PRACTICA N°3

REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

Estas reacciones constituyen lavase de cierto número de pruebas de

laboratorio utilizadas para descubrir e identificar antígenos o anticuerpos y
complejos inmunológicos circulantes. En esta reacción el antígeno es
particulado, no soluble; en este caso los anticuerpos específicos se combinan
con el determinante antigénico sobre la superficie de una partícula o célula,
produciendo un conglomerado de células o partículas, denominado aglutinación.
Para llevar a cabo cualquier reacción de aglutinación a un volumen
constante de antisuero diluido seriadamente, se le agrega una cantidad
constante de una suspensión de partículas que tienen determinantes antigénicos
intrínsecos o extrínsecos, se mezclan los reactantes y después de un periodo de
tiempo se observa la reacción. Esta técnica puede realizarse en tubo o lamina y
el título está dado por la dilución más alta que presenta aglutinación.

Clasificación de las reacciones de aglutinación:

A. Aglutinación directa: la aglutinación que comprende determinantes
antigénicos que son constituyentes intrínsecos de la partícula.

B. Aglutinación indirecta: la aglutinación que involucra determinantes

antigénicos que no son constituyentes intrínsecos de la partícula y que necesitan
de un acoplador para unirse a ella.

DETERMINACION DE PROTEINA C REACTIVA

Fundamento: el suero diluido del paciente que contiene PCR, se hace

reaccionar con anti-PCR mono específico adsorbido sobre partículas de látex, su
unión produce una aglutinación visible macroscópicamente.
La proteína C reactiva es una proteína termolábil, no atraviesa la barrera
placentaria y su movilidad electroforética se encuentra entre la zona de las L Y B
globulinas. Su nombre se debe a la capacidad de precipitar los polisacáridos C
de los pneumococcos. Es una de las proteínas de fase aguda y se incrementa en
el suero en una gran variedad de enfermedades inflamatorias o como respuesta
a necrosis tisular.
La PCR se encuentra comúnmente aumentada en artritis reumatoide activa,
infecciones virales, tuberculosis, fiebre reumática, infarto agudo al miocardio,
infecciones por organismo gram negativos y gram positivos. También se puede
hallar después de una operación quirúrgica y luego de trasfusiones sanguíneas.
La determinación de PCR no solo indica la intensidad de la enfermedad si no
la respuesta del paciente a un tratamiento dado.
Técnica:
Materiales:
 Reactivo de látex, recubierto con anti-PCR monoespecífico.
 Control negativo.
 Control positivo.
 Solución de buffer glicina, ph 6,2.
 Placas de vidrio de fondo oscuro.
 Pipetas Pasteur.
 Goteros.
 Palillos de madera.
 Cronómetro.

Equipos:
 Agitador de Manzini.

PROCEDIMIENTO:
1. Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.
2. Preparar diluciones 1:20 de cada una de las muestras con el buffer.
3. Colocar en cada círculo de la placa 1 gota de control: positivo,
negativo, muestras diluidas.
4. Agregar a cada una de ellas una gota del reactivo látex previamente
mezclado.
5. Mezclar con un palillo diferente cada uno de los círculos.
6. Llevar las láminas al rotador de Manzini por 3min a 180rpm.
7. Realizar la lectura: NEGATIVO= SUSPENSION HOMOGENEA.
POSITIVO= SUSPENSION HETEROGENEA.

La PCR es una reacción Antígeno-Anticuerpo que se observa mejor cuando

los anticuerpos y los antígenos están en concentraciones óptimas. Los niveles
encontrados enel suero pueden presentar variaciones grandes entre pacientes, o
de un dio para otro en el mismo paciente cuando el contenido de antígeno en el
suero es muy grande pueden ocurrir reacciones falsas negativas, con sueros sin
diluir por el efecto prozona. Los sueros verdaderamente negativos no aglutinan
en ninguna dilución de la prueba.
 Para observar el aumento o descenso de los niveles de PCR a todo suero
positivo deber practicársele la reacción cuantitativa.
PRUEBA CUANTITATIVA:
 Seguir realizando diluciones de los sueros a partir de la 1:20, hasta 1:80.
 Coloque una gota de cada dilución en los círculos de la lámina.
 Agregue una gota de reactivo de látex a cada uno de ellos.
 Mezcle con un solo pasillo comenzando desde la última dilución hasta la
primera.
 Lleve la lámina al agitador de Manzini por 3min.
 Realizar la lectura.

DETERMINACION DE FACTOR REUMATOIDE

INTRODUCCION
La prueba en lámina para efectuar el factor reumatoide, es usada como
criterio diagnóstico de artritis reumatoide. La artritis reumatoide es un síndrome
crónico de etiología desconocida, caracterizado por una inflamación inespecífica
y generalmente simétrica de las articulaciones, que a veces evoluciona hacia la
destrucción de las estructuras articulares y periarticulares.
En la articulación enferma se observa un engrosamiento de la membrana
sinonvial con formación de pliegues y proliferación de linfocitos. Estas células
que forman folículos linfoides son las responsables de la síntesis de factores
reumatoideos y otras inmunoglobulinas.
Fundamento: el factor reumatoide de tipo inmunoglobulina M (anticuerpo),
se detecta en presencia de gamma-globulina o fracción II de Cohn (antígeno)
adsorbida sobre un soporte inerte de látex poliestireno produciendo una
aglutinación visible macroscópicamente.

Técnica:
Materiales:
 Antígeno de látex-globulina.
 Control negativo.
 Control positivo.
 Solución de buffer glicina, ph 6,2.
 Placas de vidrio de fondo oscuro.
 Pipetas Pasteur.
 Goteros.
  Palillos de madera.

Equipos:
 Agitador de Manzini.
PROCEDIMIENTO:
1. Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.
2. Preparar diluciones 1:20 de cada una de las muestras con el buffer.
3. Colocar en cada círculo de la placa 1 gota de control: positivo, negativo,
muestras diluidas.
4. Agregar a cada una de ellas una gota del reactivo látex-globulina
previamente mezclado.
5. Mezclar con un palillo diferente cada uno de los círculos.
6. Llevar las láminas al rotador de Manzini por 3min a 180rpm.
7. Realizar la lectura:
NEGATIVO= SUSPENSION HOMOGENEA.
POSITIVO= SUSPENSION HETEROGENEA.

Prueba cuantitativa en tubo:

Se practica en sueros que presenten una reacción positiva en lámina.
 A partir de la dilución preparada 1:20, realice diluciones hasta 1:80.
 Coloque 1 gota de las diluciones en los círculos de la lámina.
 Agregue una gota del reactivo de látex-globulina.
 Mezcle con un palillo comenzando desde la última dilución hasta la
primera.
 Lleve al rotador de Manzini por 3min.
 Realice la lectura.

Para diagnóstico de AR la prueba se considera positiva cuando se observa

aglutinación de 1:80 en adelante.
REACCION DE AGLUTINACION INDIRECTA EN PLACA:

POSITIVO= SUSPENSION HETEROGENEA (POZOS 1 Y 2)

NEGATIVO= SUSPENSION HOMOGENEA (POZO 3)

ANTÍGENOS FEBRILES

FUNDAMENTOS DEL METODO: El suero del paciente se pone en contacto

con antígenos específicos. En este caso se utilizan suspensiones de Sal-
monellas o Brucellas muertos. Si la muestra contiene los anticuerpos
correspondientes se producirá una aglutinación visible macroscópicamente.

REACTIVOS

Antígenos Febriles Salmonella: suspensión en solución salina con

conservantes apropiados, conteniendo los siguientes antígenos bacterianos:
- Antígenos Paratyphoid A (Salmonella, antígeno flagelar a).
- Antígenos Paratyphoid B (Salmonella, antígeno flagelar b).
- Antígenos Typhoid H (Salmonella, antígeno flagelar d).
- Antígenos Typhoid O (Salmonella, antígeno somático D).
Antígenos Febriles Brucella: suspensión de antígenos bacterianos
(Brucella abortus, cepa 1119-3) en solución fisiológica con conservantes
apropiados. La concentración celular de los antígenos se encuentra entre el 4 y
el 6%. Las bacterias utilizadas se encuentran en fase lisa.
Antígenos Febriles Controles:
- Control Positivo: dilución de suero humano inactivado positivo.
- Control Negativo: dilución de suero humano negativo.

MATERIALES
- Placa de vidrio
- Micropipetas
- Tubos de hemólisis
- Varilla
- Reloj o timer

PROCEDIMIENTO
I- TECNICA RAPIDA EN PLACA
1) Colocar en una placa una gota (50 ul) de suero y agregar una gota (50
ul) de suspensión de Antígeno. 870090000 / 00 p. 2/6
2) Mezclar y agitar la placa en forma circular durante 2 minutos.
3) Observar la presencia o ausencia de aglutinación utilizando una luz
indirecta sobre fondo oscuro.
II- TITULACION RAPIDA EN PLACA
1) Dividir una placa de vidrio en sectores de 4 cm2 aproximadamente.
2) Empleando las micropipetas apropiadas colocar en estos sectores 80
ul, 40 ul, 20 ul, 10 ul y 5 ul de suero límpido. Repetir el procedimiento
para un control negativo y uno positivo.
3) Colocar 1 gota de Antígeno previamente agitado sobre cada gota de
suero.
4) Mezclar el suero y el Antígeno utilizando una varilla abarcando un
área de 2 cm de diámetro aproximadamente. Debe emplearse una
 varilla distinta para cada dilución de suero o la misma varilla
mezclando a partir de la muestra más diluida.
5) Agitar la placa durante 2 minutos en forma circular.
6) Observar la aglutinación utilizando luz indirecta sobre fondo oscuro.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
4+: todos los microorganismos aglutinan.
3+: aglutinan aproximadamente el 75%.
2+: aglutinan aproximadamente el 50%.
1+: aglutinan aproximadamente el 25%.
Negativo: no aparece aglutinación.
Técnica I: se indica solamente positivo o negativo.
Técnica II: el título se considerará la última dilución que da aglutinación del 50%
(++).

ASO
Prueba de látex para la determinación de antiestreptolisina O en suero

SIGNIFICACION CLINICA: El anticuerpo antiestreptolisina O se encuentra

presente en casi todas las personas en títulos bajos, debido a que las infecciones
estreptocócicas son comunes. Sin embargo un título alto o creciente de
antiestreptolisina O, indica una infección reciente producida por un estreptococo
beta hemolítico de grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal,
erisipela.

FUNDAMENTOS DEL METODO: Los anticuerpos antiestreptolisina O se detectan

en suero por su reacción con la estreptolisina O adsorbida sobre soporte inerte de
látex. Los anticuerpos antiestreptolisina reaccionan con la estreptolisina
produciendo una aglutinación visible macroscópicamente.

REACTIVOS PROVISTOS
A. Reactivo A: suspensión de partículas de látex poliestireno recubiertas
con estreptolisina O.
Control Positivo: suero humano conteniendo antiestreptolisina O en
concentración superior a 250 UI/ml.
Control Negativo: suero humano no reactivo con el Reactivo A.

MATERIALES
- placas de plástico o vidrio fondo negro
- goteros o pipetas para dispensar los volúmenes indicados.
- palillos mezcladores descartables
- cronómetro
- lámpara o fuente de luz
- tubos de Kahn

PROCEDIMIENTO
Llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente. Agitar el Reactivo
A antes de usar, vaciando previamente la pipeta del gotero.

I- TECNICA CUALITATIVA
1) En uno de los sectores delimitados de la placa adjunta al equipo
colocar: Reactivo A 1 gota (50 ul) Muestra 1 gota (50 ul)
2) Mezclar con palillo descartable (uno para cada muestra) hasta
obtener una suspensión uniforme en la superficie delimitada de la
placa. Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear
suavemente la placa y observar macroscópicamente el resultado
dentro de los 2 minutos.
II- TECNICA SEMICUANTITATIVA
Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas en
tubos de Kahn.870150000 / 03 p. 2/6
1) Colocar 0,5 ml de solución fisiológica en cada uno de los tubos.
2) Agregar 0,5 ml de suero al tubo No 1 y mezclar. Transferir 0,5 ml de
esta dilución al tubo No 2 y mezclar, continuando así las diluciones
hasta el último tubo. Las diluciones así obtenidas equivalen a 1:2,
1:4, 1:8, 1:16, etc.
3) Ensayar cada dilución según técnica I.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
Técnica cualitativa
Negativo: suspensión homogénea.
Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. Se califica de 1
a 4 +, siendo:
4+: aglutinación franca
3+: moderada aglutinación
2+: ligera aglutinación
1+: aglutinación débil
Técnica semicuantitativa
Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación
visible macroscópicamente.
El nivel aproximado de antiestreptolisina O en la muestra, puede ser
calculada por la fórmula siguiente:
ASO (UI/ml) = Título x Sensibilidad de la reacción (200 UI/ml)
Ejemplo: la muestra presenta un título de 1:2. El nivel de ASO es de 2 x
200 = 400 UI/ml