INSTITUTO POLITÉNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
BIOQUÍMICA GENERAL
Reporte de la Práctica: Determinación de colesterol en la yema de
huevo y separación de fosfolípidos por cromatografía en capa fina
Alumnos: Reyes Nathan Ulises y Bautista Bautista Maria Guadalupe
Dr. Gabriel Betanzos Cabrera.
Grupo: 3OM4 Fecha de entrega: 12-11-2021
INTRODUCCIÓN
Los lípidos son un grupo heterogéneo de sustancias,
encontradas tanto en tejidos vegetales como animales, se
caracterizan por ser relativamente insolubles en agua y
solubles en solventes orgánicos, como el éter, cloroformo
y benceno. Los lípidos son una fuente importante de
energía metabólica (ATP), los lípidos se pueden clasificar
en:
Lípidos simples: Lípidos que son insaponificables, debido
a que no contienen ácidos grasos esterificados en su
molécula. En este grupo se incluyen moléculas formadas a
partir de la unión de dos o más unidades de isopreno
como los terpenoides y terpenos o derivados de ellos
como los esteroides.
Lípidos complejos: Son lípidos en los que existen unidades
estructurales de las anteriores unidas por enlaces éster
con algún otro componente de naturaleza polar, como
fosfato, alcoholes e hidratos de carbono hidrofílicos.
Ácidos grasos: Son moléculas que presentan un único
grupo carboxílico unido a una cadena hidrocarbonada
(cola no polar), en la cual el número de átomos de C es ≥
3.
Fosfolípidos: Los también llamados fosfoglicéridos,
fosfoacilglicéridos o glicerofosfolípidos están constituidos
por dos ácidos grasos esterificados al primer y segundo -
OH del glicerol. El tercer grupo -OH está unido por un
enlace fosfodiéster a un grupo de cabeza muy polar.
El colesterol (3-hidroxi-5,6 colesteno) es una molécula
indispensable para la vida, desempeña funciones
estructurales y metabólicas que son vitales para el ser
humano. Se encuentra anclado estratégicamente en las
membranas de cada célula donde modula la fluidez,
permeabilidad y en consecuencia su función.
OBJETIVOS
Aplicar la técnica de cromatografía en la capa fina
para la separación de fosfolípidos de yema de huevo.
Comprender las ventajas de la técnica de separación
respecto a la cromatografía en papel.
Determinar por medio del método Lieberman-
Burchard la concentración de colesterol en la yema
de huevo.
Comprender la importancia de los lípidos.
METODOLOGÍA
Para la separación de fosfolípidos:
1. EXTRACCIÓN DE LOS LÍPIDOS DE LA YEMA DE HUEVO
a) Mezclar media yema de huevo con 15 mL de cloroformo-
metanol (2:1 v/v).
b) Agitar enérgicamente durante 20 minutos en un baño de
hielo y filtrar (medir la cantidad de filtrado).
c) Mezclar el filtrado con 5 mL de KCl 0.1 M y agitar.
d) Dejar reposar para separar las dos fases o centrifugar a
2500 rpm por 5 min.
e) Desechar la fase superior acuosa y utilizar la fase
inferior orgánica para la separación cromatográfica.
1. APLICACIÓN DE LA MUESTRA
Colocar a 1 cm del extremo inferior y debidamente
separadas, 2 μL de dos muestras diferentes de
extracto de lípidos, en una o dos aplicaciones, en
cuatro placas cromatográficas, teniendo cuidado de
no perforar la capa de sílica.
2. DESARROLLO DEL CROMATOGRAMA
Desarrollar las placas cromatográficas en la cámara de
cromatografía, utilizando como fase móvil una mezcla
de cloroformo-metanol- ácido-acético-agua
(68:25:8:4).
3. REVELADO DE LOS CROMATOGRAMAS
a) Rociar una de las placas cromatográficas con el
reactivo de molibdato para fosfolípidos en general. Se
verán manchas de color azul.
b) Rociar otra de las placas cromatográficas con el
reactivo de bismuto para revelar fosfolípidos que
contienen colina, los cuales se verán de color amarillo-
naranja.
c) Rociar la tercera placa cromatográfica con el
reactivo de ninhidrina para revelar fosfolípidos que
contienen grupos amino (calentar la placa a 100º C
durante 2 a 3 minutos en el horno). Al terminar, se
revelarán manchas de color violeta.
d) Colocar una cuarta placa en una cámara que
contenga cristales de yodo para revelar lípidos que
tengan dobles enlaces en su molécula. Estos se verán
de color café.
4. IDENTIFICACIÓN DE LOS LÍPIDOS
a) Hacer un esquema o tomar una fotografía de las
cromatoplacas obtenidas con los diferentes
reveladores.
Para la determinación de colesterol:
NOTA: Todo el material que se usará deberá estar
perfectamente limpio y seco porque la reacción
ocurre en condiciones anhidras y el solvente es
cloroformo.
Preparar una serie de tubos de acuerdo con la tabla
siguiente, tomando en cuenta las indicaciones del
profesor.
Una vez que la tabla esté llena procederemos a
comparar los resultados para dar fin a la práctica.
RESULTADOS
En siguientes tablas se encuentran los resultado
obtenidos mediante la metodología, al realizar el
revelado de las muestras se procedió a realizar los
calculos de Rf en la reacción el colesterol.
Gráfica 1. Absorbancia vs μg de colesterol
Tabla 1. Datos de absorbancia y micromoles de colesterol,
para la construcción de la curva tipo.
Tabla 2. Cálculos en tabla del rendimiento total de µg de
colesterol por yema de huevo.
Imagen 2. Cálculos realizados para obtener los resultados.
Hill - Interamericana de España. 52-68 p.
DISCUSIÓN
La yema de huevo está constituida en su mayor parte
por lípidos y proteínas, se muestra una discrepancia
en los valores reportados y el valor investigado (47.84
mmol/L), lo que nos indica que no se presenta un
valor estándar de dicha concentración, del mismo
modo que la reacción no es exactamente
específica para la determinación únicamente del
colesterol, por lo que la reacción no se llevó
únicamente con el colesterol de la yema de huevo. En
la reacción el colesterol sufre una reacción de
oxidación gradual. La etapa inicial de la reacción
consiste en la protonacióndel grupo OH del
colesterol, donde se da una pérdida de
aguaobteniendo al ion carbonio 3,5-colestadieno
que constituye elprimer paso de la reacción de
color. Para la realización de la cromatografía en
capa fina se implementaron 4 reveladores para la
identificación de grupos específicos de
fosfolípidos. En molinato se esperaban 5
compuestos de los que se detectaron 4, al no poder
diferenciar dos compuestos sobrepuestos por
tener el mismo Rf y parecerse estructuralmente
entre el fosfatidil colina (grupo colina) y fosfatidil
(grupo amino) serina, los reveladores restantes
ayudan a la identificación. El bismuto presenta
fosfatidil colina mientras que la ninhidrina fosfatidil
serina.
CONCLUSIÓN
Para la muestras orgánicas el método por
Leibermann-Burchard da una prueba colorimétrica
positiva con la presencia de colesterol. El valor de
la absorbancia permite conocer la concentración de
colesterol en la muestra. En comparación es inexacta
con la prueba enzimática. El colesterol al ser
componente de membranas celulares y precursora de
hormonas y vitaminas es una biomolécula
importante. La cromatografía por capa fina en cierto
grado es mejor que la de papel ya que se pueden
realizar diferentes pruebas de una o varias
muestras y poder determinar características
generales de sus componentes, es más rápida. Se
evidencio que la concentración de fosfolípidos
entre muestras depende de las demandas del
organismo que produce el huevo. Las propiedades
de polaridad de los fosfolípidos permiten su
separación por cromatografía.
REFERENCIAS
Argüeso R., Diaz L., Diaz J., Rodríguez A., Castro M., Diz-LoisF.
(2011). Lípidos, colesterol y lipoproteínas. Galicia Clin.
Lehninger, A., Nelson, D. y Cox, M. (2014). Principios de
bioquímica. 6a ed., Barcelona. Editorial Artmed. 200-224 p.
Lozano J. A., Galindo J. D., García-Borrón J. C., Martínez-Liarte J.
H. Martínez-Liarte, Peñafiel R. y Solano F. (2005). Bioquímica y
Biología Molecular para ciencias de la salud. 3.a ed., McGraw-
Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de
Química. 2007. Técnicas cromatográficas.
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrfic
os_6700.pdf