Biomembranas: transiciones de fase

medidas por espectrofotometría de

fluorescencia

Integrantes: Alondra Cornejo – Jonathan Parra- Valeria Guajardo- Felipe Sánchez.

Ramo: Fisicoquímica de macromoléculas
Profesor: Luis Pouchucq
Carrera: Ingeniería en biotecnología
Fecha de entrega: 21/07/2023
Introducción
• En el presente se presenta un estudio exhaustivo que explora las propiedades físicas de las
membranas celulares y cómo estas propiedades están influenciadas por diversos factores
como la temperatura, la presión, el pH, el campo eléctrico y la concentración de sal.
• Para comprender mejor estas transiciones de fase y su impacto en las membranas celulares,
se utilizan técnicas como la calorimetría diferencial de barrido (DSC) y la espectroscopía de
fluorescencia. Estas técnicas permiten medir la correlación de estado de fase y las
propiedades de la membrana, especialmente en membranas lipídicas creadas
artificialmente, como vesículas y bicapas lipídicas soportadas.
• El objetivo principal de este estudio es determinar si este concepto también es válido para
las membranas celulares biológicas. Si se confirma, no solo se podrán predecir las respuestas
de las células a los cambios ambientales, sino que también se podrán manipular funciones
de la membrana, como la permeabilidad simplemente ajustando parámetros físicos como la
temperatura o el pH.
 Adquisición del espectro:
Se utilizó un espectrómetro y una fibra óptica conectada a una
configuración de control de temperatura personalizada. Se
analizaron 600 μl de suspensión de muestra que contenía la
membrana de interés en el capilar de vidrio, se analizó entre -40 a
95◦C.

Células HeLa empobrecidas en

colesterol:
Se prepararon células HeLa
Vesículas de fosfolípidos
empobrecidas en colesterol mediante Materiales y multilaminares:
la adición de metil-­beta­ ciclodextrina
5 mM después de tinción y métodos Se prepararon vesículas de fosfolípidos
tripsinización de la manera descrita multilaminares en botellas de vidrio
anteriormente. secando disuelto en cloroformo, se usó
un flujo de nitrógeno y exposición al vacío
por 60 min para formar las vesículas y se
les hincho con ultrasonido.
Células HeLa y células B35:
A 37 ◦C en atmósfera saturada. Los
medios de cultivo fueron DMEM para
células HeLa y DMEM con alto contenido
de glucosa para B35, ambos
suplementados con suero bovino fetal al
10 %, las membranas se tiñeron en el
medio añadiendo Laurdan 28 μM.
 En la Figura 1a, se muestra la suspensión de muestra en el capilar
de vidrio y la fibra óptica conectada al espectrómetro.

EXPLICACION DE En la Figura 1b, se muestra el colorante incrustado en la

membrana Laurdan, que permite la determinación del estado de
fase de las muestras de membrana lipídica debido a su espectro de
RESULTADOS emisión sensible a la polaridad.

En la Figura 1c, se muestra cómo se determinan las intensidades

de fluorescencia que se originan en los dominios de lípidos
ordenados/desordenados mediante el ajuste de datos para
calcular la polarización generalizada como medida del estado de
fase de la membrana.
Figura 1. Configuración experimental y análisis de datos. A Para el análisis óptico, la suspensión de la muestra se coloca en un capilar de vidrio cuya
temperatura se puede controlar en un amplio rango de temperatura. La emisión de fluorescencia se registra mediante un espectrómetro conectado a una
fibra óptica. b El colorante incrustado en la membrana Laurdan permite la determinación del estado de fase de las muestras de membrana lipídica debido a
su espectro de emisión sensible a la polaridad. C Las intensidades de fluorescencia que se originan en los dominios de lípidos ordenados/desordenados se
determinan mediante el ajuste de datos para calcular la polarización generalizada como medida del estado de fase de la membrana.
 Figura 2.Análisis de vesículas de fosfolípidos. A: Polarización generalizada
dependiente de la temperatura de varias vesículas multilaminares de fosfolípidos
medidas durante el calentamiento. El recuadro muestra la derivada con respecto
a la temperatura de las vesículas DOPC con un pico en T = -16,5◦C que indica la
transición de fase ordenada/desordenada. B: Derivado con respecto a la
temperatura de varias vesículas lipídicas que muestran las mismas transiciones
de fase ordenadas/desordenadas que sus perfiles de capacidad calorífica
medidos por DSC en C.

La Figura 2a muestra cómo la curva GP (generalmente se refiere a la polaridad

general de la membrana) cambia con la composición de lípidos. En este gráfico, se
puede ver que la curva GP se desplaza hacia valores más bajos correspondientes a un
mayor desorden en la membrana a medida que aumenta la concentración de
lípidos insaturados.

La Figura 2b muestra cómo la entalpía de fusión. ∆H disminuye

con la concentración de lípidos insaturados.

La Figura 2c muestra cómo la temperatura de fusión Tm

disminuye con la concentración de lípidos insaturados.
Figura3. Comparación de vesículas de fosfolípidos y membranas celulares HeLa. un, b
Espectros de emisión normalizados de vesículas multilaminares/células HeLa 14:0PC en
función de la temperatura y las imágenes de microscopía de fluorescencia de las muestras
(campo de visión de aproximadamente 420×320 micras2). C GP de vesículas
multilaminares 14:0PC/células HeLa en función de la temperatura y sus derivados
correspondientes después de la temperatura en dos ejes de diferente escala.

La Figura 3a muestra cómo la entalpía de fusión de la transición

casi no se ve afectada por la adición de octano.

La Figura 3b muestra cómo la adición de octanol provoca un cambio

máximo global de ∆T = -3 K en la curva GP (generalmente se refiere a
la polaridad general de la membrana).

La Figura 3c muestra cómo la adición de octanol provoca un cambio

de GP equivalente a aproximadamente ∆T = -2 K a ∆T = -5 K
desplazamiento a la izquierda en el régimen fisiológico.
Figura 4. En este estudio se analizó el estado de fase de las membranas
celulares HeLa y sus extractos lipídicos en distintas condiciones. Se
evaluaron los valores de GP (posición del pico de transición)
dependientes de la temperatura para entender cómo las membranas
responden a diferentes situaciones, como adaptación a bajas
temperaturas, agotamiento de colesterol y extracción de lípidos. Se
utilizaron funciones sigmoideas de Boltzmann para aproximar los datos
y calcular parámetros como el punto de inflexión (Tm), la cooperatividad
(C) y la entalpía de fusión (∆H). También se compararon los cambios de
temperatura de fusión (∆Tm), cooperatividad (∆C) y entalpía de fusión
(∆∆H) en las distintas condiciones. Los resultados destacan cómo las
propiedades de las membranas celulares se ven afectadas por estos
factores, proporcionando información relevante sobre su
comportamiento en diferentes entornos.

La Figura 4a muestra los valores de GP en un gráfico principal y un

recuadro que muestra una ampliación de la curva GP para las membranas
celulares HeLa no tratadas y las adaptadas a baja temperatura (30°C). En
este recuadro, se puede ver que el agotamiento del colesterol provocó un
cambio en la curva GP, especialmente alrededor de T=30°C hacia valores
más bajos correspondientes a un mayor desorden en la membrana. Este
cambio podría atribuirse a la reducción de la repulsión del agua debido al
colesterol.

La Figura 4b muestra cómo la cooperatividad determinada por la inclinación

de una función de ajuste sigmoide de Boltzmann en el punto de inflexión
aumenta en un 23% debido al agotamiento del colesterol.
La Figura 4c muestra cómo la entalpía de fusión. ∆H disminuye en las
membranas celulares HeLa agotadas de colesterol y adaptadas a baja
temperatura (30°C) en comparación con las no tratadas.

La Figura 4d muestra cómo la temperatura de fusión Tmetro disminuye

en las membranas celulares HeLa agotadas de colesterol y adaptadas a
baja temperatura (30°C) en comparación con las no tratadas.

La Figura 4e muestra cómo la transición de fusión del extracto lipídico

cambia con la composición de lípidos.

La Figura 4f muestra cómo la relación entre la temperatura de fusión y la

composición de lípidos cambia en las membranas celulares HeLa y sus
extractos lipídicos.
 Resultados y discusión
• En primer lugar, los autores encontraron que el orden de los lípidos en la
membrana celular se ve afectado por los procesos de adaptación y los cambios
morfológicos durante la diferenciación o la tripsinización. Esto sugiere que la
funcionalidad celular está conectada con el estado de la membrana. Los autores
también descubrieron que la espectroscopía de fluorescencia y el colorante
Laurdan pueden ser herramientas útiles para estudiar el transporte de
sustancias y señales a través y a lo largo de la membrana celular.
• También señalan que sus resultados podrían tener implicaciones importantes
para la comprensión de enfermedades como el cáncer, que a menudo están
asociadas con cambios en la composición y la organización de la membrana
celular. Además, sugieren que la espectroscopía de fluorescencia y el colorante
Laurdan podrían ser útiles para estudiar la dinámica de la membrana celular en
diferentes condiciones fisiológicas.
• Además, se observó que la presencia de colesterol en las células causaba un
efecto en la transición de fase debido a que reduce la cooperatividad de la
membrana lo que dificulto la medición de las transiciones.
Conclusión
• En conclusión, el estudio muestra que las propiedades de la membrana celular, como la polaridad
general, la entalpía de fusión y la temperatura de fusión, son afectadas por diferentes
condiciones, como la adición de octanol, la exposición anestésica y la composición de lípidos.
• Se encontró que la adición de octanol afecta la polaridad general de la membrana celular,
mientras que la entalpía de fusión de la transición casi no se ve afectada. Además, la exposición
anestésica también afecta las propiedades de la membrana celular en células B35 indiferenciadas
que no forman neuritas.
• La composición de lípidos también afecta las propiedades de la membrana celular, como la
polaridad general, la entalpía de fusión y la temperatura de fusión. Se encontró que la curva GP
se desplaza hacia valores más bajos correspondientes a un mayor desorden en la membrana a
medida que aumenta la concentración de lípidos insaturados. Además, la entalpía de fusión y la
temperatura de fusión disminuyen con la concentración de lípidos insaturados.
• Estos hallazgos pueden ayudar a comprender mejor cómo las células se adaptan a diferentes
condiciones y cómo se pueden diseñar terapias para tratar enfermedades relacionadas con la
membrana celular. Además, el estudio destaca la importancia de la declaración de competencia
de intereses y la disponibilidad de datos para garantizar la transparencia y la integridad en la
investigación científica.