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FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

E.A.P. DE TECNOLOGÍA MÉDICA EN


LABORATORIO CLÍNICO Y ANATOMÍA
PATOLÓGICA

QUÍMICA
TÍTULO:
“INTERFERENCIA EN LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA POR EL ÁCIDO
ASCÓRBICO”

DOCENTE: CLASE: AC2M1

Lic. Ítalo Moisés Saldaña


MESA N° 3

INTEGRANTES:

1. BECERRA GARVASSI, Angie a2019100450


2. GONZALES QUISPE, Jesica a2019100978
3. LOPEZ VENTURA, Druzila a2019100034
4. MENDOZA NUÑEZ, Job a2019100936
5. PEÑA COLCAS, Evelyn a2019100990
6. RIVERA AYALA, Gheraldyne a2019100777
7. SANTA CRUZ ASTOCHADO, Jackeline a2019101511
8. SARCO CAZASOLA, Yuvit a2019100453
9. ZAMORA PEREYRA, Oscar a2019101441

SEMESTRE: II- 2019


“INTERFERENCIA EN LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
POR EL ÁCIDO ASCÓRBICO”
“INTERFERENCE IN THE DETERMINATION OF GLUCOSE
BY ASCORBIC ACID”

BECERRA GARVASSI, ANGIE; GONZALES QUISPE, JESICA; LOPEZ VENTURA,


DRUZILA; MENDOZA NUÑEZ, JOB; PEÑA COLCAS, EVELYN; RIVERA AYALA,
GHERALDYNE; SANTA CRUZ ASTOCHADO, JACKELINE; SARCO CAZASOLA, YUVIT;
ZAMORA PEREYRA, OSCAR

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD - TECNOLOGÍA MÉDICA EN


LABORATORIO CLÍNICO Y ANATOMÍA PATOLÓGICA

RESUMEN

Introducción. La interferencia por ácido ascórbico es una de las principales


causas de rechazo analítico de muestras de suero en el laboratorio clínico.
Objetivo. Determinar la interferencia por ácido ascórbico en las muestras para la
determinación de glucosa en suero en el autoanalizador Cobas c311 de ROCHE
DIAGNOSTICS®. Diseño. Estudio con enfoque cuantitativo de alcance explicativo
y de diseño experimental. Institución. Clínica Limatambo, San Isidro, Lima, Perú.
Material Biológico. Muestras sanguíneas provenientes de sujetos voluntarios.
Intervenciones. Se añadieron cantidades crecientes de ácido ascórbico (0 mg/dl,
256 mg/dl, 128 mg/dl, 64 mg/dl, 32 mg/dl, 16 mg/dl, 8 mg/dl y 4 mg/dl) a ocho
diferentes alícuotas de una mezcla de sueros y se determinó en ellas por
duplicado la influencia del interferente en el constituyente de glucosa sérica. Se
siguió el protocolo de la Sociedad Española de Química Clínica. Principal medida
de resultados. Porcentaje relativo de desviación de la concentración del
constituyente por influencia del ácido ascórbico, con respecto a la muestra sin
interferente. Resultados. No se observó interferencia significativa para glucosa,
en todas las alícuotas con concentraciones crecientes de ácido ascórbico
empleadas en el ensayo. Conclusiones. El método Hexoquinasa anula de forma
inmediata la interferencia por ácido ascórbico. Sin embargo, se recomienda que
cada laboratorio investigue los efectos del ácido ascórbico empleando sus propios
métodos, reactivos o instrumentos.

Palabras claves. Ácido ascórbico; Interferencia por ácido ascórbico; Glucosa.


ABSTRACT

Introduction. Ascorbic acid interference is one of the main causes of analytical


rejection of serum samples in the clinical laboratory. Objective. Determine the
interference by ascorbic acid in the samples for the determination of serum glucose
in the Cobas c311 autoanalyzer of ROCHE DIAGNOSTICS®. Design. Study with
quantitative approach of explanatory scope and experimental design. Institution.
Limatambo Clinic, San Isidro, Lima, Peru. Biologic material. Blood samples from
voluntary subjects. Interventions. Increasing amounts of ascorbic acid (0 mg / dl,
256 mg / dl, 128 mg / dl, 64 mg / dl, 32 mg / dl, 16 mg / dl, 8 mg / dl and 4 mg / dl)
were added to eight different aliquots of a mixture of sera and the influence of the
interference on the serum glucose constituent was determined in duplicate. The
protocol of the Spanish Society of Clinical Chemistry was followed. Main outcome
measure. Relative percentage of deviation of the concentration of the constituent
due to the influence of ascorbic acid, with respect to the sample without
interference. Results. No significant interference for glucose was observed in all
aliquots with increasing concentrations of ascorbic acid used in the assay.
Conclusions. The Hexokinase method immediately cancels interference by
ascorbic acid. However, it is recommended that each laboratory investigate the
effects of ascorbic acid using its own methods, reagents or instruments.

Keywords. Ascorbic acid; Ascorbic acid interference; Glucose.

INTRODUCCIÓN

La interferencia se define como la causa más común y persistente en la


determinación de un examen, dando lugar a un diagnóstico clínico erróneo y a la
realización de análisis adicionales inapropiadas 1.

El ácido ascórbico es una vitamina soluble en agua y es una de las causas más
frecuentes que pueden generar interferencias químicas en la determinación de
glucosa en sangre, alterando cuantitativamente los resultados finales 2.

Los humanos no pueden sintetizar esta vitamina, por lo que es necesario


obtenerla a través de la dieta3. Es de vital importancia el análisis de glucosa en
suero, ya que se usa para dar seguimiento a distintas enfermedades como la
diabetes mellitus, proporcionando un mejor diagnóstico, evaluando un mejor
tratamiento, midiendo con precisión los niveles de glucosa y analiza los posibles
trastornos del metabolismo de los carbohidratos.
Por lo tanto, la dosificación glucémica es hoy uno de los parámetros de laboratorio
más importante. La interferencia del ácido ascórbico se ha informado en varios
estudios4. Barbosa y Andrade5 demostraron que el consumo de vitaminas interfiere
con los niveles de glucosa en sangre, mientras que Martinello y Silva 6 mostraron
interferencia  in vitro no solo de glucosa sino también de otros analitos.

La presente investigación es importante, ya que nos ayudará a conocer, que las


rutinas de laboratorio están sujetas a diversas interferencias, específicamente en
la determinación de glucemia y que los factores que interfieren son el ejercicio
físico, el estrés y el ácido ascórbico que, si están presentes en muestras
biológicas, pueden interferir con técnicas utilizadas por el laboratorio clínico, dando
lugar a resultados falsos.

El objetivo principal es determinar la interferencia por ácido ascórbico en las


muestras para la determinación de glucosa en suero.

MÉTODOS Y MATERIALES

El presente estudio corresponde a un enfoque cuantitativo de alcance explicativo y


de diseño experimental7.

Para la presente investigación el muestreo utilizado será no probabilístico, por


conveniencia e incluirá las muestras sanguíneas provenientes de 16 sujetos
voluntarios a partir de la cuales se prepararan una solución de pool de sueros, los
cuales servirán para el acondicionamiento de las alícuotas con cantidades
creciente del interferente.

El procedimiento de la siguiente investigación se basará en el uso del documento


técnico de la Comisión de Metrología y Sistemas Analíticos y el Comité Científico,
Sociedad Española de Medicina de Laboratorio: “Procedimiento para el estudio de
interferencias exógenas en la medición de magnitudes biológicas” 8.

Para conseguir varios grados de concentración del interferente se añadirán


cantidades crecientes de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich) a ocho diferentes
alícuotas del pool de sueros (suero base), en esta preparación la mezcla libre de
interferente se iguala en volumen a las alícuotas con interferente con la utilización
de agua destilada, para evitar el error por dilución. Obteniéndose ocho alícuotas
con intensidades crecientes del interferente y una basal sin interferente.

Las concentraciones de interferente luego de las respectivas diluciones en las


alícuotas resultaran ser de: 1º 0 mg/dL, 2º 256 mg/dL, 3º 128 mg/dL, 4º 64 mg/dL,
5º 32 mg/dL, 6º 16 mg/dL, 7º 8 mg/dL y 8º 4 mg/dL.
Cada uno de las diluciones se analizará por duplicado de forma independiente,
para determinarse de esta forma el porcentaje de variación en la concentración de
cada constituyente analizado en función del incremento del interferente.

Instrumentación y reactivos

Los efectos de la interferencia por ácido ascórbico en la determinación de glucosa


serán valorados en el analizador automatizado Cobas c311 de ROCHE
DIAGNOSTICS®, donde se determinará la concentración de glucosa, mediante el
Método enzimático empleando hexoquinasa, utilizando el reactivo Glucose HK
Gen.3 (GLUC3), calibrado con calibrador C.f.a.s y PreciControl ClinChem Multi,
ambos de ROCHE DIAGNOSTICS®. Los métodos analíticos se realizarán según
las indicaciones del fabricante.

Para tal efecto se utilizará la siguiente técnica para determinar el analito a


investigar: Glucosa (Método de Hexoquinasa).

Tabla I. Método enzimático de referencia empleando Hexoquinasa para


determinar glucosa sérica

Método: Método enzimático empleando Hexoquinasa

HK

Glucosa + ATP G  6-P + ADP

G-6-PDH

Reacción química:
G-6-P + NADP+  gluconato-6-P + NADPH + H+
En la tabla I, se muestra el principio del Test, el cual es Test por radiación
ultravioleta por el método enzimático de referencia empleando Hexoquinasa. Aquí
la Hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa a glucosa-6-fosfato por ATP.

Luego en la segunda reacción química, en presencia de NADP, la


glucosa-6-fosfato deshidrogenasa oxida la glucosa-6-fosfato a gluconato-6-fosfato.
No se oxidan otros hidratos de carbono. La velocidad de formación de NADPH
durante la reacción es directamente proporcional a la concentración de glucosa y
se determina fotométricamente.

El analizador será calibrado previamente al estudio de acuerdo a las


recomendaciones del fabricante. El programa de control de calidad interno incluirá
la evaluación de sueros controles de dos niveles de decisión que se procesaran
diariamente y una muestra mensual de un control de calidad externo.

Tabla II. Definición del test Glucosa para el analizador cobas c311

Método de la técnica: Enzimático empleando hexoquinasa

Modo de medición: 2 puntos finales

Tiempo de reacción/ Puntos de 10/ 18-38 (STAT 7/ 6-26)


medición:

Dirección de la reacción Aumentado

Longitud de onda A/B 700/340 nm

Unidad: mmol/L (mg/dL,g/L)

Calibrador: S1: H2O / S2: C.f.a.s

Controles: PreciControl ClinChem Multi 1 y 2

Modo de calibración: Lineal


Intervalo de calibraciones: Calibración a 2 puntos

Tipo de muestras: Suero y plasma

En la tabla II, se muestran los métodos en los que se basan las mediciones de la
glucosa y la concentración sérica basal (sin interferente) del constituyente en
estudio.

Plan de Análisis de Datos

Para la evaluación de la interferencia se medirá las concentraciones del


constituyente en cada dilución por duplicado, las diluciones se procesarán de
forma aleatoria y en la misma serie analítica.

Posteriormente se calculará la media obtenida para cada dilución y se determinará


el porcentaje de interferencia para cada dilución mediante la siguiente relación:

% Interferencia = 100 x (Cd - C1) / C1

Donde:

Cd: Es la media de los valores de concentración obtenidos para cada dilución con
interferente, en los tubos 2,3,4,5,6,7 y 8.

C1: La media de concentración obtenida para la dilución 1 (sin interferente) 9.

Mediante el método de Glick et al 10, se construirá un interferograma, donde se


represente la relación entre el porcentaje de interferencia y la concentración
conocida del interferente.

Para evaluar la existencia de interferencia se utilizará el criterio que utiliza el


fabricante para evaluar este tipo de interferencia, para lo cual se considerará la
existencia de interferencia significativa si existe una variación en ± 10% del
resultado de la alícuota basal o sin interferente.
Para el procesamiento de los datos se empleará el software estadístico SPSS
versión 21 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU).

RESULTADOS

En la industria del diagnóstico in vitro es habitual establecer un intervalo de error


relativo máximo admisible para las interferencias de ± 10%. Este último criterio ha
sido el utilizado en esta investigación 11.

No se observó interferencia significativa para: glucosa, en todas las alícuotas con


concentraciones crecientes de ácido ascórbico empleadas en el ensayo.

En la tabla III, se determinó el promedio de los duplicados de la concentración del


constituyente en estudio, glucosa sérica en mg/ dl para cada alícuota, en conjunto
con las concentraciones del interferente Ácido Ascórbico en mg/dl.

Tabla III. Promedio de los duplicados de la concentración de glucosa sérica,


con cantidades crecientes del interferente Ácido Ascórbico

Dilución Tubo 1 Tubo 8 Tubo 7 Tubo 6 Tubo 5 Tubo 4 Tubo 3 Tubo 2

[ ] de Ácido 0 4 8 16 32 64 128 256


ascórbico
mg/dl

Glucosa
mg/dl 91.05 90.3 90.1 90.15 90.35 90.40 90.35 91.15
(Promedio)

En la tabla IV, se expone los porcentajes relativos de desviación de la


concentración del constituyente con respecto al resultado inicial y las alícuotas
donde se detecta la interferencia para cada uno de los constituyentes.

Tabla IV. Porcentaje de Interferencia de ácido Ascórbico para cada uno de


los constituyentes en la determinación de glucosa

Dilución Tubo 1 Tubo 8 Tubo 7 Tubo 6 Tubo 5 Tubo 4 Tubo 3 Tubo 2


% 0% -0.823723% -1.043382% -0.988467% -0.768808% -0.713893% -0.768808%
Interferencia

0.109829%

En la Figura I, se representa el interferograma 12, donde se aprecia el efecto de la


adición de cantidades crecientes del interferente ácido ascórbico sobre la
concentración del analito estudiado.

Figura I. Interferencia del Ácido ascórbico sobre la medición de la Glucosa.

Y INTERFEROGRAMA DEL ANALITO GLUCOSA SERICA


30

20

10
% Interferencia

-10

-20

-30
0 256 128 64 32 16 8 4

X
[ ] de Interferencia
-Y

DISCUSIÓN

La interferencia por ácido ascórbico es un problema común en la realización de un


examen de laboratorio. Genera un diagnóstico clínico erróneo y conlleva a la
realización de análisis adicional inadecuado. Constantemente se cuestiona la
exactitud de los resultados cuando se analiza un examen de glucosa en sangre.
Por ello, es importante conocer el grado de interferencia química del ácido
ascórbico en la realización de dicho examen. 1,2

Para la evaluación de la interferencia se considera una variación significativa de +


10% sobre el resultado de la muestra sin interferencia. Este criterio, es utilizado
por muchos fabricantes en sus estudios de evaluación. 11

Los métodos enzimáticos presentan una gran especificidad, ya que utilizan


enzimas purificadas que actúan selectivamente sobre la molécula glucosa.

Nuestros resultados indican que, si hubiéramos utilizado el método glucosa


oxidasa, hubieran sido detectados como sensibles a la presencia del interferente.
Esta reacción tiene dos fases; en la primera, la glucosa oxidasa se transforma en
ácido glucónico + H2O2 y la segunda fase se basa en la utilización de un sistema
enzimático en el cual el H2O2 formada, se acopla a través de una peroxidasa a un
receptor cromogénico, que difiere en el color del cromógeno generado el fenol 4 –
aminofenosa (reactivo de trinder) Este último ayuda a la oxidación de cromógeno
para obtener un compuesto coloreado, es ahí donde interfiere el ácido ascórbico.
En este método, el oxígeno tiene mayor afinidad para oxidar el ácido ascórbico,
por lo que las moléculas del oxígeno, pasan a oxidar al cromógeno formando una
coloración disminuida. Esto quiere decir que en presencia de ácido ascórbico la
concentración de glucosa, brinda un resultado de falso negativo. 15

En comparación con el método hexoquinasa, que se utilizó en esta investigación,


el porcentaje de interferencia de glucosa por ácido ascórbico oscila entre – 0,82%
y 0%, teniendo en cuenta el primer tubo. Por Lo que se observa que el rango de
interferencia se mantiene en +10%.

Este procedimiento enzimático, utiliza dos enzimas de gran especificidad, la


enzima hexoquinasa, que transforma la glucosa a glucosa – 6 - fosfato. La enzima
6 fosfato - deshidrogenasa, que transforma al fosfato en 6 - fosfogluconato +
NADPH. Este método no utiliza la reacción de trinder, por lo tanto, el ácido
ascórbico no tiene donde actuar. Teniendo como resultado que el ácido ascórbico
no interfiere en la enzima de la glucosa.15

Ante la presencia de una concentración de ácido ascórbico de 25.6 mg, los


resultados para la determinación de glucosa no se vieron afectados en el método
hexoquinasa, ya que en este método no existe la reacción trinder por lo que el
ácido ascórbico no puede causar interferencia.
Podemos concluir que el método hexoquinasa, es un procedimiento de mayor
calidad diagnostica, precisión y exactitud para la determinación de la glucosa.
Las glucosas utilizadas en esta investigación, estaban en el rango de 90 - 91
mg/dL de sangre, quiere decir en el rango normal de glucosa en sangre, lo cual no
hubo interferencia de ácido ascórbico, en una investigación realizada con
muestras de glucosa normal y patológica se observó que no hubo interferencia en
ambos tipos de muestra, solo se notó interferencia al aumento de vitamina C 5,
quiere decir que mientras el rango normal de glucosa se mantenga, sin
alteraciones o el aumento de vitamina C, no se notará interferencia por ácido
ascórbico. Por otro lado, en estudios in vivo e in vitro, se obtuvo diferentes
resultados, en el estudio in vivo en el aumento de vitamina C, no se observó
interferencia en la determinación de glucosa, a comparación del estudio in vitro
donde el ácido ascórbico inhibió las reacciones de los analitos estudiados 6.

Finalmente podemos concluir que las muestras con el interferente Acido


Ascórbico, mediante el Método de la Hexoquinasa, no es de gran problema en los
laboratorios, ya que este anula inmediatamente la interferencia de Ácido
Ascórbico. Sin embargo, como nos refiere Martinello y Silva 6, es esencial que en
los laboratorios se preste especial atención a los profesionales involucrados, así
como la debida orientación al paciente sobre el efecto del ácido ascórbico en los
exámenes de laboratorio, para que así puedan suspender el uso de vitamina C, 72
horas antes de los exámenes.

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