Practica N10

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

INTRODUCCION
Los microorganismos varan en sus necesidades, o tolerancia de oxgeno. De hecho, los microorganismos pueden ser divididos en diversos grupos dependiendo del efecto de ste. Los aerobios son capaces de crecer con tensin de oxgeno total (en el aire el oxgeno es del 21%) y muchos pueden soportar incluso concentraciones ms altas. Los microaerfilos, por el contrario, son aerobios que pueden utilizar este gas slo cuando su tensin es ms baja que la del aire, usualmente por su limitada capacidad de respirar, o por que contienen alguna molcula o enzima sensible al oxgeno. Los organismos que carecen de sistemas respiratorios no pueden utilizar el oxgeno como aceptor terminal de electrones. Tales organismos se llaman anaerobios, pero existen dos clases de anaerobios: los anaerobios aerotolerantes, que pueden tolerar el oxgeno y crecer en su presencia, an cuando no pueden utilizarlo, y los anaerobios estrictos (u obligados) que mueren en presencia del oxgeno. La razn por la que los anaerobios estrictos son destruidos por el oxgeno, es probablemente por que son incapaces de eliminar algn producto txico derivado del metabolismo del oxgeno. Cuando se reduce el oxgeno, se producen algunos elementos txicos tales como el perxido de hidrgeno (H2O2), superxido (O2-) y radicales hidroxilo (OH-). Muchos anaerobios estrictos son ricos en enzimas flavnicas, que reaccionan espontneamente con el oxgeno para dar estos productos txicos. Por el contrario, los aerobios poseen enzimas que descomponen los productos txicos; tales enzimas no estn presentes en los anaerobios. Como ocurre con los aerobios, algunos de ellos pudieron tolerar la presencia de O2 y de substancias oxidantes, pero en la mayora de los casos, el O 2 se comporta como un gas txico que provocaba la oxidacin de ciertos radicales libres altamente agresivos imposibles de neutralizar. Fusobacterium, Prevotella y Porphyromonas no sobreviven ms de 10 a 30 minutos de exposicin al aire. Actinomyces, Propionibacterium, Bacteroides y algunos Clostridium, son relativamente aerotolerantes. El metabolismo anaerobio, pese a restringir la proporcin de energa obtenida a partir de un nutriente y estar limitado en el nmero de substratos que pueden ser utilizados como fuente de energa, tiene una importante ventaja: la capacidad de suministrar energa de forma continua y muy rpidamente en tanto est presente un substrato capaz de ser fermentado, o bien dos

compuestos entre los cuales puedan transferirse los electrones al oxidarse un compuesto y reducirse el otro. Las bacterias anaerbicas difieren de las dems bacterias en varios aspectos. Se desarrollan adecuadamente en reas del organismo que tienen bajos valores de oxgeno (como el intestino) y en los tejidos que sufren un proceso de degeneracin, particularmente las heridas profundas y sucias, donde otras bacterias no pueden vivir y adonde las defensas del organismo no llegan fcilmente. Cientos de especies de bacterias anaerbicas viven normalmente y sin causar dao alguno sobre la piel y las membranas mucosas, como el revestimiento de la boca, el intestino y la vagina; en un centmetro cbico de heces pueden existir varios miles de millones de bacterias. Si el ambiente normal de ciertas especies de bacterias anaerbicas resulta alterado por la ciruga, un deficiente aporte sanguneo u otro tipo de lesin, pueden invadir los tejidos del husped, causando infecciones graves, incluso mortales. Se considera que las bacterias anaerbicas estn presentes en la mayora de los procesos infecciosos, ya como agente principal, o como secundario al dao tisular producido. En muchas ocasiones, stas bacterias pasan desapercibidas por diversas razones entre las que predominan la mala coleccin, transporte y conservacin de la muestra, el uso de medios inadecuados para su aislamiento, su lento crecimiento, la creencia en que si se ha aislado un microorganismo, ya no hay que seguir buscando y en muchos casos, porque el microbilogo no pens en anaerobios. En la actualidad existen varios sistemas automatizados y semiautomatizados para la identificacin de stos microorganismos. Sin embargo, adicional a las limitaciones que la literatura especializada enumera, ninguno de ellos puede ser til sin los pasos previos de coleccin, procesamiento y aislamiento, los cuales son la base de las buenas prcticas de trabajo en la microbiologa bsica.

Medios utilizados para el estudio de anaerobios:

1. Brucella agar con 5% de sangre de carnero, suplementado con vitamina K y Hemina. Tambin son tiles el Columbia y el Schaedler agar. 2. Bacteroides bili-esculina agar ( B. fragilis ). 3. Agar sangre con Kanamicina-Vancomicina . ( Bacteroides ) 4. Agar alcohol fenil etlico. ( Inhibe entricos. Muy til para Bacteroides ). 5. Tioglicolato 135 sin indicador. Medio de enriquecimiento que puede suplementarse con vitamina K ( 0.1ug/ml ), Hemina (5 ug/ml ) o bicarbonato

de sodio ( 1 mg/ml ). Calentar en bao Mara por 10 minutos con la tapa floja. Luego sacar, apretar la tapa y dejar enfriar, antes de usar. 6. Carne molida-dextrosa. Para Clostridium, visualizacin de esporas, determinacin de toxinas y mantenimiento de colonias. 7. Agar yema de huevo ( C. perfringes y cocos grampositivos anaerbicos)

Sistemas para el cultivo de anaerobios: Los anaerobios pueden crecer en las placas de agar en una atmsfera sin O 2, generalmente N 2 al 80%, CO 2 al 10% e H 2 al 10%. El CO 2 estimula el crecimiento y el H 2 combinado con O 2 , que pueda estar presente, sirven para mantener las condiciones anaerobias.

Algunos sistemas para el cultivo de anaerobios son

Tcnica de jarra anaerbica Tcnica de cmaras de anaerobios Medios Pre-reducidos

Aunque existen varias tcnicas disponibles para mantener un ambiente libre de oxgeno durante el procesamiento de los especimenes para el cultivo de anaerobios, la jarra anaerbica es la ms comn.

Tcnica de la jarra anaerbica: Los diferentes sistemas de jarras anaerbicas incluyen la de Brewer, GasPak, McIntosh-Fildes, Jarra Tolbar, entre otras. Nos referiremos a la jarra GasPak, por ser la de mayor utilidad en el mundo. El principio bsico de sta, es como la de todas: La remocin del oxgeno presente en la cmara ocurre por la reaccin con el hidrgeno producido, en presencia de un catalizador, para formar agua. La reaccin se describe como 2H2 + O2 >>> 2H2O

El catalizador est compuesto de un pellet de aluminio revestido de 0.5 % de paladio. El catalizador puede ser inactivado en la jarra por la produccin de sulfuro de hidrgeno u otros metabolitos voltiles producidos por las bacterias. Por ello se recomienda que los catalizadores sean reemplazados cada vez que se va a cerrar la jarra. Los mismos pueden restaurar su actividad si son calentados a 160 - 170 C por 2 horas; luego de lo cual son almacenados en un lugar seco y limpio a temperatura ambiente. El sobre generador de GasPak contiene un papel de filtro, una tableta de borohidruro de sodio, una tableta de bicarbonato de sodio y cido ctrico. El sobre es activado al aadir 10 ml de agua y el ambiente se obtiene en aproximadamente 30 minutos, visualizndose por una condensacin del agua dentro de la jarra. El sistema produce un potencial de oxido-reduccin ( Redox ) de -100 Mv dentro de 1 hora y - 200 Mv en 2 horas. Dentro de una hora de incubacin a 35 C , la concentracin de gases es de aproximadamente 4 a 10% de CO2. Las condiciones anaerbicas pueden ser monitoreadas utilizando un indicador de xido-reduccin; una tira de papel de filtro impregnada de azul de metileno puede ser utilizada con ste propsito. El azul de metileno se degrada a incoloro y permanece as mientras se mantengan las condiciones de ausencia de oxgeno. Si el la tira indicadora se observa azul, hay falla en la produccin del ambiente y los cultivos deben ser repetidos. El azul de metileno se decolora en aproximadamente 4 a 6 horas a 35 C. Existen en mercado diversas marcas para generadores de ambientes, entre los que llama la atencin el Genbox de bioMerieux que no requiere agua para su activacin ni catalizador. No desprende Hidrgeno y requiere ser colocado en menos de 1 minuto en la jarra, ya que la reaccin es inmediata. Normalmente el periodo de incubacin de los platos es de 48 h, sin embargo algunos requieren ms de 3 das como el Fusobacterium y algunos cocos anaerbicos. Generalmente el periodo mximo de incubacin es de 72 horas, con observacin de los platos a las 48h.

JARRA DE BREWER

Hay otros procedimientos ms sofisticados que se utilizan para aislar los microorganismos extremadamente oxgeno-sensitivos que no siempre pueden ser recuperados usando la jarra anaerbica.

Medios Pre-Reducidos ( PRAS ) : En este mtodo se preparan los medios prerreducidos , se esterilizan, se almacenan en tubos sellados y se les inocula un ambiente libre de oxgeno. Siempre que los tubos se abran por ejemplo para la siembra de la muestra, inoculaciones, transferencia etc., se protegen contra la entrada del oxgeno haciendo pasar a travs de ellos y de manera continua, una corriente de gas libre de oxgeno (bixido del nitrgeno o de carbono). Cada tubo es por lo tanto, su propia cmara de anaerobiosis. Un mtodo muy prctico de preparacin, es el del medio prerreducido con aguja. Se prepararan tubos de caldo infusin cerebro y corazn (BHI) y tubos de BHI a los que se les incorpor un trozo de carne de res de 0.5 cm de carne cocida desgrasada (BHI-carne), prerreducidos, de acuerdo con las recomendaciones de Holdeman, Cato y Moore , para garantizar una atmsfera completamente anaerbica. Para crear la atmsfera anaerobia, el medio de cultivo se dispone en volmenes de 5 ml en tubos 16 x 100 mm con tapn de hule (nuevo) y tapa de rosca a la que se le hizo un orificio de 1 mm; a travs de dicho orificio se introdujo una aguja #27. Los tubos bien cerrados se esterilizaron durante 15 minutos a 121 C. Concluido el ciclo de esterilizacin, se procede a una descompresin rpida de la autoclave y con guantes protectores se precede a sacar las agujas en cada uno de los tubos que se encontraban an en proceso de ebullicin. Los tubos se dejan enfriar a temperatura ambiente y son descartados todos aquellos que presentaran evidencia de oxidacin, de acuerdo con el indicador de resarzurina que tiene incorporado el medio. - El mtodo del Roll-Tube.- es una tcnica popularizada por el Virginia Polytechnic Institute (VIP), el cual consiste en un tubo con tapa que contiene gas libre de oxgeno y una capa delgada del medio prerreducido ( PRAS ) en su superficie interior. La muestra se inocula mientras que se rota el tubo. Esto produce una pista en espiral en la superficie del agar. El tubo se limpia con una corriente de bixido de carbono para prevenir la entrada del aire mientras que est abierto durante la inoculacin, con lo que el tubo al taparlo se convierte en su propia cmara anaerbica de cultivo. - La cmara de anaerobio.- con guantes es otra innovacin desarrollada para aislar bacterias anaerobias. Es esencialmente un compartimiento grande de vinil transparente, con los guantes unidos, conteniendo una mezcla de 80 % de

nitrgeno, 10 % de hidrgeno y 10 % de bixido de carbono. Recordar que el H2 es explosivo. Un compartimento en un extremo de la cmara contiene dos portillas, una que conduce al exterior y la otra al interior del compartimiento. Los especimenes se ponen en el compartimento, la portilla exterior es cerrada, y el aire en el compartimento se evacua y se substituye por la mezcla de gas. La portilla interior entonces se abre para introducir el espcimen en la cmara principal cuando las presiones se igualan. Una de las cmaras ms recomendadas es la de Forma Scientific .

Cmara de anaerobios

Principios generales para el xito del cultivo: 1. 2. 3. 4. Apropiada coleccin y transporte Procesamiento de la muestra con la mnima exposicin al oxgeno Medio de cultivo fresco o prerreducido. Uso de un sistema anaerbico adecuado.

Caractersticas tiles en la identificacin de bacterias anaerbicas: A pesar de que existen signos bacteriolgicos que sugieren crecimiento de organismos anaerbicos como morfologa celular tpica en Gram, crecimiento en el rea profunda de un medio lquido, gas y mal olor en el cultivo, los siguientes detalles ayudan a orientarnos en el diagnstico: 1. Morfologa de la clula y de la colonia 2. Produccin de pigmento 3. Formacin de endosporas 4. Beta-hemlisis en agar de sangre 5. Picaduras en el medio 6. Fluorescencia con la luz ultravioleta 7. Movilidad 8. ndice de crecimiento 9. Olor caracterstico del cultivo 10. Produccin de catalasa 11. Crecimiento en presencia de bilis al 20% 12. Patrones especficos de la susceptibilidad a los antibiticos 13. Efectos del cultivo en agar yema de huevo 14. Produccin de indol 15. Hidrlisis de la esculina 16. Subproductos metablicos caractersticos de la fermentacin de la glucosa 17. Produccin de toxinas

Muestras no adecuadas para el cultivo de anaerobios:

a) b) c) d) e) f) g) h) i) j)

Lavado bronquioalveolar desprotegido. Hisopo cervical. Aspirado endotraqueal. Loquios. Hisopo nasofarngeo / Secrecin farngea. Lquido seminal o prosttico. Esputo por expectoracin o inducido. Heces, rectal, contenido gstrico, colostoma. Secrecin uretral / hisopo vaginal o vulvar. Orina por vaciado directo o catter.

FUNDAMENTO TEORICO

Dentro de los microorganismos denominados bacilos formadores de esporas tenemos los gneros Bacillus y Clostridium. Estos bacilos debido a que forman esporas pueden sobrevivir en el ambiente por muchos aos. El gnero Bacillus es aerobio, mientras que el gnero Clostridium es anaerobio estricto. Gnero BACILLUS. Son bacilos grampositivos, aerobios, grandes, que se agrupan formando cadenas. La mayora de los miembros de este gnero son saprofitos: Bacillus cereus y Bacillus subtilis. Prevalecen en el suelo, aire, agua, vegetales diversos.

De las especies conocidas la mayora no producen enfermedades en el hombre, siendo importantes en enfermedades animales. Sin embargo, algunas especies, causan enfermedades en el hombre, una de ellas el Bacillus anthracis que es el responsable del ntrax.

Gnero CLOSTRIDIUM. Los clostridios son bacilos grandes casi todos mviles (poseen flagelos peritricos ), grampositivos y anaerobios; muchos descomponen protenas, forman toxinas o ambas cosas. Su hbitat natural es el suelo o el intestino de los animales y el hombre, donde viven como saprofitos. Entre los ms patgenos se encuentran los causantes del botulismo, ttanos y la gangrena gaseosa. La espora se puede encontrar en tres formas: Ecuatorial, Subterminal y Terminal.

Cultivo: Crecen solamente en condiciones de anaerobiosis, mediante dos mtodos: 1. Placas de agar o tubos de cultivo en un recipiente hermtico, del cual se extrae el aire y se reemplaza por nitrgeno con 10% de CO2 o puede extraerse el oxgeno por otros mtodos ( Gaspack ). 2. Medios lquidos conteniendo tejidos animales (carne molida) o bien 0.1% agar y un agente reductor como el tioglicolato. Cerrados. Se

observa crecimiento desde el fondo del tubo hasta aprox. 15 mm de la superficie expuesta al aire.

PROCEDIMIENTO
Pruebas diferenciales para la identificacin presuntiva de ntrax : Caractersticas de las colonias Despus de 18-24 h de incubacin en el medio de ASC se observan colonias de 2 a 5 m de dimetro, planas convexas, los bordes son irregulares, ligeramente onduladas con apariencia de vidrio espemerilado. A menudo se observan unas proyecciones de la colonia que le dan un aspecto de medusa. En el ASC no se observa hemlisis a diferencia de B. cereus y B. thuringiensis que son beta hemolticos. Es importante anotar que B. anthracis no crece en agar MacConkey. Coloracin de Gram Realice la coloracin por el mtodo de rutina del laboratorio En la coloracin de Gram de la colonias se observan bacilos Gram positivos de 1 a1,5 m por 3 a 5 m, con los extremos rectos, encapsulados y presentan esporas en forma ovales centrales a subterminales que no causan hinchazn en deformacin de la clula bacteriana. Las esporas no se observan en los extendidos de las muestras clnicas. El Gram de las colonias que crecen en agar sangre presenta cadenas largas de bacilos sin cpsula. Las cepas virulentas cuando crecen en agar nutritivo en 5% de CO2 cepas forman una cpsula que es visible con tinta china. Identificacin bioqumica Catalasa positiva Motilidad: negativa Sensibilidad a la penicilina (discos de 10 U): positiva con zonas de inhibicin de 15 a 20mm. Muestras am

CONCLUSION

- En conclusin la actuacin de las bacterias puede ser positiva o negativa, segn el caso. En el cuerpo humano, algunas producen sustancias que son capaces de eliminar a otros de estos microorganismos que causan dao al hombre. Para poseer una sola clula, en conclusin los expertos afirman que las bacterias son muy poderosas, sea negativa o positivamente en el cuerpo del hombre y su entorno. - Los Bacillus son bacilos G(+), pueden ser o no esporulados, mviles o invviles. Desarrollan en forma de estreptobacilos con terminaciones redondeadas. Pueden presentar grnulos metacromticos o endoesporas. - Los grampositivos se tien de color azul como por ejemplo la shirichacoli. - Las esporas llegan a los tejidos por contaminacin de zonas traumatizadas.

CUESTIONARIO

1.-Cuales son las caractersticas de la familia Bacillaceae,por su efecto patgeno? Bacillaceae es una familia de bacterias Gram positivas que se caracterizan por su forma de bastn y por producir endosporas. En esta familia hay especies tiles, como las que se emplean en el enriado del lino y tambin especies que son patgenas para el hombre y los animales, como la que ocasiona el ntrax. Poseen flagelacin peritrica en caso de presentar motilidad

2.-Cul es la implicancia de estas bacterias en la salud humana? El hombre conjuntamente con los animales (mamferos, aves, peces) es hospedero en sus epitelios, mucosas y aparatos de un gran nmero de Especies y de un gran nmero de individuos anaerbicos. Estos son miembros de una FLORA NORMAL beneficiosa y hasta en algunos casos esenciales para la vida. El conocimiento de esta flora normal es importante desde varios ngulos. Si pensamos que muchas infecciones anaerbicas se desarrollan en la vecindad de las superficies mucosas en las cuales estos grmenes predominan como flora autctona, el conocimiento de la misma se presenta de gran utilidad para sospechar quienes estaran involucrados en los procesos infecciosos. Esta informacin ayuda al Clnico para establecer una antibioticoterapia emprica racional y al microbilogo para seleccionar los Medios de Cultivo ms apropiados al aislamiento e identificacin bacterianos. 3.-Cules son las principales enfermedades causadas por los especies de estos generos Bacillus y Clostridiumen en el hombre y los animales? De las numerosas especies de ambos gneros, Bacillus y Clostridium, la mayor parte no causan enfermedad y no se han estudiado en la microbiologa mdica. Sin embargo, varias especies. Causan enfermedades importantes en el hombre. El ntrax padecimiento prototipo en la historia de la microbiologa, es causado por Bacillus anthracis. El ntrax sigue siendo una enfermedad importante de los animales. y en ocasiones del hombre y B. anthracis podra ser un agente principal de guerra biolgica. Bacillus cereus causa envenenamiento por alimentos y a veces infecciones oculares y otras localizadas. Los clostridios causan varias enfermedades graves mediadas por toxinas: Clostridium tetani, ttanos; Clostridium bofulinum, botulismo; Clostridium perfringens, gangrena gaseosa; y Clostridium difficile, colitis seudomembranosa. En infecciones mixtas por anaerobios en el hombre. Tambin se han encontrado otros clostridios .

4.-Por qu presentan esporas estos generos? Algunas especies de anaerobios (bacilos Gram positivos del Gnero Clostridium) poseen la capacidad de esporular, esto es, producir esporos. Se trata de estructuras biolgicas genticamente iguales a su antecesor vegetativo, metablicamente inactivo y altamente resistente a condiciones medioambientales adversas (Temperatura, humedad, radiaciones UV, agentes qumicos). .

ANEXO
PROSESAMIENTO DE MUESTRA ANAEROBIOS

IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM POSITIVOS ESPOROFRMICOS

BACTERIAS ANAEROBIAS