TECNICAS Y

METODOS DE
CUANTIFICACION
DE PLAQUETAS Y
MICROPARTICULAS
LIC. TM. VANESSA VEGA CONCHA
LIC. TM. PATRICIA VERASTEGUI TOPOVICH
CURSO: ESPECIALIZOGIA C

PARTICIPANT
ES:
HISTÓRICAMENTE: LAS TÉCNICAS PARA EL
RECUENTO DE PLAQUETAS SE DIVIDEN EN
4 GRUPOS
 Métodos manuales directos, con hemocitometro y microscopia

• Métodos manuales indirectos, en el cual la cantidad de plaquetas es determinando mediante el

recuento directo de hematíes determinado en un frotis de sangre periférica.

• Métodos automatizados
BRECHER Y COL

1953, desarrollaron un método manual con

microscopia de contraste de fase, que permitió
la fácil discriminación de plaquetas de
hematíes lisados en un hemocitometro.
El principio Coulter en 1950 revolucionó el
recuento en sangre, el recuento de plaquetas
fue adicionado solo en los analizadores
hematológicos totalmente automatizados a
finales de 1970.
METODOS DE REFERENCIA
PARA EL RECUENTO DE
PLAQUETAS1.-Recuento de plaquetas en cámara de Neubauer con microscopio de contraste de fase

2.-Actual método de referencia: Razón hematíes / plaquetas (Red Blood Cell /platelet Ratio)
La ICSH (International Council for Standardization in Hematology) recomienda un recuento
indirecto de plaquetas mediante citometría de flujo y anticuerpos CD41 y CD61 .
El recuento, mediante citometría de flujo, de hematíes y plaquetas específicamente marcadas, junto
con un exacto recuento de hematíes determinado con un contador de partículas de apertura por
impedancia, mono canal y semiautomatizado. Ello da un 12 método suficientemente exacto y
preciso para ser usado como calibrador de contadores celulares y asignar valores para calibración
de materiales
 MÉTODOS MANUALES
Directos :
• Método de Brecker y Conkrite
• Método de Rees – Ecker
• Método de Guy y Leakes
Indirectos :
La revisión del frotís de sangre periférica nos brinda una estimación cualitativa (normal, bajo o
alto) útil del recuento de plaquetas.
• Método de Fonio
• Método de Dameshek-modificación de Fonio
• Método de Factor 20 000
MÉTODOS SEMI
AUTOMATIZADOS
Se hace uso del plasma rico en plaquetas obtenido a través de centrifugación de sangre completa con
EDTA, y el recuento se realiza utilizando un equipo electrónico de impedancia equipado con un
orificio de 70 µm. Por ejemplo el equipo Coulter Thrombocounter C.
 MÉTODOS AUTOMATIZADOS
En la década de los 90, los marcadores inmunológicos fueron utilizados, los cuales reconocían
antígenos específicos de la superficie de las plaquetas que permitieron la identificación de
plaquetas por citometría de flujo.

Más tarde esto permitió el desarrollo de

un método de referencia para el recuento
de plaquetas usando CD41 y CD61
basado en la razón entre
hematíes/plaquetas
1. MÉTODO BASADO EN
IMPEDANCIA
ANALIZADORES PARA
RECUENTO DE PLAQUETAS
MÉTODOS DE RECUENTO
ÓPTICO
1. Recuento óptico unidimensional y bidimensional.
2. Recuento óptico de plaquetas fluorescentes – citometria de fluorescencia (Optical light
scatter/fluorescence).

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 3. MÉTODO DE RECUENTO INMUNOLÓGICO DE
PLAQUETAS
El principio de esta metodología involucra sangre anticoagulada con EDTA con anticuerpos
monoclonales antiplaquetarios, los cuales esta conjugado con una sustancia fluorescente, por
ejemplo, el isotiocianato de fluoresceína (FITC)
 LA TÉCNICA INMUNOLÓGICA AUTOMATIZADA
TIENE VENTAJAS OBVIAS Y SERÁ MUY ÚTIL EN
SITUACIONES CLÍNICAS EN LAS QUE SE
REQUIEREN RECUENTOS DE PLAQUETAS RÁPIDOS
Y PRECISOS.
 PLAQUETAS RETICULADAS

Son ricas en ARN y son reflejo de la capacidad de la médula ósea para producir plaquetas. El colorante
fluorescente polimetina es usado para teñir acido nucleicos de la plaquetas reticulada, membrana plaquetaria y
gránulos plaquetarios. Es utilizada para predecir la recuperación de plaquetas seguida de la mielosupresión por
quimioterapia, así como diferenciar la purpura trombocitopénica idiopática de una anemia aplásica
ANALIZADORES
HEMATOLOGICOS PARA EL
RECUENTO DE PLAQUETAS
RECUENTO DE
MICROPARTÍC
ULAS
 ¿QUÉ SON LAS
MICROPARTÍCULAS
PLASMÁTICAS?
 Fragmentos celulares.
 Apoptosis o activación.
 Antes considerados debris celular.
 0.1 um - < 1.5um
 Se diferencian de exosomas (40-100 nm)
y cuerpos apoptoticos (>1.5um)
 Hematies, células del endotelio,
plaquetas y globulos blancos.
 IMPORTANCIA DE SU
CUANTIFICACIÓN
 Células liberan MP posiblemente revertir proceso apoptotico, escapaar fagocitos, enviar “señales”
a los fagocitos o células cercanas.
 Aumento en diferentes tipos de enfermedades.
 Solo como estudio.
 Dificil cuantificación.
PREANALITICA
 Punción no traumática
 Aguja 21G a menos.
 Descartar los primeros 3 mL
 No se recomienda EDTA ni Heparina.
 Anticoagulante de elección citrato: CTDA, menos activación de PMP
 No aceptar muestras hemolizadas o con coágulos.
 Procesar lo antes posible, preferentemente dentro de 1 hora de colectada la muestra.
PFP: 1era centrifucación.
1550g x 20 min.

CENTRIFUGACIÓN.
T° ambiente (20-25°C)

2da centrifucación: Pellet de microparticulas.

Trabajar PFP dentro de las 4 horas.
Se puede almacenar -80°C

Protocolos de 3 a más centrifugaciones a partir de PRP.

Pueden realizarse lavados del pellet. NO excederse.
NO hay concenso.
CUANTIFICACIÓN:
CITOMETRIA DE FLUJO
 El método más usado.
 No ayuda a medir el tamaño de las MP
 MP > 300 nm
 Beads o plaquetas como estándar.
 Disminuir contaminación ultrafiltrando
liquido de sistema.
CUANTIFICACIÓN: CITOMETRIA DE FLUJO

 Marcaje:
 Annexin V: PS
 Plaquetas: CD41+, CD62P+, CD61+,
Pac1+.
 Megacariocitos: CD62P-
 Hematíes: CD235a
 Leucocitos: CD14, CD4, CD8, CD66b
 Células endoteliales: CD144, CD146
CUANTIFICACIÓN: ELISA
 Mismo anticuerpos usados en citometría.
 Resultados en U/ml
 Las MP capturadas pueden ser
detectadas/cuantificadas por una sonda
secuandaria(anticuerpo-peroxidasa)o
usando la propiedad funcional de la
MP( acción procoagulante)
 Interferencia con antígenos solubles.
 Podría ser usado en apliaciones clínicas.
 Desarrollo de métodos alternativos.
NUEVOS MÉTODOS: IMPEDANCE
BASED FLOW CYTOMETRY
 Usa el principio de impedancia de Coulter.
 Mide simultaneamente los cambios de
impedancia electrica y la fluorescencia.
 Pulso proporcional al volumen.
 Calibrado con microesferas de
poliestireno.
 El tamaño de detección depende de la
celda de flujo. 0.3 um
NUEVOS MÉTODOS: AFM
 Atomic force microscopy
 Sensa la superficie de la muestra con un
tip de silicona <100 A diametro
 Cantilever: 100–200 μm largo.
 El detector mide la desviacion del
cantilever.
 Se generan imagenes topograficas 3D de
la superficie
 Cuantificación de MP usando un software
de procesamiento de imágenes.
 Proceso demora unas 2 horas
OTROS MÉTODOS
 Microscopia electronica.
 MIcrocopia confocal de fluorescencia
 Cromatografía liquida de alta resolución.
 Espectrofotometría de masas.
 Movimiento browniano de particulas en
solución: DLS y NTA.
BIBLIOGRAFÍA
 Platelet Counting. Harrison, P. y Briggs, C. Platelets, 3rd edition. 2013.

 Measurement of Platelet Count, Mean Platelet Volume, and Reticulated Platelets. Roshal, M. y Reyes, M. Transfusion Medicine and
Hemostasis Clinical and Laboratory Aspects. 2019.
 Platelet-derived microparticles analysis: Techniques, challenges and recommendations. Kailashiya, J. Analytical Biochemistry. 2018.

 Characterizing blood microparticles: Technical aspects and challenges. Shet, A. Vasc Health Risk Manag. 2008. 4(4): 769–774.

 Cellular microparticles: what are they bad or good for? Freyssinet, J. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2003. 1: 1655–1662

 Circulating microparticles: square the circle. Barteneva y cols.BMC Cell Biology 2013. 14:23

 Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications. Piccin, A y cols. Blood Reviews. 2007. 21, 157–171.

 Circulating Microparticles: A Potential Prognostic Marker for Atherosclerotic Vascular Disease. Boulanger, C. cols. Hypertension.
2006. 48(2);180-186
 Pre-analytical and analytical issues in the analysis of blood microparticles. Yuana, Y. y cols. 2011. Thrombosis and Haemostasis. 105
(3). 396-408
GRACIAS!!