Cabronio 5.

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Medios de Cultivo y Pruebas Bioquímicas

Medios de Cultivo

INTRODUCCIÓN

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.

El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

Medios de Cultivo
Clasificación de los medios de cultivo basándose en su composición química
A.- Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.

B.- Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas. D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta.

Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); utilizando maltosa como única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.

E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.

Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).

F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.

Agar-Agar

Agar Nutritivo
Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.
Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona
Extracto de carne

Instrucciones 5.0
3.0

Cloruro de sodio
Agar

8.0
15.0

Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. 0.2

pH final: 7.3

Fundamento
Es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.

Características del medio: ámbar claro
a medio ligeramente opalescente.
Xanthomonas campestris

Base Agar Gelosa Sangre
Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observación de reacciones de hemólisis. También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate.

Fórmula (en gramos por litro)
Infusión de músculo de corazón 375.0

Peptona Cloruro de sodio
Agar

10.0 5.0
15.0

pH final: 7.3

0.2

Fundamento
La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis.

Características del medio
Medio preparado: ámbar. Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza.

E.M.B. Agar
Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121 C durante 15 minutos. Enfriar a 45 C y distribuir agitando suavemente.

Peptona Lactosa
Sacarosa

10.0 5.0
5.0

Fosfato dipotásico Agar
Eosina

2.0 13.5
0.4

Azul de metileno

0.065

pH final: 7.2

0.2

Fundamento
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.

Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes

Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes,

La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans

Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda. esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

Resultados
Microorganismos Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae

Tipo de Colonia Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado
Mucosas, rosa púrpura, confluentes

Proteus mirabilis Enterococcus faecalis
Shigella flexneri

Incoloras Incoloras, pequeñas, puntiformes
Incoloras

Salmonella typhimurium

Incoloras

Características del medio

Mac Conkey Agar
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona Pluripeptona
Lactosa

17.0 3.0
10.0

Mezcla de sales biliares Cloruro de sodio
Agar

1.5 5.0
13.5

Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Rojo neutro Cristal violeta

0.03 0.001
pH final: 7.1 0.2

Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.

Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Resultados
Microorganismos
Escherichia coli

Colonias
Rojas con halo turbio

Klebsiella pneumoniae Salmonella typhimurium
Shigella flexneri

Rosadas mucosas Incoloras, transparentes
Incoloras, transparentes

Proteus mirabilis Enterococcus faecalis

Incoloras, transparentes Diminutas, incoloras, opacas

Características del medio
Medio preparado: rojo púrpura

Estafilococo 110 Agar
Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva de estafilococos, en base a la producciónde pigmentos, la fermentación de manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.
Fórmula (en gramos por litro) Extracto de levadura Tripteína Gelatina Lactosa D-Manitol
Cloruro de sodio

Instrucciones

2.5 10.0 30.0 2.0 10.0
75.0 Suspender 149 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 C. Verter en placas y mezclar para dispersar el precipitado.

Fosfato dipotásico Agar

5.0 15.0

pH final: 7.0

0.2

Fundamento
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicación alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidos selectivos: Baird Parker Medio, Manitol Salado Agar, o Estafilococo Medio 110. En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para inhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp., lográndose así un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos. Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente, es que permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificación presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentación de manitol e hidrólisis de la gelatina.

Resultados
Observar las características de las colonias y realizar las pruebas de identificación de microorganismos. 1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura de bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el color desarrollado entre estas dos zonas. Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos permanece sin cambio. Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento bacteriano y la zona sin inocular.

2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis durante 10 minutos. Positiva: halo transparente alrededor de las colonias. Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.

Resultados
Microorganismo Pigmento Fermentación de manitol +
+

Hidrólisis de la gelatina +
+

Prueba de la coagulasa +
+

S. aureus
S. aureus

+
+

S. epidermidis

-

-

+

-

Características del medio
Medio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.

Sal y Manitol Agar
Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria. También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.
Fórmula (en gramos por litro)
Extracto de carne 1.0

Instrucciones
Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121 C durante 15 minutos. 0.2

Pluripeptona d-Manitol
Cloruro de sodio

10.0 10.0
75.0

Agar Rojo de fenol

15.0 0.025

pH final: 7.4

Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH.

Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura.

Resultados
Microorganismos
Staphylococcus aureus ATCC 25923

Crecimiento
Excelente

Características de las colonias
Amarilla

Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Bueno Inhibido Inhibido

Roja Inhibido Inhibido

Características del medio
Medio preparado: rojo

Salmonella Shigella Agar
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.
Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona
Extracto de carne

Instrucciones 5.0
5.0

Lactosa Mezcla de sales biliares Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Citrato férrico Agar
Verde brillante

10.0 8.5 8.5 8.5 1.0 13.5
0.00033

Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50 C y distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.

Rojo neutro

0.025 pH final: 7.0 0.2

Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro.

Resultados
Microorganismos Colonias

Salmonella typhimurium Shigella flexneri Shigella sonnei Proteus mirabilis Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterococcus faecalis

Transparentes, centro negro Incoloras Incoloras Transparentes, centro negro Rosadas a rojas Rosadas cremosas y mucosas
Incoloras, de muy escaso crecimiento

Características del medio
Medio preparado: rojo naranja.

A. Klebsiella pneumoniae. Acid + Lac + B. Escherichia coli .Acid + Lac + C: Salmonella sp..H2S D: Proteus mirabilis H2S E: Pseudomona aeruginosa

Mueller Hinton Agar
Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos. Además es útil con el agregado de sangre para el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.

Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones

Infusión de carne Peptona ácida de caseína
Almidón

300.0 17.5
1.5

Agar

15.0

Suspender 37 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber de 10 a 15 minutos. Calentar con agitación frecuente y hervir durante 1 minuto. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Enfriar a 45 -50 C y distribuir a cajas de Petri (o agregar los suplementos que se desee) hasta un nivel de 4 mm sobre una superficie horizontal (25-30 ml en placas de 9 cm de diámetro).
0.1

pH final: 7.3

Fundamento
El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), recomendó su uso en forma rutinaria para la realización del antibiograma en medio sólido, debido a una serie de factores : •presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad, •su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo, •la mayoría de los patógenos crece satisfactoriamente Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es útil para realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.

Resultados
Consultar en la sección “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”, la metodología apropiada.

Características del medio
Medio preparado: ámbar.

Chromobacterium violaceum

Pseudomona aeruginosa

Streptococcus pyogenes

Cerebro Corazón Infusión
Medio líquido adecuado para el enriquecimiento y cultivo de bacterias aerobias y anaerobias, de microorganismos exigentes como estreptococos, neumococos y otros microorganismos de difícil desarrollo. Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se utiliza este medio para el cultivo de hongos patógenos.
Fórmula (en gramos por litro) Infusión de cerebro de ternera
Infusión corazón vacuno

Instrucciones Suspender 37 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta disolver completamente. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Los tubos que no se usen inmediatamente deberán calentarse en un baño hirviendo para la eliminación del oxígeno retenido. Enfriar rápidamente sin agitar. 0.2

200.0
250.0

Peptona Cloruro de sodio
Glucosa

10.0 5.0
2.0

Fosfato disódico

2.5

pH final: 7.4

Fundamento
Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer. Los nutrientes de este caldo son muy apropiados para los hemocultivos, ya que en esta infusión desarrollan todas las especies de estreptococos excepto los tiol y piridoxal dependientes. Los estafilococos que crecen en esta infusión suelen dar mejores reacciones en la prueba de la coagulasa.
Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se inhibe la flora bacteriana cuando se utiliza este medio para el cultivo de hongos patógenos.

Resultados
Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea necesario, subcultivar en medios sólidos apropiados y realizar la identificación bioquímica.
Microorganismos
Neisseria meningitidis

Crecimiento
Bueno a excelente

Neisseria gonorrhoeae Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumoniae

Bueno a excelente Bueno a excelente
Bueno a excelente

Características del medio
Medio preparado: ámbar claro, sin precipitado.

왼왼uninoculated tube :

왼왼Neisseria meningitidis : 왼왼왼 : Strepcococcus pyogenes

Tetrationato Caldo.
Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

Fórmula (en gramos por litro) Peptona Sales biliares Carbonato de calcio
Tiosulfato de sodio

Instrucciones Suspender 46 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente y llevar a ebullición. Enfriar a 45 C o menos. Agregar 20 ml de solución iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por tubo, en tubos estériles. No debe calentarse luego de agregar la solución iodada. El medio base puede mantenerse a 4 C , dura varios meses, pero una vez agregada la solución iodada debe usarse en el mismo día.

5.0 1.0 10.0
30.0

pH final: 8.4
Iodo

0.2
6.0

Solución iodo iodurada Ioduro de potasio Agua 5.0 20.0

Fundamento
El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos tóxicos. La selectividad está dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato (generado en el medio por el agregado de la solución iodo-iodurada) y sales biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompañante. Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina, antes de la solución iodada

Resultados
Microorganismos Salmonella typhi
Salmonella typhimurium

Crecimiento Escaso
Bueno-excelente

Salmonella enteritidis Escherichia coli

Bueno-excelente Escaso

Características del medio
Medio preparado: suspensión blanco lechosa.

Stuart Medio de Transporte
Medio destinado a la recolección, transporte y preservación de muestras clínicas aptas para exámenes bacteriológicos. Es útil para mantener la viabilidad de gonococos y de otros microorganismos de difícil desarrollo.

Fórmula (en gramos por litro) Tioglicolato de sodio
Glicerofosfato de sodio

Instrucciones Suspender 14,1 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta disolución total. Distribuir en tubos con cierre a rosca (para evitar oxidación) llenándolos hasta 2/3 del tubo. Esterilizar 15 minutos a 121ºC. Dejar solidificar en posición vertical. 0.2

0.9
10.0

Cloruro de calcio Azul de metileno Agar

0.1 0.002 3.0

pH final: 7.4

Fundamento
Medio semisólido, no nutritivo. Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es útil para suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte, y azul de metileno, que es el indicador de oxido reducción. De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante su envío al laboratorio. Cooper encontró que usando hisopos impregnados con carbón bacteriológico se recuperan en forma exitosa numerosos patógenos entéricos y respiratorios.

Resultados

Los tubos con medio de transporte se subcultivan en medios sólidos apropiados según la muestra y el microorganismo que se quiera aislar. Luego de la incubación, debe haber escasa o nula reducción de la viabilidad de los microorganismos.

Características del medio
Medio preparado: ligeramente opalescente con tonalidad azul dependiendo del grado de oxidación.

Pruebas Bioquímicas

INTRODUCCIÓN
Con frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca de manera detallada su actividad bioquímica, porque otras características no son suficientemente distintivas o diferenciales.

En el laboratorio disponemos de numerosas técnicas para la caracterización bioquímica de una especie. Además de los productos finales de los procesos metabólicos, también se necesita conocer con detalle como se producen estos cambios, como ocurren paso a paso las reacciones químicas, cuáles enzimas intervienen, cuales son los productos intermediarios además de que se deben reconstruir las secuencias de las reacciones bioquímicas que tienen lugar dentro de la célula. En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia nutritiva específica o sustrato y después de la incubación del cultivo se examina para ver los cambios químicos que hayan ocurrido.

Enterotube II

Kligler Hierro Agar
Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentos para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa y lactosa, y a la producción de ácido sulfhídrico.
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona de carne Cloruro de sodio Lactosa Tripteina Glucosa Citrato de hierro y amonio
Tiosulfato de sodio

13.0 5.0 10.0 10.0 1.0 0.5
0.3

Rojo de fenol Agar

0.025 15.0

Suspender 54.8 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121 C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

pH final: 7.3

0.2

Fundamento
•En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. •La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. •El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. •El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante. • Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. •El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

Resultados
1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, y lactosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.

Características del medio
Medio preparado: rojo

TSI Agar
Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.
Fórmula (en gramos por litro) Extracto de carne Pluripeptona Cloruro de sodio Lactosa
Sacarosa

Instrucciones

3.0 20.0 5.0 10.0
10.0

Glucosa Sulfato de hierro y amonio
Tiosulfato de sodio

1.0 0.2
0.2

Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121 C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

Rojo de fenol Agar

0.025 13.0
pH final: 7.3 0.2

Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

Características del medio
Medio preparado: rojo

Resultados

Lisina Hierro Agar
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico.

Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolución completa. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la punción. 0.2

Peptona de gelatina Extracto de levadura
Glucosa

5.0 3.0
1.0

Lisina Citrato de hierro y amonio
Tiosulfato de sodio

10.0 0.5
0.04

Púrpura de bromocresol Agar

0.02 15.0

pH final: 6.7

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.

Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro.
Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

Resultados
1- Decarboxilación de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2-Desaminación de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3-Producción de ácido sulfhídrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente límite del pico y fondo)

en

el

Características del medio
Medio preparado: color violeta.

Microorganismos

Color en el pico de flauta Rojo Púrpura Púrpura Rojo
Púrpura

Color en la base del tubo

Ennegrecimiento del medio Negativo Positivo Positivo Negativo
Positivo

Proteus mirabilis Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis Providencia spp.
Citrobacter freundii

Amarillo Púrpura Púrpura Amarillo
Amarillo

Morganella spp. Edwarsiella spp.
Klebsiella pneumoniae

Rojo Púrpura
Púrpura

Amarillo Púrpura
Púrpura

Negativo Positivo
Negativo

Escherichia coli

Púrpura

Púrpura

Negativo

MIO Medio
Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol.

Fórmula (en gramos por litro) Dextrosa Extracto de levadura
Peptona

Instrucciones

1.0 3.0
10.0

Tripteína Clorhidrato de L-ornitina
Agar

10.0 5.0
2.0

Suspender 31 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta completa disolución. Distribuir en tubos y esterilizar 15 minutos a 121 C.

Púrpura de bromocresol

0.02 pH final: 6.5 0.2

Fundamento
Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína.

Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo. Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.

La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de la línea de inoculación. La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura. El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado positivo.

Resultados
1-Movilidad:

-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra. -Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra. 2-Ornitina decarboxilasa: -Resultado positivo: color púrpura. -Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio. 3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. -Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloroamarillento.

Características del medio
Medio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente.

SIM Medio

Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Fórmula (en gramos por litro) Tripteína
Peptona

Instrucciones 20.0
6.1 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.

Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Agar

0.2 0.2 3.5

pH final: 7.3

0.2

Fundamento
El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Resultados
Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra. Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra. Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color. Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac s o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Características del medio
Medio preparado: ámbar.

Urea
Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad ureásica. Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones

Urea Fosfato monopotásico Fosfato disódico
Extracto de levadura

20.0 9.1 9.5
0.1 Suspender 3, 87 g del medio deshidratado por cada 100 ml de agua destilada. Disolver sin calentar y esterilizar por filtración. Distribuir en tubos pequeños estériles, entre 0,5 y 2 ml.

Rojo fenol

0.01 pH final: 6.8 ± 0.2

Fundamento
Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer. El extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.

Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo. Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros géneros.

Características del medio

Medio preparado: anaranjado.

Urea1 Uninoculated Control, 2 Proteus Vulgaris, 3 E. coli

Simmons Citrato Agar
Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

Fórmula (en gramos por litro) Citrato de sodio Cloruro de sodio Fosfato dipotásico
Fosfato monoamónico

Instrucciones Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Enfriar en posición inclinada. 0.2

2.0 5.0 1.0
1.0

Sulfato de magnesio Azul de bromotimol
Agar

0.2 0.08
15.0

pH final: 6.9

Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.

El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
Microorganismo Klebsiella pneumoniae Citrato permeasa Positivo Color del medio Azul

S. typhimurium E. coli S. flexneri

Positivo Negativo Negativo

Azul Verde Verde

Características del medio
Medio preparado: verde.

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