, La enciclopedia libre. 1 Sep 2017, 01:02 UTC. 6 dic 2018,
es.wikipedia.org.
 TINCIÓN DE MAY GRÜNWALD-GIEMSA

La tinción de May Grünwald-Giemsa o Pappenheim es una técnica de coloración diferencial que

mezcla los reactivos Giemsa y May Grünwald. Es utilizada para la diferenciación de células
sanguíneas normales y anormales en frotis de sangre periférica y médula ósea, así como para la
tinción de cortes histológicos y muestras citológicas.

Ambos reactivos —Giemsa y May Grünwald— se derivan de la tinción tipo Romanowsky, técnica que
está basada en la combinación de colorantes ácidos y básicos.

Frotis donde se muestra un segmentado neutrófilo y un mileocito en un caso de Leucemia Mieloide

Crónica, teñido con la tinción de May Grünwald Giemsa. Dr Ramon Simon-Lopez
(https://es.m.wikipedia.org/wiki/Archivo:LMC-1.JPG) a través de Wikipedia.org.

Giemsa mejoró la técnica al estabilizar la mezcla de eosina, azul de metileno y sus derivados, con
glicerol. En cambio, May Grünwald utiliza eosina y azul de metileno, usando como solvente el metanol.
Esta combinación estratégica ha dado excelentes resultados.
Si bien en cuanto a la observación de morfología celular actúa de forma similar a las coloraciones de
Giemsa y Wright, esta técnica mejora las anteriores afinando la coloración de los parásitos que causan
el paludismo, el mal de Chagas, la leishmaniasis y la tricomoniasis.

Adicionalmente, ha mostrado ser una técnica muy útil para el estudio citológico del líquido
espermático. Se ha destacado no solamente al mostrar las características morfológicas de los
espermatozoides, sino que además permite diferenciar con gran eficacia los leucocitos, las células
epiteliales y las células de la espermatogénesis.

Fundamento

La técnica sigue el fundamento de las tinciones de Romanowsky, en las que los colorantes ácidos
tienen afinidad selectiva por los componentes básicos celulares y los componentes ácidos atraen a los
colorantes básicos.

Explicado de otra forma, tanto las estructuras celulares como los colorantes poseen cargas eléctricas
positivas o negativas; las cargas iguales se repelen y las cargas diferentes se atraen.

Por ejemplo, los colorantes básicos como el azul de metileno están cargados positivamente y son
atraídos por las estructuras cargadas negativamente. Es por ello que este colorante tiñe los núcleos
que son ricos en ADN y ARN que poseen grupos fosfatos cargados negativamente.

También se tiñen los gránulos de los segmentados basófilos y los citoplasmas de los glóbulos blancos
mononucleares que contienen ARN.

Así mismo, el colorante ácido lleva carga negativa, por lo que se une a estructuras cargadas
positivamente como los eritrocitos y los gránulos de los segmentados eosinófilos. En cuanto a los
gránulos de los segmentados neutrófilos, estos fijan ambos colorantes.

Variedad de colorantes

En esta técnica coexiste una combinación de reacciones entre los colorantes ortocromáticos y los
metacromáticos. Los ortocromáticos (la eosina y el azul de metileno) se fijan a la estructura celular a la
que son afines y proporcionan un color estable que no varía.

En cambio, los metacromáticos (los derivados del azul de metileno azure A y azure B), varían su color
original una vez unidos a la estructura específica, pudiendo incluso haber variedad de matices.

Finalmente, el paso que lleva la solución May Grünwald necesita la presencia de agua, pues sin este el
colorante penetrará las estructuras pero no se fijará. Para que ello ocurra el colorante debe volverse
polar o ionizarse, y así ser capaz de precipitar y fijarse a las estructuras afines.
Técnica

Materiales

– Láminas portaobjetos.

– Puentes de coloración.

– Solución de May-Grünwald.

– Tinción de Giemsa.

– Agua destilada.

Solución concentrada de colorante May Grünwald

Se deben pesar 0,25 gr de eosina-azul de metileno (colorante según May Grünwald) y disolver en 100
ml de metanol. Luego se mezcla la preparación durante 1 hora y se deja reposar por 24 horas.
Finalizado el tiempo, se filtra.

Para aplicar la técnica debe diluirse el colorante May Grünwald de la siguiente manera: para 200 ml de
colorante diluido se miden 30 ml de la solución concentrada, se agregan 20 ml de solución tampón y
150 ml de agua destilada ajustada a pH7.2-7.3. Posteriormente se mezcla y se filtra.

Colorante de Giemsa concentrado

Se deben pesar 0,5 gr de azur-eosina-azul de metileno (colorante según Giemsa), disolver en 50 ml de

metanol y colocar a la mezcla 50 ml de glicerina.

Para ejecutar la técnica se diluye 1:10 con solución tampón y se deja reposar por 10 minutos. Se
puede filtrar si es necesario.

Preparación de la solución tampón a pH 7,2

Deben pesarse:

– 40 mg de potasio di-hidrógeno fosfato (KH2PO4).

– 151 mg de di-sodio hidrógeno fosfato 12-hidrato (Na2HPO4).

Se disuelven ambos compuestos en 100 ml de agua.

Procedimiento de tinción de frotis sanguíneos o de médula ósea

Existen dos modalidades: una clásica y una rápida.

Modalidad clásica

1. Cubrir los frotis durante 2 o 3 minutos con la solución de May-Grünwald diluida.

2. Lavar con agua destilada tamponada para eliminar la solución anterior.
3. Cubrir con la misma solución de lavado tamponada y dejar por 1 minuto. La idea es que el
colorante anterior se fije a las estructuras y que, al mismo tiempo, se hidraten las células.
4. Agregar 12 gotas de tintura de Giemsa diluida sobre el agua tamponada y soplar para
mezclar y homogeneizar. Dejar reposar durante 15 o 20 minutos.
5. Lavar los frotis con agua destilada tamponada y colocarlo a secar al aire.
6. Enfocar y observar en un microscopio óptico las células sanguíneas teñidas utilizando el
objetivo de 40X. Si es necesario, puede usarse el de 100X.

Modalidad rápida

1. Cubrir el frotis con el colorante May Grünwald diluido durante 1 minuto.

2. Lavar con agua destilada tamponada.
3. Cubrir con agua tamponada y dejar reposar por 1 minuto.
4. Colocar el colorante Giemsa diluido y dejar por 5 minutos.
5. Lavar con agua destilada tamponada y dejar secar al aire.

Las técnicas aquí descritas son una guía orientadora, pero se debe tener en cuenta que los
procedimientos y los tiempos de coloración varían de acuerdo con la casa comercial que expende los
reactivos. Se aconseja seguir los pasos estrictamente señalados por cada casa comercial.

Técnica para colorear extendidos de líquido espermático

1- Cubrir el extendido con una capa fina de la solución May Grünwald por 4 minutos.

2- Retirar el colorante y lavar con agua destilada.

3- Colocar una capa de Giemsa diluido (1:10) en agua destilada durante 15 minutos.

4- Retirar el colorante y lavar con agua destilada.

5- Dejar secar y observar en el microscopio.

Especificaciones importantes

La técnica precisa que los reactivos y las soluciones de lavado presenten un pH ajustado a 7.2 -7.3,
para que las afinidades de los colorantes por las estructuras celulares no se distorsionen y no varíe el
color final esperado.

Usos

Esta técnica es utilizada por los laboratorios clínicos para teñir frotis de sangre periférica y médula
ósea, cortes de tejidos y citologías.

En el ámbito hematológico, esta técnica es de vital importancia en el estudio de anormalidades de las

células en cuanto a forma, tamaño y número. Es una herramienta muy valiosa para el diagnóstico de
ciertas enfermedades, como leucemias y anemias.
Además, presenta una destacada utilidad cuando se buscan parásitos en los ámbitos hematológico
(Plasmodium sp y Tripanosoma cruzi) o histológico (Leishmanias sp).

Citología vaginal

En cuanto a citología vaginal, esta técnica es especialmente ventajosa para la observación

de Trichomonas vaginalis. Este es un hallazgo importante, ya que su presencia simula cuadros de
carcinoma in situ que luego desaparecen cuando se elimina el parásito.

Muestra espermática

Ha sido una herramienta ideal para el estudio de muestras espermáticas, dado que brinda información
valiosa sobre la calidad de los espermatozoides.

Los datos que ofrece tienen que ver principalmente con número y morfología, así como con las células
concomitantes que puedan estar presentes y que son de vital importancia, como las células
germinales, los leucocitos y las células epiteliales.

Con este análisis es posible describir anormalidades observadas en los espermatozoides en la cabeza,
el cuello, la pieza media y la pieza principal.

Además, también pueden ayuda a evidenciar casos de hemospermia (presencia de hematíes en el

semen) y leucospermia o piospermia (aumento del número de leucocitos en el semen).

Referencias

1. Costamagna S, Prado M. Validación del examen en fresco, coloraciones de May Grünwald-

Giemsa y Gram y medios de cultivo para el diagnostico de Trichomonas vaginalis. Parasitol.
2001; 25 (1-2): 60-64. Disponible en: scielo.
2. Laboratorio Merck KGaA. May Grünwald eosina azul de metileno para microscopía.
3. «Tinción de May-Grünwald-Giemsa.» Wikipedia, La enciclopedia libre. 15 nov 2018, 14:37
UTC. 8 ene 2019, 04:29: es.wikipedia.org
4. Laboratorio Glass Chemicals Panreac. Reactivos para técnicas histológicas, hematología y
microbiología. Disponible en: glasschemicals.com
5. Retamales E, Manzo V. Recomendación para la tinción de frotis sanguíneos para la lectura
del hemograma. Laboratorio Biomédico Nacional y de Referencia. Instituto de Salud Pública
de Chile.
6. Sarabia L. Espermiograma según los criterios de la OMS. Programa de Anatomía y Biología
del desarrollo. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Disponible en:
pp.centramerica.com
 TINCION DE PAPANICOLAOU

Principio La tinción de Papanicolaou se aplica a exudados vaginales para la detección de cáncer

uterino o vaginal. La técnica utiliza un elevado número de colorantes en su procedimiento.

• Hematoxilina: es la tinción nuclear escogida, permite básicamente revelar los núcleos de las células
presentes en la muestra. Suele usarse Hematoxilina de Harris.

• Orange G: es un colorante sintético de carácter ácido que revela compuestos básicos como la
prequeratina (que tiñe de color rosado) o la queratina (que tiñe de color naranja brillante).

• Eosina amarillenta: tiñe de color rosa-anaranjado el citoplasma de las células escamosas maduras,
de las células ciliadas y de los eritrocitos.

• Verde Luz SF amarillento: tiñe de color verde-azulado las células escamosas no superficiales
(inmaduras o a parcialmente maduras).

• Pardo Bismark R: no tiñe el citoplasma celular pero si la mucina.

• Ácido fosfotúngstico: tiene una función mordiente, especialmente importante para el Verde Luz SF. Al
presentar su composición varios colorantes, es capaz de revelar diferentes tipos de células.

Estas características son las que la hacen óptima para estudios de tipo citológico. La técnica implica el
uso de tres soluciones diferentes, por un lado la correspondiente a la hematoxilina, por otro la que
contiene Orange G (solución de Papanicolaou OG) y la última con el resto de colorantes (solución de
Papanicolaou EA).

Procedimiento
1. Fijar la muestra con spray.

2. Sumergir sucesivamente en alcohol 80%, alcohol 70%, alcohol 50% y agua, 1 minuto en cada
líquido.

3. Teñir con Hematoxilina de Harris solución durante 5 minutos aproximadamente.

4. Sumergir en agua 6 veces durante 1 segundo.

5. Sumergir en Ácido Clorhídrico 0,5%, 8 veces durante 1 segundo.

6. Lavar con agua corriente durante 5 minutos, y pasar la muestra por alcoholes de grado sucesivo,
50%, 70%, 80% y 96% durante 30 segundos en cada uno de ellos.

7. Teñir con Solución de Papanicolaou OG 6 de 1 a 1,5 minutos.

8. Lavar el exceso de colorante en dos baños de Etanol 96% sumergiendo la preparación 2 veces en
cada uno de 3 a 4 segundos.

9. Teñir con Solución de Papanicolaou EA 50 de 1,5 a 2 minutos.

10. Lavar en 3 recipientes distintos de Etanol 96% v/v sumergiendo la preparación 2 veces de 3 a 4
segundos en cada uno de ellos.

11. Lavar en Etanol absoluto durante 30 segundos.

12. Sumergir la preparación durante 4 minutos en un baño 1:1 de Xileno, mezcla de isómeros y Etanol
absoluto.

13. Aclarar con Xileno, mezcla de isómeros sumergiendo la preparación durante 3 minutos en un baño.

14. Montar con medio de montaje.

15. Observar al microscopio.

Nota técnica El microscopio usado debería corresponder a los requisitos de un laboratorio de

diagnóstico clínico.

Si se utiliza un aparato automático de tinción, deben tenerse en cuenta las instrucciones de empleo del
fabricante del aparato y del software. Preparación de las muestras Todas las muestras deben tratarse
de acuerdo con el estado de la tecnología.

Todas las muestras deben estar rotuladas inequívocamente.

Diagnóstico Los diagnósticos deberán ser establecidos solamente por personas autorizadas y
cualificadas.

Cada aplicación debería implicar controles adecuados para descartar resultados erróneos.
Almacenamiento La solución de tinción debe almacenarse a temperatura ambiente.

Caducidad El producto almacenado a la temperatura indicada y en envase bien cerrado, es utilizable

hasta la fecha de caducidad indicada en el envase.