EXPERIMENTACIN EN QUMICA ANALTICA .

4 Curso de Licenciatura en Qumica

PRCTICA 4
DETERMINACIN ENZIMTICA DE GLUCOSA Y SACAROSA EN ALIMENTOS 1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS DE LA PRCTICA. Desde un punto de vista analtico, la capacidad de los enzimas para catalizar reacciones especficas con un alto grado de eficacia, ha dado lugar a diferentes aplicaciones en diversos campos del anlisis como anlisis clnicos, anlisis de productos alimentarios, anlisis de preparados farmacuticos etc. El anlisis enzimtico o anlisis mediante el empleo de enzimas puede ser utilizado en: 1. La determinacin de los sustratos de la reaccin enzimtica, siendo posible determinar especficamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad de separar. Para la cuantificacin de sustratos se pueden utilizar dos mtodos generales: a. Mtodos de cambio total, de equilibrio o de punto final. En este tipo de mtodos (los ms utilizados en la prctica) se permite que la reaccin enzimtica se complete o llegue al equilibrio y se mide la variacin producida en la concentracin de un producto de reaccin o de un reactivo presente inicialmente en exceso. b. Mtodos cinticos, en los que se utilizan medidas de la velocidad inicial de la reaccin enzimtica para deducir la concentracin inicial de sustrato. Los procedimientos de medida son idnticos a los utilizados para reacciones catalticas en general. 2. Determinacin de los mismos enzimas mediante el empleo de mtodos cinticos en los que se mide la velocidad de desaparicin del sustrato o de generacin del producto, relacionada con la concentracin de enzima en disolucin. 3. Determinacin de otras sustancias mediante el empleo de reactivos marcados con enzimas: enzimoinmunoanlisis. El objetivo de esta prctica es determinar el contenido de glucosa y sacarosa en un zumo empleando para ello un mtodo enzimtico espectrofotomtrico de tiempo fijo. Se trata de certificar la autenticidad de un zumo de fruta comercial. El volumen de un

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zumo natural puede aumentarse simplemente agregndole agua. Otras formas ms sofisticadas de adulteracin incluyen la adicin de azcares y cidos para producir disoluciones con composicin similar a la del producto autntico. En cualquier caso se altera la relacin especfica de azcares con respecto a la del producto natural. En el anexo se facilita una tabla en la que se resumen los requerimientos de calidad para jugos segn la organizacin AIJN (Association of the Industry of Juices and Nectars from Fruits an Vegetables ). 2. FUNDAMENTOS Aunque la glucosa puede determinarse por mtodos qumicos, estos en su mayora carecen de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacridos. Tanto en anlisis clnicos como en la industria alimentaria se utilizan mtodos enzimticos para la determinacin de glucosa. As la glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente especfica que cataliza la oxidacin de la glucosa a -Dgluconolactona, sin que ningn otro azcar natural reaccione en extensin apreciable.
GOD

C6H12O6

+ O2

C6H10O6 + H2O2

Esta reaccin en la que se consume oxgeno podra seguirse manomtricamente o mediante un electrodo de oxgeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reaccin espectrofotomtricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reaccin enzimtica indicadora adecuada. Para la determinacin colorimtrica de glucosa por el mtodo de la oxidasa, se aade al medio peroxidasa de rbano silvestre (HRP), que elimina el perxido de hidrgeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante adecuado segn el siguiente esquema de reaccin:
HRP

H2O2 + Aceptor de oxgeno (DH2)

Producto coloreado

+ H2O

(D)

Se podran utilizar como aceptores de oxgeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin embargo, la naturaleza carcinognica de estos compuestos ha impulsado la bsqueda de aceptores alternativos. Uno de estos sistemas es la 4-aminoantipirina que reacciona con el fenol y el perxido de hidrgeno en presencia de HRP para formar un colorante con estructura de quinonaimina, que presenta un mximo de absorcin a 505 nm.

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CH3 CH3 N N

NH2 OH O + + H2O 2 HRP CH3 N N O + H2O CH3 N

Este mtodo, propuesto por Trinder (1) en 1972, ser el empleado en esta prctica para la determinacin de glucosa en un zumo. A continuacin se resumen las distintas reacciones acopladas que se utilizarn para la determinacin de la glucosa. La cantidad de colorante generada, y por tanto la absorbancia medida a 505 nm, ser directamente proporcional a la cantidad de glucosa.

GOD

HRP

Glucosa O2

H2O2
Gluconolactona
4-aminoantipirina + fenol

H2O Colorante

El disacrido sacarosa puede tambin determinarse especficamente basndose en el esquema de reacciones anterior, previa hidrlisis enzimtica del mismo con el enzima fructofuranosidasa o invertasa. Este enzima cataliza la transformacin de la sacarosa en una molcula de fructosa y una molcula de glucosa (azcar invertido). Se debe determinar la glucosa en la muestra antes y despus de la hidrlisis enzimtica, por diferencia se obtiene el contenido de sacarosa.

Invertasa

GOD

HRP

Sacarosa

Glucosa Fructosa O2

H2O2
Gluconolactona
4-aminoantipirina + fenol

H2O Colorante

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3. MATERIAL, REACTIVOS, INSTRUMENTACIN a. Instrumentacin Espectrofotmetro monohaz Spectronic 20 con cubetas de 1 cm de paso de luz. b. Material 4 matraces de 100 ml 8 matraces de 50 ml 1 vaso de 250 ml, 2 vasos de 100 ml 1 embudo, papel de filtro, vidrio de reloj. Cronmetro

c. Reactivos Reactivo Trinder: Disolucin que contiene todos los reactivos necesarios para la determinacin de la glucosa por el mtodo propuesto en las concentraciones que se indican a continuacin: 4-aminoantipirina 0,3 mmol/L Fenol 8,5 mmol/L Glucosa oxidasa (GOD) obtenida de Aspergillus Niger 10 U/mL Peroxidasa de rbano silvestre (Horseradish peroxidase, HRP) 0,3 U/mL

Estos reactivos, en las cantidades adecuadas, se suministran en una disolucin reguladora de pH 6,6 lista para su uso. Esta disolucin debe almacenarse en botellas color topacio y en el refrigerador. Si se mantiene entre 2 8 C la disolucin estable durante 2 meses. Disolucin de invertasa 100 U/ml en tampn de citrato 0,1 M de pH 4,6. Preparar 50 mL Disolucin patrn de glucosa 0,01 M Disolucin Carrez I. Disolver en agua 3,6 g de ferrocianuro potsico y llevar a 100 mL. Disolucin Carrez II. Disolver en agua 7,2 g de acetato de zinc y llevar a 100 mL

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4. PROCEDIMIENTO Se emplear un mtodo de tiempo fijo para la cuantificacin de glucosa y sacarosa en una muestra de zumo comercial. Para la construccin de la lnea de calibrado deben prepararse cinco disoluciones de glucosa de concentraciones comprendidas entre 510-5 M y 510-4 M por dilucin del patrn de glucosa. Aadir a la cubeta del espectrofotmetro 1 mL de reactivo Trinder y 250 L de patrn, mezclar e incubar exactamente 5 minutos a temperatura ambiente. Medir a continuacin la absorbancia de la mezcla de reaccin a 505 nm frente a un blanco de reactivos. Para la determinacin de glucosa y sacarosa en la muestra, esta se diluir con agua en la proporcin adecuada segn el contenido de glucosa y sacarosa esperado. Las muestras turbias deben tratarse con los reactivos Carrez y filtrarse. Para ello pipetear 2 mL de muestra en un vaso que contenga unos 30 mL de agua, aadir 2,5 mL de disolucin Carrez I y 2,5 mL de disolucin Carrez II. Filtrar, recoger cuantitativamente en un matraz de 100 mL y llevar a volumen. Para la determinacin del contenido de glucosa, se proceder con la disolucin diluida de la misma manera que con los patrones de glucosa. Para determinar el contenido de sacarosa se llevar a cabo en primer lugar su hidrlisis enzimtica a glucosa y fructosa (inversin) con invertasa. Para ello se toman 2 mL de la disolucin de muestra (con un contenido mximo de sacarosa de 1 g/L) y se mezclan con 8 mL de la disolucin de invertasa. Se incuban 15 minutos a 55 C. La suspensin fra se filtra, se lava el filtro y se recoge cuantitativamente en un matraz aforado enrasando con agua hasta la marca, realizando a continuacin la determinacin del contenido total de glucosa segn el procedimiento anteriormente descrito. El contenido de sacarosa se obtiene por diferencia entre las concentraciones de glucosa obtenidas antes y despus de la inversin enzimtica. Expresar el contenido de glucosa y sacarosa en la muestra en g/L. 5. BIBLIOGRAFA 1. D. Barham, P. Trinder; Analyst,1972, 97, 142-145

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Extracto del Cdigo de Prcticas del AIJN sobre requerimientos absolutos de calidad para zumos

cidos voltiles (g/L) Naranja Pomelo Manzana Uva Limn Tomate Maracuy Pera Damasco Grosella Cereza Frambuesa Fresa Mandarina Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4

Etanol (g/L) Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3

cido D/LLctico (g/L)

Max. 0.2 Max. 0.2 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.2 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.2

cido ascrbico (mg/L) Min 200 Min 200

cido ctrico (mg/L) 6.7-17 8-20 50-200 Max 0.5 45-63 2-5 25-50 Max 4.0 1.5-16 26-42 Max 0.4 9-22 5-11 6-22

cido Lcido cido Dmlico glutmico mlico (g/L) (mg/L) 0.8-3 0.2-1.2 Min 3.0 2.5-7 1.0-7.5 0.1-0.6 1.3-5.0 0.8-5 5-20 1-4 15.5-27 0.2-1.2 0.6-5 0.5-3 No No No No No No No No No No No No No No 75-205 80-235 10-200 20-150 160-400 300-800 20-70 0.27-1.36 40-220 20-150 20-250 60-200

Nitrato (g/L) Max 5 Max 5 Max 5 Max 5 Max 5 Max 20 Max 30 Max 10 Max 15 Max 15 Max 10 Max 10 Max 200 Max 5

Amonio Glucosa Fructosa Sacarosa (mg/L) (g/L) (g/L) (g/L)

Max 25.5

Sorbitol (g/L)

14-50

Min 150

Max 100 Max 140

Min 750

Max 150 Max 200

5-90

Min 100

20-50 20-50 15-35 60-110 3-12 10-16 20-55 10-35 15-50 23-50 35-70 15-38 15-35 10-40

20-50 20-50 45-85 60-110 3-11 12-18 20-53 50-90 10-45 30-65 32-60 18-45 18-40 10-40

10-50 5-40 5-30 Trazas 7.0 Max. 1 10-45 0-15 0-55 Max 5 Max 10 Max 10 20-60

2.5-7

10-25 1.5-10 10-35 Max 0.25