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PROCESOS

FERMENTATIVOS

Mena Pérez Calixto


PROCESOS FERMENTATIVOS
De:

Scrag A. Biotecnologia para Ingenieros. Sistemas


Biologicos en procesos tecnologicos. Editorial Limusa.
Mexico. Capitulo 14.

Madigan Michael T. Martinko John M. Parker Jack. Brock


Biologia de los Microorganismos. Editorial Pearson. Madrid
2004. Capitulos 30 y 31.

Fermentation and Biochemical Engineering Handbook.


Principles, Process Design, and Equipment (2nd
Edition). Edited by: Vogel, H.C.; Tadaro, C.L. © 1997
William Andrew Publishing/Noyes
Merchuk, Jose. Microbiologia Industrial. 1994

http://www.javierhuertas.com/PTMA-04-06.html

http://www.catedras.quimica.unlp.edu.ar/ingenieriabioquimicaIyII/seminario6-

http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema12MI.html

http://es.wikipedia.org/wiki/Biorreactor

http://www.biologia.edu.ar/microind/cultivo%20y%20biorreactores.htm

http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap7_mi.pdf

http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n
Introduccion

El principal objetivo de un proceso


fermentativo es el de obtener productos
metabólicos útiles a partir de materiales
biológicos (sustratos).

El proceso fermentativo comprende dos


principales fases distintas: la fermentación
y la recuperación de los productos.
Introduccion

Para el cultivo de microorganismos en


condiciones óptimas, así como para la
producción, por parte de los
microorganismos, de los metabolitos o las
enzimas deseadas, deben ser desarrollados
procedimientos de fermentación.
Introduccion

Pero tambien el desarrollo de cepas mediante


manipulación genética y/o la regulación del
metabolismo mediante la optimización del medio
de cultivo así como el control adecuado de los
factores físico-químicos que afectan al rendimiento
de las fermentaciones industriales (02,
Temperatura, pH, etc).
Introduccion
La recuperación del producto o
"procesamiento posterior" (del inglés
downstream processing) conlleva la
extracción y purificación de los productos
biológicos.
La recuperación en los procesos
bioquímicos difiere de la recuperación
química, principalmente, en que los
materiales biológicos son frecuentemente
mucho más lábiles.
Introduccion

Por lo tanto, la producción de productos


metabólicos útiles a partir de microorganismos con
lleva una íntima relación entre la ciencia y la
tecnología.

Por un lado se deben desarrollar los


microorganismos de interés industrial y por otro se
debe asegurar que estos microorganismos puedan
crecer en gran cantidad bajo aquellas condiciones
que originen el mejor rendimiento posible del
producto.
Fermentacion

La Fermentación es un proceso catabólico de


oxidación incompleto, totalmente anaeróbico,
siendo el producto final un compuesto orgánico.

Estos productos finales son los que caracterizan


los diversos tipos de fermentaciones.

Fue descubierta por Pasteur, que la describió


como la vie sans l´air (la vida sin el aire).
Fermentacion

El proceso de fermentación es anaeróbico ya que


se produce en ausencia de oxígeno.

Esto significa que el aceptor final de los electrones


del NADH producido en la glucolisis no es el
oxígeno, sino un compuesto orgánico que se
reducirá para poder reoxidar el NADH a NAD+.

El compuesto orgánico que se reduce


(acetaldehído, piruvato etc) es un derivado del
sustrato que se ha oxidado anteriormente.
Fermentacion

Sin embargo, en la industria la fermentación puede


ser oxidativa, es decir, en presencia de oxígeno,
pero es una oxidación aeróbica incompleta, como
la producción de ácido acético a partir de etanol.

Las fermentaciones pueden ser:

Naturales, cuando las condiciones ambientales


permiten la interacción de los microorganismos y
los sustratos orgánicos susceptibles.

Artificiales, cuando el hombre propicia condiciones


y el contacto referido.
Productos, reacciones y grupos microbianos responsables de los
procesos fermentativos mas importantes

Lactico + etanol + CO2


Biomasa + CO2 Hongos
O2 comerciales
Lactobacilos.
Streptococcus
Levaduras
Leuconostoc
Zimomonas

Clostridium
butiricum

Clostridium propionicum y
Propioniobacterium

Enterobacterias
Los grupos que mas interesan desde el punto de vista alimentario son: enterobacterias y
clostridium (Sanitario) y bacterias lacticas , propionibacterias y levaduras (Productivo)
De acuerdo con Steinkraus (1995), la fermentación de los
alimentos sirve a 5 propósitos generales:
•Enriquecimiento de la dieta a través del desarrollo de una
diversidad de sabores, aromas y texturas en los substratos
de los alimentos.
•Preservación de cantidades substanciales de alimentos a
través de ácido láctico, etanol, ácido acético y
fermentaciones alcalinas.
•Enriquecimiento de substratos alimenticios con proteína,
aminoácidos, ácidos grasos esenciales y vitaminas.
•Detoxificación durante el proceso de fermentación
alimenticia.
•Disminución de los tiempos de cocinado y de los
requerimientos de combustible.
Fermentacion

En líneas generales, un proceso típico de


fermentación comienza con la formulación y
esterilización del medio de cultivo así como la
esterilización del equipamiento.

Las células se crecen primero en un cultivo de


mantenimiento (5 a 10 mL), posteriormente en un
matraz (200 a 1.000 mL) y de ahí en un
prefermentador (10 a 100 L) para finalmente
inocular el fermentador de producción (1.000 a
100.000 L).
Fermentacion

Una vez que la fermentación se ha completado, las


células se separan del cultivo líquido.

Si el producto es intracelular, se rompen las


células, se eliminan los restos celulares y se
recupera el producto del fluido libre de restos
celulares.

Si el producto es extracelular, se purifica a partir


del sobrenadante libre de células.
Biorreactor

Un biorreactor es la parte principal de cualquier


proceso fermentativo en el cual se emplean
sistemas microbianos para la manufactura
economica de una amplia variedad de productos
biologicos utiles.
Biorreactor

La funcion principal de un biorreactor diseñado


apropiadamente es la de proveer un medio
controlado para alcanzar el crecimiento optimo y la
formacion de productos finales optimos o
cualquiera de ambos, en el sistema celular
particular empleado.
Se encuentran dos tipos de biorreactores de
uso muy difundido:

Tanque agitado

“Air lift".
Tanque agitado

En el tanque agitado, la agitación se realiza


mecánicamente mediante un eje provisto de
turbinas accionado por un motor.

El aire se inyecta por la parte inferior del


tanque y es distribuido por una corona que
posee pequeños orificios espaciados
regularmente.
Tanque agitado

El chorro de aire que sale de cada orificio es


"golpeado" por las paletas de la turbina inferior
generándose de este modo miles de pequeñas
burbujas de aire, desde las cuales difunde el 02
hacia el seno del líquido.

El sistema de agitación se completa con cuatro o


seis deflectores que tienen por finalidad cortar o
romper el movimiento circular que imprimen las
turbinas al líquido, generando de este modo mayor
turbulencia y mejor mezclado.
Tanque agitado

El tanque está rodeado por una camisa por la que


circula agua, lo que permite controlar la
temperatura.
Biorreactor Air Lift

En los reactores de tipo "air lift“, el mismo aire


inyectado promueve la agitación.

Básicamente consiste en dos cilindros


concéntricos y por la base de uno de ellos, por
ejemplo el interior, se inyecta aire.

De este modo se genera una circulación de líquido


ascendente en el compartimento interno y
descendiente en el externo, lo que favorece el
mezclado.
Funcionamiento de biorreactores

El estudio detallado de un fermentador cae fuera


del objetivo de la microbiologia industrial ya que se
concentra en los principios biológicos de la
biotecnología.

Sin embargo, como la tecnología de los procesos


fermentativos es una amalgama de técnicas
biológicas e ingeniería química, se hace necesario
conocer los tipos de fermentadores disponibles sus
principales características.
Los siguientes puntos son los considerados como los criterios
más importantes para el funcionamiento de un biorreactor:

1.- El tanque debe diseñarse para que funcione


asépticamente durante numerosos días, así como para las
operaciones de más larga duración.

2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y


agitación para cubrir las necesidades metabólicas de los
microorganismos.

3.- El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible.

4.- Debe tener un sistema para el control del pH.


5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de
muestras.

6.- Debe existir un sistema para el control de la


temperatura.

7.- Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas.

8.- El diseño del tanque debe ser tal que las operaciones
laborales durante el funcionamiento, recolección, limpieza y
mantenimiento sean mínimas.

9.- El tanque debe ser versátil para la aplicación de


diversas modalidades de procesos.
10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas,
utilizando, donde sea posible, soldaduras.

11.- La geometría del fermentador debe ser similar a otros


tanques más pequeños o mayores de la planta o a los de la
planta piloto para poder reproducir procesos a diferentes
escalas.

12.- Deben emplearse los materiales más baratos que


proporcionen resultados satisfactorios.

13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el


fermentador.
Funcionamiento

El mantenimiento de un ambiente aséptico y unas


condiciones aeróbicas son, probablemente, los dos
puntos de mayor relevancia que hay que
considerar.

Los fermentadores más ampliamente utilizados a


nivel industrial están provistos de mecanismos de
agitación, dispersión y aireación así como de
sistemas para el control de la temperatura, pH y
formación de espuma.
Las "tareas" que realiza el biorreactor pueden resumirse del
siguiente modo:
•Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el
volumen de cultivo a fin de prevenir la sedimentación o la
flotación.
•Mantener constante y homogénea la temperatura.
•Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
•Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el
consumo.
•El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo
puro; una vez que todo el sistema ha sido esterilizado y
posteriormente sembrado con el microorganismo deseado.
Factores fisico-quimicos que afectan al
rendimiento de las fermentaciones industriales

1.- Oxígeno

2.- Temperatura

3.- pH
Oxígeno

Uno de los factores más críticos en la


operación de fermentación a gran escala es
el suministro de un intercambio de gases
adecuado.

El oxígeno es el sustrato gaseoso más


importante para el metabolismo microbiano
y el anhídrido carbónico es el producto
metabólico más importante.
Oxigeno

El oxígeno no es un gas muy soluble ya que una


solución saturada de oxígeno contiene
aproximadamente 9 mg/L de este gas en agua.

Debido a la influencia de los ingredientes del


cultivo, el contenido máximo de oxígeno realmente
es más bajo de lo que debería ser en agua pura.

Por lo tanto, el suministro se logra pulverizando


aire en el fermentador durante el proceso.
Oxigeno

Una vez disuelto el O2 éste tiene que transferirse desde la


burbuja de gas a cada célula individual. Para ello deben ser
superadas varias resistencias parcialmente independientes:

a.- La resistencia dentro de la película de gas a la interfase.

b.- La penetración de la interfase entre la burbuja de gas y


el líquido.

c.- Transferencia desde la interfase al líquido.

d.- Movimientos dentro de la solución de nutrientes.

e.- Transferencia a la superficie de la célula.


Oxigeno

La ley de Henry describe la solubilidad del oxígeno en


soluciones de nutrientes en relación a la presión parcial del
oxígeno en la fase gaseosa:
P0
C=
H
Donde:
C = concentración de O2 de la solución de nutrientes a
cierta saturación
P0 = presión parcial del gas en la fase gaseosa
H = constante de Henry que es específica para cada tipo de
gas.
Temperatura

La temperatura es otro de los parámetros


esenciales para el éxito de una
fermentación.

Los microorganismos que crecen a una


temperatura inferior a la óptima tienen
retardado su crecimiento y por lo tanto
reducida la producción celular, es decir su
productividad.
Temperatura

Por otro lado, si la temperatura es demasiado alta,


pero no letal, se puede inducir una respuesta de
estrés al choque térmico con la consiguiente
producción de proteasas celulares que ocasionan
una disminución en el rendimiento de los productos
proteicos.

A fin de obtener rendimientos óptimos, las


fermentaciones deben ser llevadas a cabo en un
margen estrecho de temperatura y a ser posible
constante.
Temperatura

La velocidad de producción de calor debida a la


agitación y a la actividad metabólica de los
microorganismos no se ve compensada por las
pérdidas de calor que resultan de la evaporación,
por lo que se debe recurrir a sistemas de
refrigeración.

Dentro de éstos, los más utilizados en las


fermentaciones industriales son las camisas de
agua.
Temperatura

La relación temperatura-velocidad de crecimiento


esta dada por la ecuación de Arrhenius:

µ = Ae –Ea/RT

Donde
µ = velocidad de crecimiento
A = constante de Arrhenius
Ea = energía de Activación (kcal/mol)
R = constante de los gases
T = Temperatura absoluta
pH

La mayor parte de los microorganismos crecen


óptimamente entre pH 5,5 y 8,5.

Pero durante el crecimiento en un fermentador, los


metabolitos celulares son liberados al medio, lo
que puede originar un cambio del pH del medio de
cultivo.

Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de


cultivo y añadir un ácido o una base cuando se
necesite para mantener constante el pH.
pH

Esta adición del ácido o base debe ser mezclada


rápidamente de tal manera que el pH del medio de
cultivo sea el mismo en todo el fermentador.
Agitacion

La agitación es la operación que crea o que


acelera el contacto entre dos o varias fases. Una
fermentación microbiana puede ser considerada
como un sistema de tres fases, que implica
reacciones líquido-sólido, gas-sólido y gas-líquido.
1 La fase líquida contiene sales disueltas,
sustratos y metabolitos. Puede existir, en algunos
casos, una segunda fase líquida si existe un
sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los
alcanos.
2 La fase sólida consiste en células individuales,
bolitas de micelio, sustratos insolubles o productos
del metabolismo que precipitan.
3 La fase gaseosa proporciona un reservorio para
el suministro de oxígeno, para la eliminación del
CO2 o para el ajuste del pH con amonio gaseoso.
Agitacion
Una adecuada agitación de un cultivo
microbiano es esencial para la fermentación
ya que produce los siguientes efectos en las
tres fases:
1 Incrementar la velocidad de transferencia
de oxígeno desde las burbujas de aire al
medio líquido; los microorganismos no
pueden utilizar oxígeno gaseoso, sino
solamente el que se encuentra en
disolución.
2 Aumentar la velocidad de transferencia de
oxígeno y nutrientes desde el medio a las
células. Debido al movimiento se evita que
las células creen áreas estancadas con
bajos niveles de oxígeno y nutrientes.

3 Impedir la formación de agregados


celulares.
4 Aumentar la velocidad de transferencia de
productos metabólicos de las células al
medio.

5 Aumentar la tasa o la eficiencia de la


transferencia de calor entre el medio y las
superficies de refrigeración del fermentador.
Tipos de fermentacion

En función de los flujos de entrada y salida,


la operación de un biorreactor puede ser de
tres modos distintos:

• Lote (Batch) o discontinua

• Lote alimentado (Fed-Batch)

• Continuo o quimiostato
Fermentación discontinua

Una fermentación por lotes (Batch) o


discontinua puede ser considerada como
un "sistema cerrado".

Al inicio de la operación se añade la


solución esterilizada de nutrientes y se
inocula con el microorganismo, permitiendo
que se lleve a cabo la incubación en
condiciones óptimas de fermentación.
Fermentacion discontinua

A lo largo de toda la fermentación no se añade


nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un
agente antiespumante y ácidos o bases para
controlar el pH.

La composición del medio de cultivo, la


concentración de la biomasa y la concentración de
metabolitos cambia generalmente como resultado
del metabolismo de las células observándose las
cuatro fases típicas de crecimiento: fase de
latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase
de muerte.
Fermentacion discontinua

Cuando se ha alcanzado el nivel deseado de


reacción, se vacía el reactor, se limpia y el
proceso se repite.

En los procesos comerciales la fermentación


frecuentemente se interrumpe al final de la fase
logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que
comience la fase de muerte (metabolitos
secundarios).
Desventajas

- Dificultad de controlar la velocidad de crecimiento,


excepto variando la composición del medio o las
condiciones de proceso.
- Altas concentraciones de nutrientes pueden inhibir el
crecimiento debido al aumento de la presión osmótica del
medio o toxicidad de nutrientes.
- Alta demanda de oxígeno puede generar una limitación
debido a una insuficiente capacidad del reactor para
transferir O2 al medio.

- Inconvenientes para remover calor.


- Tiempos muertos entre procesos disminuye la
productividad.
Fermentacion discontinua alimentada

Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la


fermentación alimentada.

En los procesos alimentados, los sustratos se


añaden escalonadamente a medida que progresa
la fermentación.

La formación de muchos metabolitos secundarios


está sometida a represión catabólica (efecto
glucosa).
Fermentacion discontinua alimentada

Por esta razón en el método alimentado los


elementos críticos de la solución de nutrientes se
añaden en pequeñas concentraciones al principio
de la fermentación y continuan añadiéndose a
pequeñas dosis durante la fase de producción.
F(t)
SR(t)

Vf, Xf
VR = Vf - V0

V0, X0, S0

RESERVORIO BOMBA
BIORREACTOR
Fermentacion discontinua alimentada

El batch alimentado es particularmente útil en


procesos en los que el crecimiento celular y/o la
formación de producto son sensibles a la
concentración del sustrato limitante, es decir
cuando el rendimiento celular o la poductividad de
la biomasa o del metabolito buscado se ven
afectados.

Así, este método se emplea cuando se quieren


evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se
requiere alcanzar una alta concentración de
biomasa.
Ventajas
- Limitar la demanda de O2 del cultivo.

- Obtener altas concentraciones de sustrato


evitando el efecto osmótico y tóxico de
nutrientes.

- Incrementar la tasa de produccion (metabolitos


secundarios, proteínas recombinantes) para
maximizar el coeficiente de rendimiento.

- Maximizar el crecimiento celular (efecto


Crabtree en levaduras).
Fermentación continua

En la fermentación continua se establece un


sistema abierto.

La solución nutritiva estéril se añade


continuamente al biorreactor y una cantidad
equivalente de solución utilizada de los nutrientes,
con los microorganismos, se saca
simultáneamente del sistema.
Fermentación continua

En algunos sistemas continuos el medio


nutriente es inoculado con el cultivo
microbiano al entrar al reactor y los
organismos llevan a cabo su actividad a
medida que el líquido fluye a través del
sistema y salen del sistema junto con el
medio.
Fermentación continua

Los organismos pueden separarse de la


corriente que lleva al producto y reciclarse
para inocular el líquido de alimentación.

En un sistema continuo con mezcla


completa, las condiciones son uniformes en
todo el reactor, en un equilibrio de mezcla
de nutrientes, organismos y productos.
Ventajas
- Opera por periodos largos; tiempos muertos
bajos.
- Costos de operación y trabajo bajos.
- El cultivo se mantiene con coeficientes de
crecimiento constantes.
- Crecimiento balanceado, composición celular
constante.
-Generación de biomasa constante como
productividad y conversión.

- Volumen de reactor reducido en comparación a la


productividad similar en proceso por lotes.
Desventajas

- Alto costo por alta calidad de equipos y


accesorios.

- Requiere gran reservorio para almacenamiento


de medio o suministro continuado de sustrato.

- Esterilización continuada, separación continuada


de producto y niveles de purificación.

- Biosensores sofisticados y automatización


computarizada para operación óptima.
Desventajas

- Se incrementa el riesgo de contaminación debido


a la amplia operación.

- Posibilidad de mutación, incremento de fagos por


los cambios genéticos debido a la presencia de
plasmidios e incremento de estos.

- La conversión total de sustrato exige sistema de


multiniveles, inmovilización celular o recirculación
celular que encarece el costo de operación.

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