Elena Hidalgo

ehidalgo@pvs.uva.es
Despacho HF23 (Edificio verde)
60%

15% : GUIÓN

15%: GUIÓN

10%
 Profesora de Genética
◦ Genética y Mejora de la Vid
◦ Biología Molecular
◦ Biotecnología
 Investigación en identificación,
caracterización, distribución y
conservación de plantas y otros
organismos
 Directora del LDG: Lab de Diagnóstico

Genético
LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO GENÉTICO
Dra. Elena Hidalgo
 Máster
Calidad, desarrollo e innovación de alimentos

1: Microbiología industrial

ELENA HIDALGO RODRÍGUEZ

Septiembre 2013
La utilización de organismos vivos
para obtener productos útiles a la
humanidad.
¿Qué organismos?
•hongos, bacterias y levaduras unicelulares
•células vegetales y animales, plantas o animales

•¿Qué productos?
•alimentos, medicamentos, productos químicos
 ETAPA PRECIENTÍFICA
 Se aprovechan los
productos de las
fermentaciones
espontáneas
 Vino, cerveza, pan,
yogures...
 No se conocen los
procesos
 Basado en la intuición y la
experiencia
 Mal control
ETAPA CIENTÍFICA
 Preguntas
◦ ¿Qué? ¿Cómo?
◦ ¿Por qué? ¿Cuándo?
 Respuestas:
◦ Avances química, física,
biología, fisiología,
microbiología,
medicina...etc
◦ Se empiezan a comprender
algunos procesos, y se
sigue avanzando en el
conocimiento (progresiva)
 Conocimientos pre-científicos
◦ Algunos alimentos, en determinadas
condiciones se transforman en otros, más útiles,
más duraderos o con otras propiedades
 Etapa científica:
◦ Esas transformaciones se deben a la actividad
metabólica de algunos microorganismos
◦ Dicha actividad metabólica depende de la acción
de los enzimas
◦ La presencia de enzimas en los organismos está
determinada y regulada por genes
 Fermentaciones:
◦ Vino, cerveza, pan, Yogures, quesos, encurtidos,
embutidos, Piensos
 Otros alimentos:
◦ Nuevos alimentos, aditivos, “mejorantes”, etc...
 Abonos, ciclos de elementos
◦ Compost, fitorremediación (eliminación de vertidos
tóxicos, mareas negras, ..)
 Medicinas, antibióticos, vacunas, hormonas
 Enzimas: “cuajo químico”, detergentes, limpieza,
 Plásticos, polímeros, nuevos materiales, nuevos
combustibles....
 Los microbios contienen
enzimas / son “fermentos”
 Los microbios tienen
progenitores: no generación
espontánea
 El fuerte calentamiento
destruye los microbios
 Los microbios están en todas
partes (aire)
 Padre del Método científico:
Experimentación-deducción
 Conocer los procesos bioquímicos y los
genes de los que dependen las
fermentaciones, para manejarlas mejor:
◦ Inducirlas, controlarlas, modificarlas...
◦ Combinarlas, anular efectos secundarios...

Ampliación de posibilidades

Aparecen preguntas y riesgos asociados

Actuación de la presión social informada

1. Comprensión de los procesos
◦ Fisiología / bioquímica: enzimas y moléculas
implicadas
◦ Genética / Biología molecular: Conocer los genes (nº,
organización, regulación..). Marcadores moleculares.
2. Manejo de los organismos implicados
◦ Microbiología
◦ Agricultura / cultivo “in vitro”
◦ Ganadería
3. “Mejora” de los organismos implicados
◦ Ingeniería Genética
◦ Técnicas de transformación de organismos y selección
 Microbiología: Rama de la biología que
estudia a los microorganismos (seres vivos de
pequeño tamaño)
◦ Bacterias (procariotas)
◦ Algas y protozoos
◦ Hongos (incluyendo levaduras)
◦ Organismos acelulares: virus y priones
Organización celular: Procariotas (bacterias); Eucariotas (algas,
protozoos y hongos) y organismos acelulares (virus y priones)

Formas de vida: Parásitos, Simbióticos, Oportunistas, Patógenos,

Saprófitos.

Habitat: Agua (dulce y salada), suelo, aire, alimentos

Tipo metabólico: autótrofos/heterótrofos

Necesidad de oxígeno: aerobios, anaerobios y facultativos

Tipo de reproducción: sexual, asexual y mediante fenómenos

parasexuales (transformación, conjugación y transducción/
anastomosis). Capacidad de producir esporas
Presencia de plásmidos: DNA ccc
 Conjugación:

 Transformación

 Transducción:
 Microorganismos unicelulares
 Tamaño entre 0,5 y 5µm
 Formas:
◦ cocos, bacilos y hélices (espirilos)
◦ con o sin cilios y flagelos (motilidad)
 Procariotas, sin membranas ni
orgánulos internos.
 SV más ubicuos y abundantes:
◦ aguas calientes y ácidas,
◦ sobre desechos radioactivos…
 Metabolismo variado:
◦ Uso de nutrientes y energía
◦ Metabolitos secundarios
Modelo de genética y Bioquímica:
Escherichia coli
Eucariotas quimiohetrótrofos que se
alimentan de nutrientes disueltos en
medio. Modo de vida saprofito o parásito.
•MOHOS: pluricelulares, filamentosos, micelio
ramificado formado por hifas. Reproducción asexual por
esporas y reproducción sexual por la fusión de hifas
especializadas.
•Ej: moho del pan (gén. Rhizopus), moho de la fruta
(gén. Penicillium, produce anibióticos).
•LEVADURAS: Hongos unicelulares con reproducción

asexual por gemación y sexual por esporas.

•Ej: Saccharomyces (fermentación alcohólica
–vino y cerveza- y producción de pan);
•Candida: patógenos humanos.
FASES: inicial (latencia); logarítmica (exponencial);
estacionaria; muerte o final
FORMAS DE CULTIVO: cerrado / abierto
MEDIOS DE CULTIVO determinados / indeterminados;
líquidos / solidificados con agar
Quimiostato
 Esterilización
◦ Calor húmedo (autoclave) o seco (hornos y estufas)

◦ Otras técnicas: filtración, radiaciones, compuestos

químicos
 Recuento en placas (hasta 250 UFC/mL)
◦ Diluciones seriadas
◦ Cultivos selectivos o diferenciales (nutrientes
limitantes, antibióticos)
 Número más probable (NMP)
 Enriquecimiento

PROBLEMAS:
 Microbios dañados
 Viables no cultivables (VNC)

◦ Salmonella, Shigella, Escherichia, Vibrio,

Campylobacter…etc
 pH:
◦ pH crítico = desnaturalización de proteínas
◦ El metabolismo celular modifica el pH y mantenerlo neutro
(pH ̴ 7) supone gasto energético.
◦ Acidificar protege de crecimiento bacteriano
 Temperatura:
◦ Psicrófilos, Psicrótrofo, Mesófilos, Termófilos
◦ Temperaturas elevadas, presión y tiempo de exposición
afectan viabilidad celular
 Actividad de agua
◦ Resulta limitante para crecimiento microbiano
◦ La adición de compuestos hidrófilos (sal, azúcar) baja la
aW, inhibiendo el crecimiento microbiano (≤0,85)
◦ Desecación
 Combinaciones de factores limitantes a
niveles subcríticos permiten controlar
crecimiento de forma más eficaz que uno
solo
◦ altas temperaturas (valor F) / bajas temperaturas (valor t)
◦ actividad de agua / Acidez /potencial redox
◦ microorganismos competitivos (por ejemplo, bacterias
ácido lácticas)
◦ conservantes (nitrito, sorbato, sulfito)

http://biogenmol.blogspot.com.es/2010/11/
concepto-de-vallas-en-la-conservacion.html
 Pasteur: vida sin oxígeno
 Bioquímica: catabolismo de carbohidratos

en ausencia de oxígeno utilizado por

algunas bacterias.
 Acepción común: Bioprocesos que cambian

las propiedades de un alimento en ausencia

de oxígeno, aunque hay excepciones
◦ Como subproductos se generan ácidos,
compuestos aromáticos y carbonatación
◦ También se generan cambios en la estructura y
mayor biodisponibilidad de algunos nutrientes
 La liberación de protones (oxidación) libera energía
◦ Glucosa + O2 = CO2 + H2O + energía (34 ATP)
 En este caso, el O2 es el aceptor de electrones.
 La energía se acumula en forma de ATP por la
fosforilación oxidativa y transferida a otros compuestos
mediante transfosforilación.
 En ausencia de oxígeno, otros compuestos reciben
los electrones produciéndose oxidaciones parciales
que generan mucha menos energía: etanol, ácidos,
etc…
◦ Los derivados de la fermentación (alcohol, ácidos…)
están más oxidados que los productos de origen
(azúcares), pero menos que el CO2
 La producción de alimentos fermentados tiene
dos aspectos importantes a considerar:
◦ La actividad metabólica de los microorganismos
durante la fermentación y el almacenamiento
◦ Los parámetros que afectan al procesado y el
almacenamiento del producto
 Vía Embden Meyerhof-Parnas: genera 2 ATP
◦ Glucosa---2 Ác. Pirúvico
◦ Ac. Pirúvico (ácidos tricarboxílicos)
 Aerobios: CO2 y H2O
 Anaerobios: Ac. Acético, Láctico, Aldehídos y Etanol
 Vía Entner-Doudoroff: genera 1 ATP
◦ Importante en fermentaciones lácticas (lactosa es
disacárido de glucosa + galactosa). Los organismos
EMP no metabolizan la galactosa, pero sí si usan ED
 Vía heterofermentativa: genera 1 ATP
◦ Única vía que utiliza pentosas
 Vías Homolácticas: EMP y ED
◦ Único producto final: Acido láctico
◦ Lactococcus, Pedicoccus y algunos Lactobacillus

 Vías Heterofermentativas:
◦ Leuconostoc y algunos Lactobacillus
◦ Genera múltiples productos finales a través de la
generación y uso de las pentosas

 El ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) enlaza

las vías glicolíticas con la respiración celular
 Células vivas, en desarrollo: yogurt.

 Bioproductos: ácido láctico, ácido acético,

aminoácidos esenciales, bacteriocinas.

 Componentes celulares: proteínas celulares,

dextranos, celulosa, enzimas.
 Leche (vaca, cabra, oveja, burra, búfala,
camella,…)
 Carne (ternera, cerdo, oveja, cabra, caza,

conejo.….)
 Pescado
 Huevos (gallina, pata, avestruz)
 Vegetales, frutas, zumos, cereales, tubérculos

y semillas
 Preservar hortalizas y frutas
 Desarrollar propiedades sensoriales características:
aroma, sabor y textura
 Destruir toxinas presentes naturalmente y
compuestos indeseados de la materia prima
 Mejorar la digestibilidad, especialmente de algunas
legumbres
 Enriquecer productos con metabolitos microbianos
deseados, como ácido láctico o aminoácidos
 Crear productos nuevos para mercados nuevos
 Aumentar el valor de la dieta
 Espontánea o natural: favorecer el desarrollo
de microorganismos deseados.

 Empleo de masas madre o pies de cuba.

 Fermentación controlada: inoculación de una

gran población de un cultivo puro o mixto, a
veces con tratamiento previo por calor.
 Productos lácteos fermentados: todos los
constituyentes de la leche permanecen en el
producto final a excepción de los
metabolizados.
 Quesos: se eliminan constituyentes de la
leche para obtener el producto final.
 Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc
 Lactococcus

 Lactobacillus

 Pediococcus

 Leuconostoc
 Diversos géneros y especies
◦ Homofermentativas : ácido láctico
◦ Heterofermentativas : aromas y sabores variados
◦ Microbiota secundaria:
 Alcoholes, etc (kéfir y kumis). Si se esterifican, mayor
gama de sabores
 Acidos diversos (acético, cítrico..etc), diacetilo, glicerol,
acetaldehídos y CO2 (ojos):
 Pasteurización mata BAL, lo que permite usar
cultivos “starters” o iniciadores: mayor control
del proceso (acidez final, velocidad de
crecimiento..etc)
 De su composición dependen características
relacionadas con sus propiedades sensoriales
◦ Humedad,
◦ Retención de proteínas
◦ Pérdida de minerales,
◦ Interacciones entre proteínas
◦ Hidratación proteica y proteolisis (liberación de aa
esenciales y péptidos de tamaño variable: amargos!!)
 Problemas:
◦ Animales tratados con antibióticos (alteran starters)
◦ Presencia de bacteriófagos
◦ Baja calidad de la leche
◦ Enfriamiento lento o tardío del producto
 Yogur
 Suero de mantequilla(EE.UU., Canadá)
 leche acidophilus (EE.UU., Canadá)
 kiselo mlyako (Bulgaria)
 sauermilch o dickmilch (Alemania)
 zure melk (Países Bajos)
 lapte btut (Rumanía)
 fi lmjölk o fi l (Suecia)
 surmelk o kulturmelk (Noruega)
 piimä y viili (Finlandia)
 amasi (Sudáfrica)

También en vinos (fermentación maloláctica) y en maduración

de embutidos y otros productos cárnicos
 Mantequilla: Lactococcus con o sin Leuconostoc
cremoris
 Yogurt: Streptococcus thermophilus y Lactobacillus
delbrueckii, algunos además Lab. acidophilus,
casei, rhamnosus y Bifidobacterium
 Leche acidófila: Lab.acidophilus
 Leche bífidus: Bifidobacterium
 Yakult: Lab.casei, puede llevar Bifidobacterium
 Kefir: Lab.kefir (levaduras, Leuconostoc,
Lactobacillus y Lactococcus)
 Kumiss: Lab.delbrueckii y levaduras
 Sin maduración:
◦ Cottage: Lac.lactis ssp. lactis y cremoris y Leuconostoc
mesenteroides ssp. cremoris
◦ Mozzarella: Str.thermophilus y Lab.delbrueckii ssp.
bulgaricus
 Madurados:
◦ Blandos:
 Brie: Lac.lactis; Penicillium y levaduras
◦ Semiduros:
 Gouda: Lac.lactis y Leuconostoc; Propionibacterium
secundario
 Azul: Lac.lactis, Leuconostoc; Penicilium roquefortii,
levaduras y micrococos secundarios
◦ Duros:
 Cheddar: Lac.lactis; lactobacilos y pediococos secundarios
 Suizo: Str.thermophilus, Lab.helveticus y Propionibacterium;
enterococos pueden ser secundarios
 Bacterias acidolácticas (BAL): Lactococcus,
Leuconostoc, Lactobacillus y Pediococcus.
 Casi todos los vegetales pueden ser fermentados
de manera natural, dada su riqueza en bacterias
acidolácticas.
 Col, aceitunas, pepinillos, zanahorias, judías,
maiz, tomates, coliflor, cebollas, rábanos, coles de
Bruselas…
 La mayoría fermentación espontánea, en algunos
casos controlada. Uso de strarters
 También fermentan levaduras y mohos

 Chucrut y encurtidos
 Factores tecnológicos
◦ Troceado uniforme (ayuda tratamiento y envasado)
◦ Eliminación de oxígeno (residuos, por aerobios)
 Ingredientes
◦ Sal, ácidos (mantienen color y eliminan microbios
indeseables)
 Calidad de materia prima:
◦ tamaño, sanidad
 Microbiota natural
◦ eliminación por blanqueo o cocido previos
◦ Inactiva también enzimas
◦ Uso de starters, poco usual
◦ Puede alterar aspecto, sabor y duración del producto
 Bacterias acidolácticas (BAL): Pediococcus
acidilactici, Ped. pentosaceus, Lab.plantarum,
Micrococcus y Sta.carnosus.
 Embutidos: Mezcla de carne, grasa, sal, azúcar,
agentes de curado y especias.
◦ Embutir y fermentar naturalmente o con cultivos
iniciadores.
 La microbiota natural es deteriorante (bacterias
aerobias Gram negativas)
◦ Los ácidos producidos por las BAL y los agentes de curado
controlan el desarrollo de patógenos y bacterias
alterantes.
◦ Pueden ser secados (reducen aW) / ahumados / calentados
para asegurar su calidad microbiológica y su vida útil.
 Cultivos iniciadores comerciales en muchos casos.
 Picado
 Mezcla de ingredientes:

◦ Sal y especias
◦ nitritos (color rosado de carne, inhibe Clostridium),
◦ agentes curantes,
◦ carbohidrato fermentable (glucono=delta=lactona)
◦ Iniciadores comerciales o no o porción del lote
anterior (strater)
 Fermentación y embutido
 Curado (envejecimiento), secado, ahumado
 Los metabolitos de la actividad microbiana
pueden ser utilizados como aditivos
alimentarios.

 Los sustratos son:

◦ Carbohidratos: almidón, glucógeno, lactosa,
sacarosa, maltosa, glucosa, fructosa y pentosas
◦ Nitrogenadas: proteínas, péptidos y aminoácidos
◦ Lípidos: triglicéridos, fosfolípidos, ácidos grasos
y esteroles
 Las fermentaciones producidas son:
◦ Carbohidratos:
 Fermentación homoláctica de hexosas
 Fermentación heteroláctica de hexosas
 Ruta de las pentosas-fosfato
 Fermentación de hexosas por Bifidobacterium
 Producción de diacetilo a partir de citrato
 Producción de ácido propiónico por
Propionibacterium
 Capaces de producir ácido láctico a partir de carbohidratos.
 Géneros: Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus,
Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Aerococcus,
Vagococcus, Tetragenococcus, Carnobacterium, Weissella,
Oenococcus.
 Lactococcus: Lac.lactis en fermentaciones lácteas
 Streptococcus: Str.thermophilus en fermentaciones lácteas
 Leuconostoc: Leu.mesenteroides en fermentaciones lácteas y
de vegetales
 Pediococcus: Ped.pentosaceus y Ped.acidilactici en
fermentaciones de vegetales, carne, cereales y otras
 Oenococcus: fermentación maloláctica en vinos
 Lactobacillus: en fermentaciones lácteas, adicionado a diversos
alimentos, fermentaciones de vegetales y de carne, elaboración
de sake
 Bifidobacterium: adicionadas a diversos
productos lácteos para restaurar y mantener
la microbiota intestinal humana.
 Propionibacterium: asociadas a la
fermentación de quesos de tipo suizo.
 Brevibacterium: asociadas a la maduración de

ciertos quesos.
 Acetobacter: productoras de ácido acético a

partir de etanol. En la elaboración del

vinagre.
 Levaduras: la más importante es
Saccharomyces cerevisiae, para producir
vino, cerveza, licores y alcohol industrial,
para obtener invertasa y para aromatizar
sopas.

 Hongos: muchos son alterantes o sintetizan

micotoxinas. Se utilizan algunas especies de
Aspergillus y Penicillium, y menos de
Rhizopus y Mucor en fermentaciones de
alimentos. En la elaboración de sake, salsa
de soja y en algunos quesos.
 Cepa seleccionada de un microorganismo de
calidad alimentaria con metabolismo estable
y conocido que se utiliza para producir
alimentos fermentados con características
organolépticas determinadas.
 Cultivos tradicionales, liofilizados y cultivos
actuales, concentrados. Ventajas:
◦ Aplicación simplificada
◦ Actividad elevada
◦ Riesgo de contaminación reducido
◦ Ahorro de tiempo
◦ Calidad del producto estable
 Antagonismo entre cepas: en cultivos mixtos, las condiciones
pueden favorecer a una de las cepas, afectando a las
características del producto.
 Pérdida de una característica deseada: en función de la
estabilidad genética (plásmidos) al almacenamiento,
subcultivos, condiciones de desarrollo, estrés fisicoquímico,
congelación…
 Muerte y daño celulares: la efectividad de los cultivos
congelados o liofilizados depende de:
◦ La existencia de un elevado número de células viables
◦ La fase de latencia del cultivo sea corta, de manera que empiecen a
reproducirse rápidamente
◦ Recongelación, pérdida de temperatura, mala rehidratación…
pueden afectar al número y la viabilidad de las células. De ahí la
importancia de seguir las indicaciones de la empresa productora del
cultivo.
 Inhibidores en la materia prima: antibióticos, desinfectantes,
aditivos…
 Bacteriófagos: virus filtrables de bacterias,
ampliamente extendidos en los alimentos.
◦ Fagos líticos o temperados.
◦ Especificidad por el hospedador.
◦ Métodos de control:
 Procesado higiénico
 Empleo de medios libres de fagos
 Rotación de cepas
 Empleo de cultivos mixtos, de manera que el ataque de un
fago no cause el fallo del cultivo iniciador
 Células viables de bacterias ácidolácticas: adición de
células mesófilas de Lactococcus lactis, Lactobacillus
y Pediococcus para controlar el desarrollo de
microorganismos alterantes y/o patógenos durante
la conservación de alimentos a temperaturas de 5ºC
o inferiores.

 Ácidos orgánicos:
◦ Ácido láctico de Lactobacillus: potenciador de aroma
◦ Ácido acético de Acetobacter aceti: antimicrobiano
◦ Ácido propiónico de Propionibacterium: antifúngico fund.
◦ Microorganismos GRAS (generally regarded as safe)
utilizados como aditivos alimentarios para mejorar el aroma
y la duración de los alimentos
 Diacetilo: diversas especies de acidolácticas,
antibacteriano, uso limitado por su aroma.
 Peróxido de hidrógeno: producido por
bacterias acidolácticas en condiciones de
aerobiosis.
 Reuterina: producida por Lactobacullis
reuteri en presencia de glicerol.
 Bacteriocinas: péptidos bioactivos producidos por
bacterias Gram+ y Gram-. Las producidas por
algunas cepas de bacterias acidolácticas y ácido
propiónicas son de especial interés en la industria
alimentaria por su actividad antibacteriana.
◦ Las bacteriocinas de las bacterias ácidolácticas son
bactericidas frente a las células sensibles, y la muerte ocurre
rápidamente a bajas concentraciones.
◦ Las bacterias Gram+ son normalmente sensibles.
◦ Las bacterias Gram- son normalmente resistentes, aunque
pueden volverse sensibles por estrés físico o químico.
◦ Algunas bacteriocinas solo son activas frente a cepas muy
próximas, otras presentan un gran espectro de acción frente
a diferentes géneros y especies.
◦ Una cepa es inmune a su propia bacteriocina, y
sensible o resistente frente a otras.
◦ Una cepa puede producir más de una bacteriocina.
Dentro de una especie, distintas cepas pueden
producir la misma o diversas bacteriocinas.
◦ Cepas de diferentes especies y géneros pueden
producir la misma bacteriocina.
◦ Diferentes especies de un género pueden producir
diferentes bacteriocinas.
◦ Diferentes cepas y especies pueden producir
variantes de una misma bacteriocina.
◦ Algunas bacteriocinas que se consideraban
diferentes resultan ser iguales cuando se
determina su secuencia aminoacídica.
◦ Difieren mucho en su espectro de actividad antibacteriana frente a
Gram+.
◦ Su potencia frente a una cepa sensible varía mucho.
◦ La actividad bactericida de una bacteriocina aumenta a pH ácido,
temperatura alta, en presencia de un detergente y frente a células
en crecimiento exponencial.
◦ Incluso entre las cepas más sensibles, existen células resistentes a
una bacteriocina, pero esta propiedad no es estable, ya que en
ausencia de la bacteriocina se vuelven de nuevo sensibles.
◦ Una cepa resistente a una bacteriocina puede ser sensible a otra
bacteriocina.
◦ Las esporas de una bacteria sensible a una bacteriocina son
resistentes a la misma, pero cuando germinan se vuelven sensibles
a ella.
 Metabolitos de levaduras: algunas levaduras,
incluyendo cepas de Saccharomyces cerevisiae,
producen proteínas con actividad
antimicrobiana (toxinas killer o zimocinas) que
mediante manipulación genética pueden
aumentar su espectro de acción,
especialmente frente a hongos.
 Muchos metabolitos microbianos pueden
utilizarse como aditivos alimentarios para :
◦ Mejorar el valor nutricional
◦ Aroma
◦ Color
◦ Textura
◦ Algunos son: proteínas, aa esenciales, vitaminas,
compuestos aromáticos, potenciadores del sabor,
péptidos salados, péptidos dulces, colorantes,
estabilizantes y ácidos orgánicos.
◦ Deben proceder de microorganismos seguros
◦ Posibilidad de uso de ingeniería genética