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determinacion de glucosa y sacarosa en alimentos

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pureba de laboratorio de alimentos
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EXPERIMENTACIÓN EN QUÍMICA ANALÍTICA .

4º Curso de Licenciatura en Química

PRÁCTICA 4
DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE GLUCOSA Y SACAROSA EN ALIMENTOS 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA. Desde un punto de vista analítico, la capacidad de los enzimas para catalizar reacciones específicas con un alto grado de eficacia, ha dado lugar a diferentes aplicaciones en diversos campos del análisis como análisis clínicos, análisis de productos alimentarios, análisis de preparados farmacéuticos etc. El análisis enzimático o análisis mediante el empleo de enzimas puede ser utilizado en: 1. La determinación de los sustratos de la reacción enzimática, siendo posible determinar específicamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad de separar. Para la cuantificación de sustratos se pueden utilizar dos métodos generales: a. Métodos de cambio total, de equilibrio o de punto final. En este tipo de métodos (los más utilizados en la práctica) se permite que la reacción enzimática se complete o llegue al equilibrio y se mide la variación producida en la concentración de un producto de reacción o de un reactivo presente inicialmente en exceso. b. Métodos cinéticos, en los que se utilizan medidas de la velocidad inicial de la reacción enzimática para deducir la concentración inicial de sustrato. Los procedimientos de medida son idénticos a los utilizados para reacciones catalíticas en general. 2. Determinación de los mismos enzimas mediante el empleo de métodos cinéticos en los que se mide la velocidad de desaparición del sustrato o de generación del producto, relacionada con la concentración de enzima en disolución. 3. Determinación de otras sustancias mediante el empleo de reactivos marcados con enzimas: enzimoinmunoanálisis. El objetivo de esta práctica es determinar el contenido de glucosa y sacarosa en un zumo empleando para ello un método enzimático espectrofotométrico de tiempo fijo. Se trata de certificar la autenticidad de un zumo de fruta comercial. El volumen de un

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zumo natural puede aumentarse simplemente agregándole agua. Otras formas más sofisticadas de adulteración incluyen la adición de azúcares y ácidos para producir disoluciones con composición similar a la del producto auténtico. En cualquier caso se altera la relación específica de azúcares con respecto a la del producto natural. En el anexo se facilita una tabla en la que se resumen los requerimientos de calidad para jugos según la organización AIJN (Association of the Industry of Juices and Nectars from Fruits an Vegetables ). 2. FUNDAMENTOS Aunque la glucosa puede determinarse por métodos químicos, estos en su mayoría carecen de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacáridos. Tanto en análisis clínicos como en la industria alimentaria se utilizan métodos enzimáticos para la determinación de glucosa. Así la glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente específica que cataliza la oxidación de la glucosa a β-Dgluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en extensión apreciable.
GOD

C6H12O6

+ O2

C6H10O6 + H2O2

Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente o mediante un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reacción espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reacción enzimática indicadora adecuada. Para la determinación colorimétrica de glucosa por el método de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP), que elimina el peróxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante adecuado según el siguiente esquema de reacción:
HRP

H2O2 + Aceptor de oxígeno (DH2)

Producto coloreado

+ H2O

(D)

Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin embargo, la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda de aceptores alternativos. Uno de estos sistemas es la 4-aminoantipirina que reacciona con el fenol y el peróxido de hidrógeno en presencia de HRP para formar un colorante con estructura de quinonaimina, que presenta un máximo de absorción a 505 nm.

2

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O

CH3 CH3 N N

NH2 OH O + + H2O 2 HRP CH3 N N O + H2O CH3 N

Este método, propuesto por Trinder (1) en 1972, será el empleado en esta práctica para la determinación de glucosa en un zumo. A continuación se resumen las distintas reacciones acopladas que se utilizarán para la determinación de la glucosa. La cantidad de colorante generada, y por tanto la absorbancia medida a 505 nm, será directamente proporcional a la cantidad de glucosa.

GOD

HRP

Glucosa O2

H2O2
Gluconolactona
4-aminoantipirina + fenol

H2O Colorante

El disacárido sacarosa puede también determinarse específicamente basándose en el esquema de reacciones anterior, previa hidrólisis enzimática del mismo con el enzima fructofuranosidasa o invertasa. Este enzima cataliza la transformación de la sacarosa en una molécula de fructosa y una molécula de glucosa (azúcar invertido). Se debe determinar la glucosa en la muestra antes y después de la hidrólisis enzimática, por diferencia se obtiene el contenido de sacarosa.

Invertasa

GOD

HRP

Sacarosa

Glucosa Fructosa O2

H2O2
Gluconolactona
4-aminoantipirina + fenol

H2O Colorante

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3. MATERIAL, REACTIVOS, INSTRUMENTACIÓN a. Instrumentación − Espectrofotómetro monohaz Spectronic 20 con cubetas de 1 cm de paso de luz. b. Material • • • • • 4 matraces de 100 ml 8 matraces de 50 ml 1 vaso de 250 ml, 2 vasos de 100 ml 1 embudo, papel de filtro, vidrio de reloj. Cronómetro

c. Reactivos Reactivo Trinder: Disolución que contiene todos los reactivos necesarios para la determinación de la glucosa por el método propuesto en las concentraciones que se indican a continuación: • • • • 4-aminoantipirina 0,3 mmol/L Fenol 8,5 mmol/L Glucosa oxidasa (GOD) obtenida de Aspergillus Niger 10 U/mL Peroxidasa de rábano silvestre (Horseradish peroxidase, HRP) 0,3 U/mL

Estos reactivos, en las cantidades adecuadas, se suministran en una disolución reguladora de pH 6,6 lista para su uso. Esta disolución debe almacenarse en botellas color topacio y en el refrigerador. Si se mantiene entre 2 –8 ºC la disolución estable durante 2 meses. Disolución de invertasa 100 U/ml en tampón de citrato 0,1 M de pH 4,6. Preparar 50 mL Disolución patrón de glucosa 0,01 M Disolución Carrez I. Disolver en agua 3,6 g de ferrocianuro potásico y llevar a 100 mL. Disolución Carrez II. Disolver en agua 7,2 g de acetato de zinc y llevar a 100 mL

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4. PROCEDIMIENTO Se empleará un método de tiempo fijo para la cuantificación de glucosa y sacarosa en una muestra de zumo comercial. Para la construcción de la línea de calibrado deben prepararse cinco disoluciones de glucosa de concentraciones comprendidas entre 5×10-5 M y 5×10-4 M por dilución del patrón de glucosa. Añadir a la cubeta del espectrofotómetro 1 mL de reactivo Trinder y 250 µL de patrón, mezclar e incubar exactamente 5 minutos a temperatura ambiente. Medir a continuación la absorbancia de la mezcla de reacción a 505 nm frente a un blanco de reactivos. Para la determinación de glucosa y sacarosa en la muestra, esta se diluirá con agua en la proporción adecuada según el contenido de glucosa y sacarosa esperado. Las muestras turbias deben tratarse con los reactivos Carrez y filtrarse. Para ello pipetear 2 mL de muestra en un vaso que contenga unos 30 mL de agua, añadir 2,5 mL de disolución Carrez I y 2,5 mL de disolución Carrez II. Filtrar, recoger cuantitativamente en un matraz de 100 mL y llevar a volumen. Para la determinación del contenido de glucosa, se procederá con la disolución diluida de la misma manera que con los patrones de glucosa. Para determinar el contenido de sacarosa se llevará a cabo en primer lugar su hidrólisis enzimática a glucosa y fructosa (inversión) con invertasa. Para ello se toman 2 mL de la disolución de muestra (con un contenido máximo de sacarosa de 1 g/L) y se mezclan con 8 mL de la disolución de invertasa. Se incuban 15 minutos a 55 ºC. La suspensión fría se filtra, se lava el filtro y se recoge cuantitativamente en un matraz aforado enrasando con agua hasta la marca, realizando a continuación la determinación del contenido total de glucosa según el procedimiento anteriormente descrito. El contenido de sacarosa se obtiene por diferencia entre las concentraciones de glucosa obtenidas antes y después de la inversión enzimática. Expresar el contenido de glucosa y sacarosa en la muestra en g/L. 5. BIBLIOGRAFÍA 1. D. Barham, P. Trinder; Analyst,1972, 97, 142-145

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Extracto del Código de Prácticas del AIJN sobre requerimientos absolutos de calidad para zumos

Ácidos volátiles (g/L) Naranja Pomelo Manzana Uva Limón Tomate Maracuyá Pera Damasco Grosella Cereza Frambuesa Fresa Mandarina Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4 Max. 0.4

Etanol (g/L) Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3 Max. 3

Ácido D/LLáctico (g/L)
Max. 0.2 Max. 0.2 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.2 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.5 Max. 0.2

Ácido ascórbico (mg/L) Min 200 Min 200

Ácido cítrico (mg/L) 6.7-17 8-20 50-200 Max 0.5 45-63 2-5 25-50 Max 4.0 1.5-16 26-42 Max 0.4 9-22 5-11 6-22

Ácido LÁcido Ácido Dmálico glutámico málico (g/L) (mg/L) 0.8-3 0.2-1.2 Min 3.0 2.5-7 1.0-7.5 0.1-0.6 1.3-5.0 0.8-5 5-20 1-4 15.5-27 0.2-1.2 0.6-5 0.5-3 No No No No No No No No No No No No No No 75-205 80-235 10-200 20-150 160-400 300-800 20-70 0.27-1.36 40-220 20-150 20-250 60-200

Nitrato (g/L) Max 5 Max 5 Max 5 Max 5 Max 5 Max 20 Max 30 Max 10 Max 15 Max 15 Max 10 Max 10 Max 200 Max 5

Amonio Glucosa Fructosa Sacarosa (mg/L) (g/L) (g/L) (g/L)
Max 25.5

Sorbitol (g/L)

14-50

Min 150

Max 100 Max 140

Min 750

Max 150 Max 200

5-90

Min 100

20-50 20-50 15-35 60-110 3-12 10-16 20-55 10-35 15-50 23-50 35-70 15-38 15-35 10-40

20-50 20-50 45-85 60-110 3-11 12-18 20-53 50-90 10-45 30-65 32-60 18-45 18-40 10-40

10-50 5-40 5-30 Trazas 7.0 Max. 1 10-45 0-15 0-55 Max 5 Max 10 Max 10 20-60

2.5-7

10-25 1.5-10 10-35 Max 0.25

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