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Problemas Cinetica Enzimatica

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: PROBLEMAS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA

Los alumnos deben repasar todos los conceptos de cinética enzimática, tanto de las clases teóricas como de los prácticos de enzimología 1, 2 e isoenzimas. Asimismo, deben practicar la resolución de problemas. Los que se incluyen en esta guía son algunos ejemplos resueltos que se discutirán en clase práctica, pero se sugiere la resolución de los otros problemas propuestos en la guía y la interpretación de los gráficos resultantes de los prácticos anteriores. Traer calculadora, papel milimetrado y otros elementos necesarios la resolución de problemas.
Problema 1: 1- Un sustrato S se transforma por una enzima, y la velocidad de desaparición se mide cada 30 seg. durante 3 min. Se preparó en tubos de ensayo una serie de seis tubos con 1.5 µg de enzima (peso mol 30,000) añadiéndose un mismo volumen de disolución de sustrato a distintas concentraciones. Los resultados están resumidos en la tabla. ¿Cuáles son las velocidades iniciales para cada tubo con distinta concentración de sustrato? Tiempo (min)
0

0.5 1 1.5 2.0 2.5 3 Conc. Inicial (µmoles ml-1)

S 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.0

1

S 0.49 1.05 1.66 2.23 2.81 3.40 2.32

2

S 0.71 1.52 2.36 3.18 4.00 4.55

Sustrato transformado (µmol) 3 4 S S 1.10 1.36 2.24 2.74 3.48 12.66 38.50

5

S 1.45 3.00 200.00

Solución: Paso 1. Corregir cada lectura sustrayendo el cambio aparente en la disolución testigo (0S) en el tiempo correspondiente.
1

S 0.4 9 0.9 5 1.4 6 1.9 3 2.4 1 2.9

2

S 0.7 1 1.4 2 2.1 6 2.8 8 3.6 -

3

S

4

1.1 2.1 4 3.2 8 -

S 1.3 6 2.6 4 -

5

S

1.45 2.90 -

Paso 2. Representar µ moles de sustrato transformado para cada concentración frente al tiempo (Figura). Trazar la mejor recta para cada serie de puntos. 1

Sustrato (M x 103) 2 .00 x x x x x 10-3 M 10-3 M 10-3 M 10-3 M 10-3 M 1 V= 0.55 3 [ S] 12.95 µmol min-1 2 V= 1.66 [4S] 38. Estos valores serán las pendientes de las porciones lineales y serán también las velocidades iniciales.50 [5S] 200.32 2 [ S] 4.90 µmol min-1 Estos valores se representan unos frente a otros Velocidad inicial (µmol min-1) Conc. [1S] 2.44 µmol min-1 3 V= 2.64 µmol min-1 5 V= 2.31 µmol min-1 4 V= 2.4 S Sustrato transformado (µmol) 5 S 3 S 2 S 1 S Tiempo (minutos) De esta figura determinar la velocidad de sustrato transformado por minuto para cada concentración de sustrato en el tramo lineal de cada curva.

1 Km 0.1 [S] [S] .Problema 2: v0 = Vmáx [S] Km + [S] Utilizando la ecuación de Micaelis-Menten. Problema 3: Las velocidades iniciales a varias concentraciones de sustrato para una reacción catalizada por una enzima hipotética son: [S] (moles/l) V (µmoles/min) 5x10-2 0. calcular el cambio en la [S] necesaria para aumentar la velocidad de una reacción del 10 al 90 % de la velocidad máxima.20 -6 5x10 0. 0. [S]90% = 9 Km = 81 [S]10% Km/9 Es decir.1 Km 9 [S] = Km Es decir.25 5x10-3 0.25 -4 5x10 0.071 5x10-7 0.1 [S] = 0.1 Km + [S] [S] = (Km + [S]) . Poniendo entonces [S] = Km / 9 v0 = 0.1 Km + 0. SOLUCIÓN Poniendo v0 = 0.1 [S] = 0.0096 a) ¿Cuál es la velocidad máxima para esta reacción? b) ¿Por qué la velocidad inicial permanece constante a una [S] mayor de 5x10-4 M c) ¿Cuál es la concentración de enzima libre para una [S] de 5x10-4 M? d) ¿Cuál es la Km de la enzima? e) Calcular la velocidad inicial para [S]=1x10-6 3 .0.9 [S] = 0. se debe aumentar la [S] 81 veces.1 Vmáx Entonces [S] = 0.25 5x10-5 0.9 Vmax encontramos que [S] = 9 Km.

b) Porque todos los enzimas está ocupados transformando un sustrato.00 0. obtenemos una Km 0 1. SOLUCIÓN a) Vmax = 0. utilizando la velocidad 0.42 150 8.25 x 10-5 moles/l.25 x 5 = 1.25 x 102 µmol/l Problema 4: Se estudió la actividad de la enzima ureasa. e) Sabiendo la Km y Vmax.18 0. 0.01 0. 1/V inicial frente a 1/[S].12 0.37 ¿Cuáles son los valores de Km y Vmáx para esta reacción? SOLUCIÓN Los datos se ordenan en la forma adecuada para una gráfica lineal (por ejemplo. En 5 min 0. La gráfica de la doble inversa se indica en la Figura. Problema 5: 4 . luego 1.53 100 7. como sabemos la Vmax.25 µmol/min.06 0. 60 5.0096 y sus correspondientes [S].25 µmol/min.25 µmol/min.y [S]=1x10-1 f) Calcular la concentración de producto formado en los cinco primeros minutos de reacción utilizando 10 ml de una disolución de sustrato 2x10-3 M.25 µmol / 10-2 l = 1.04 0.94 250 10. que cataliza la reacción: CO(NH2)2+H2O <=> CO2+2NH2 en función de la concentración de urea. f) A [2x10-3] la V = Vmax = 0. con los resultados siguientes: Concentración de urea (mmoles dm-3) 30 -1 -1 V inicial (mmoles urea consumidos min mg enzima ) 3.20.02 3 0.03 -1 0.70 400 12. todos los enzimas ocupados.018 µmol/min y V = 0. aplicamos Michaelis utilizando esas [S]. ya que por encima de [S] de 5x10-4 no aumenta.00 0. Observar la distribución de los puntos y tener presente cuando se eligen los valores adecuados para la concentración de sustrato al planificar un experimento.070 ó 0. a esa [S] se da la Vmax. c) Cero. De la gráfica se puede calcular que Km es 105 mmoles dm-3 y la Vmáx es 15.04 1/[urea] (dm mmoles ) Ejemplo resuelto de acuerdo con el método de doble inversa o de Lineweaver-Burk.2 mmoles urea consumidos mg-1 min-1.30 1/Vinicial (mg min mmoles ) -1 0. y obtenemos: V = 0. d) Empleando la ecuación de Michaelis.25 µmol.24 0. Tenemos 10 ml de sustrato. aunque existen otras formas de linealizar que no son motivo de nuestro estudio).

40 0.1 (mmol L -1) sin ihnhibidor. B) De la intersección en el eje 1/ν0 se puede estimar Vmax= 1(µmol L -1 min-1) y de la intersección con el eje 1/[S]0 los valores de Km=0.2(mmol L -1) con 0.5 1.5(mmol L -1) de inhibidor y Km=0.50 A) ¿De que manera actúa el inhibidor? B) Obténgase los valores para Vmáx.5 (mmol L-1) [I ] 1.0 Velocidad de reacción ν0 (µmol L -1 min-1) 0.33 0.0 (mmol L-1) 0 -15 -10 -5 0 5 10 -1 -1 15 20 25 -1/Km 1/[S] 0 [(mmol L ) ] Gráfica de Lineweaver-Burk del efecto de un inhibidor A partir de la gráfica se puede observar que la pendiente de las curvas se modifica con los cambios en la concentración del inhibidor pero no la intersección en el eje 1/ ν0 (1/Vmax).71 0.50 0.40 0. Km=0.50 0.Se investigó el efecto de un inhibidor I sobre la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente sobre un solo sustrato.83 0.63 0.05 0.67 0. obteniéndose los siguientes resultados Concentración de sustrato (mmol L -1) Concentración del inhibidor (mmol L -1) 0 0. y Km. Por ello los datos anteriores indican que el inhibidor I está actuando como un inhibidor competitivo. SOLUCIÓN A) La manera más sencilla de deducir cómo actúa un inhibidor es graficar 1/ν0 en función de 1/[S]0 para cada concentración del inhibidor.25 0.80 0.20 0.57 0.33 0. 8 7 1 1/ν 0 (µ mol L -1 min-1 ) 6 5 4 3 2 1 0 0.10 0.5 1/Vmáx [I ] 0 (mmol L-1) [I ] 0.67 0.3 (mmol L -1) con 1(mmol L-1) 5 .14 0.20 0.

PROBLEMAS PARA RESOLVER Problema 7: Calcular qué velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la velocidad máxima es igual a 100 y la concentración de sustrato es a) 10 Km b) Km/3.: 0.23 10 0.5x103 µg/h y Km = 5 mM.14 0.: los valores de Km son los mismos Problema 10: La fructosa difosfatasa (que cataliza la hidrólisis de la fructosa difosfato a fructosa-6-fosfato y fosfato) es inhibida por AMP. Determinar la Km y la velocidad máxima. o a especies distintas de la enzima propias de cada órgano.4 · 10 -4 M se ensaya con una concentración de sustrato de 2·10 -7 M.50 0. [S] mM µg producto/h µg producto/h (sin inhibidor) (6 mM inhibidor) 2 139 88 3 179 121 4 213 149 10 313 257 15 370 313 SOLUCIÓN Se calculan los inversos de [S] y de v. ensayado siempre bajo idénticas condiciones en 1 ml de volumen total incluyendo 0. calcular la velocidad inicial en el caso anterior. Uno de los sustratos. Sin inhibidor: Vmax = 0. Sol.107 µmol/min Problema 9: Se detectó actividad de una determinada enzima en extractos de hígado y cerebro. Si la velocidad media para esta reacción con una concentración de sustrato de 5·10 -2 M fue 0.1 ml de extractos de cada órgano.39 0. Con inhibidor: Vmax es la misma y Km=9 mM.128 mmoles/min.14 5 0. Sol. producto sin inhibidor y producto con inhibidor y se representa.: a) 91 %. y muéstrese cuáles de ellas son de interés en relación con la cuestión de la identidad de las dos enzimas. Para dilucidar si la actividad detectada era atribuible a la misma enzima presente en ambos órganos. determinar de que manera está actuando el inhibidor. resultó ser transformado a las siguientes velocidades iniciales: Concentración de sustrato Velocidad (µmoles/min) (µmoles/ml) Hígado Cerebro 1 0. Sol.23 0. b) 25% Problema 8: Una enzima cuya Km es 2.085 2 0.Problema 6: A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática.30 Den las características de la enzima que puedan ser determinadas a partir de estos datos. Los siguientes datos se obtuvieron a partir de un estudio de la enzima del hígado de rata: FDP (µmoles ml-1) 4 6 10 20 40 6 . se llevaron a cabo estudios cinéticos con distintos sustratos.

41 V (nmol P/min) con J 0. Sol.125 0.008 Km (M) 0.41 0.8 9. b) Que tipo de inhibidor es J? c) Cuál sería el efecto sobre la Vmax de la enzima. se decidió hacer un estudio estructural y cinético de dicha enzima: [A] mM 1.5 µmol/min c) KM = 1. Mx10-5 0.0 40.20 donde J es un inhibidor de E cuya influencia como tal se quiere estudiar.0 33.006 0.5 22. Por otra parte.034 0. Vmáx sin inhibidor 0.8 6.4 14. la Km varía según se muestra en esta figura: El ensayo fue realizado en presencia de 0.25 0.5 8. ¿Qué velocidad inicial se esperaría para pH 5. Sol.5 V(µmol/min) con inhibidor 10-4 M 2.5 mM c) KM’ = 1.66 0.AMP (µmoles ml-1) Velocidad inicial (µmoles ml-1 min-1) 0 0. un aumento de la concentración de J? Solución: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4 a) Vmax = Vmax’ = 1.185 µ moles ml-1 min-1.5 y 8? Explique.1 Solución: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4 a) Vmax = 50 µmol/min b) Vmax’ = 9.056 0.004 0.150 8 0.25 mM (con inhibidor) (Inhibición Competitiva) Problema 13 La cinética de una enzima viene determinada como función de la concentración de sustrato en presencia y ausencia del inhibidor I.043 0. Vmáx con inhibidor 0.55 0.071 0. a) Calcular la Km de la enzima estudiada para A.5 1. [S]. y Vmax para la transformación A--P en presencia de E.002 0.083 Comentar estos resultados en relación a las constantes cinéticas en cada caso.25 0.000 5 6 7 8 9 pH Habiéndose conseguido aislar de Salmonella typhimurium una enzima (E) que cataliza la reacción A→P.: Para pH 5.102 µ moles ml-1 min-1 Problema 11: Una determinada enzima cataliza la reacción A ↔ B.5: 50 µ moles/min/µ g de enzima Para pH 8: 100 µ moles/min/µ g de enzima Problema 12: 0.00 0.059 0. [J] = 0.01 M sustrato.1x10-5 M 7 .25mM. Se ha observado previamente que la Vmáx de esta reacción no varía dentro de un rango de pH entre 5 y 9: Vmáx= 100 µmoles/min/µg de enzima.: Km 8 µ moles ml-1.5 a) Calcular la Km y la Vmax en presencia y ausencia de inhibidor b) Que tipo de inhibidor es? 3.66 mmol P/min b) KM = 0.076 0.0 V(µmol/min) sin inhibidor 10.50 0.3 0. en cada uno de los bufferes.9 4.101 0. y 1 µg de enzima.010 0.20 V(mmol P/ min) 1.71 0.00 0.1 2.

La siguiente tabla muestra los datos obtenidos: [S] (mM) v (µmol/min) v (Ia) (µmol/min) v(Ib) (µmol/min) 0. Problema 22 Una reacción enzimática se lleva a cabo a diferentes concentraciones de sustrato en ausencia y presencia de dos inhibidores diferentes: [Ia] = [Ib] = 1. Calular Vmax y ctividad específica de la enzima.8 µg/ml.18 2. No Competitiva Problema 14 ¿Qué relación numérica existe entre Km y [S] cuando una reacción enzimática alcanza el 87 % de la Vmax? Problema 15 100 ug de una enzima a 25 °C descomponen en 10 min el 1% de un sustrato 0.1 M. ¿Cuál será la velocidad inicial a las concentraciones de sustrato: a) 3.6 3. siendo su Km para el sustrato de 0.2x10-6 M? Problema 21 Calcular Km y Vmax de una enzima sabiendo que la recta obtenida en una representación de Lineaweaver y Burk corta el eje de ordenadas en 5x103 (moles/min)-1.10 -5 M. ¿Qué cantidad de sustrato se logrará transformar en 10 min? Problema 18 La KM para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1. en 6 min la mitad del sustrato había reaccionado. Problema 19 Calcular que velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la velocidad máxima es igual a 100 y la concentración de sustrato es igual a) 10 Km y b) Km/3. y que la pendiente de dicha recta es 120 min/L.63 1.4 0.43 2. calcular la Vmax y la cantidad de producto formado en 10 min de reacción. Si la ponemos en presencia de una concentración 500 mM de sustrato.5 mM.81 8 .01M. Problema 17 Una enzima cataliza una reacción con una velocidad máxima de 5 µmoles por minuto.48 5.16 0.1 3. Problema 20 Una enzima cataliza una reacción a una velocidad de 35µmoles/min cuando la concentración de sustrato es 0.44 6. Si la Km para el sustrato es 5x10 -3 M.3x10 -2 M.86 4. d) 2x10-6 M y e) 1.83 1. c) 2x10-4 M.5 mM.22 3.67 2. La KM para el sustrato es 2x10 -5 M. b)4x10-4 M. La misma cantidad de enzima descompone en 1 min el 10% de un sustrato 10 -3 M.5x10-3 M.2 0.8 1.08 3.62 0.15 7. Si la concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59.d) Inh. ¿Qué proporción de enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol). Problema 16 Una enzima se ensayo con una [S] inicial de 2.2 1.

370 0.526 0.000 0.a) determinar todos los parámetros cinéticos de la enzima.714 0.3 80 74. Problema 25 1. pero con distintas concentraciones iniciales de sustrato obteniéndose las velocidades iniciales que se indican [S] x10-3 (mM) v (nmol/min) 303 120 149 98 128 92.500 v (µmol CO2/2 min) 0. corta el eje de las abscisas en -40 Litros/mol? Problema 26 La Km para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1.6 Determine la Km y Vmax y exprese también la cantidad de enzima en UI/mL.250 0. Problema 24 La descarboxilación enzimática de β-cetoácido procede con las velocidades iniciales para las concentraciones que se citan: [cetoácido] (mM) 2. b) ¿Qué tipo de inhibidor es Ia e Ib? Problema 23 25 µL de una preparación de Ribonucleasa A se lleva a ensayo a un volumen de reacción estándar de 1 mL y a temperatura y pH óptimos.588 Determine la Km y Vmax. Si la concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59.3x10 -2 M.252 ¿Qué información puede obtenerse a partir de una representación gráfica del método de Lineaweaver & Burk cuando la recta obtenida.6 100 83. ¿Qué proporción de enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol) 9 .8 µg/ml.500 0. convenientemente extrapolada.417 0.

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