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PRCTICAS DE BIOQUMICA GENERAL 2 CURSO LICENCIATURA DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA CURSO 2005/2006

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PRACTICA 1 PURIFICACION DE UNA ENZIMA: LA LISOZIMA DE HUEVO OBJETIVO : Purificar la enzima lisozima a partir de la clara del huevo mediante cromatografa de intercambio catinico utilizando carboximetilcelulosa. Determinar la actividad de la lizosima en las diferentes fracciones de purificacin.

INTRODUCCIN El nombre de lisozima o muramidasa (EC 3.2.1.17) incluye a un grupo de enzimas que catalizan la hidrlisis de enlaces glicosdicos (1 4) de los polisacridos de la pared celular bacteriana. Son protenas globulares constituidas por una sola cadena polipeptdica (129 aminocidos para la lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de 14 a 30 KDa. Estas protenas contienen cuatro puentes cruzados disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad. La lisozima fue la primera protena secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso de un modelo tridimensional (usando cristalografa de rayos x) y la primera para la que se propuso un mecanismo de accin detallado. CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO La cromatografa de intercambio inico se fundamenta en las propiedades cido-base de las protenas. Una protena, a pH menor de su pI (punto isoelctrico), tendr carga positiva y a pH mayor de su pI presentar carga negativa. Por lo que, en el primer caso, se unir a una resina con carga negativa (Carboximetil-celulosa, CM-celulosa) y en el segundo a una resina con carga positiva (Dietilaminoetil-celulosa, DEAE-celulosa).

Una vez unida la protena a las resinas, estas se pueden eluir de dos formas distintas: 1) variando el pH del medio hasta alcanzar el pI 2) mediante un gradiente inico aadiendo el contrain correspondiente (Na+ en el caso de intercambio catinico o Cl- para el intercambio aninico)

Dado que el pI de la lisozima es de 11, dos unidades de pH superior al del resto de las protenas de la clara del huevo, a un pH de 9,5 - 10 la lisozima es prcticamente la nica protena con carga positiva neta. Ello permite separar esta enzima del resto de protenas mediante la utilizacin de resinas intercambiadoras de cationes. La CM-celulosa es, debido a la presencia de restos carboxilo ionizados a pH neutro y bsico, una resina intercambiadora de cationes. A pH 10, la lisozima es prcticamente la nica protena que puede unirse a la CM-celulosa. Posteriormente, puede disociarse de la resina mediante lavados con un tampn de alta fuerza inica. MATERIALES Y METODOS Huevos de gallina para la obtencin de la enzima. Tampn A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10 Tampn B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 0.6 M NaCl Carboximetil-Celulosa Activacin de la CM: previamente a su utilizacin, la resina se lava con HCl 0.5 M (5 minutos), 2 veces con H2O (hasta pH neutro), NaOH 0.5 M (5 minutos) y finalmente dos veces con H2O (hasta pH neutro). Por ltimo se hace una suspension 1/1 (vol/vol) en tampn glicina/NaOH 100 mM pH 10 Tampn fosfato sdico 100 mM, pH 6,2 Suspensin de la bacteria Micrococcus Lvsodeikticus 20 mg en 100 ml del tampn fosfato anterior A. PURIFICACION DE LA LISOZIMA 1. Recoger la clara procedente de un huevo. Diluirla 1/5 (vol/vol) con tampn A. Tomar 10 ml de la muestra anterior en un tubo cnico con tapn de 15 ml. 2. Antes de comenzar la purificacin de la lisozima separar una alcuota de 1 ml para medir la actividad de la enzima en la fraccin de partida. 3. A los 9 ml restantes (Fraccin O, Fo), aadir 4 ml de CM-celulosa previamente activada y agitar suavemente durante 15 min, para que la lisozima se adsorba a la resina. 4. Al finalizar la incubacin, centrifugar la muestra a 600 rpm durante 3 min. Guardar el sobrenadante (Fraccin 1, F1). 5. Aadir a la resina (precipitado) 10 ml de tampn A. Agitar suavemente y centrifugar de nuevo. Recoger el sobrenadante (Fraccin 2, F2). 6. Repetir el lavado anterior y desechar el sobrenadante. 7. Elucin. Resuspender la CM-celulosa con 3 ml de tampn B e incubar, agitando suavemente, durante 10 minutos. Centrifugar y recoger el eluido (Fraccin 3, F3, lisozima purificada).

Medir, exactamente, en tubo cnico graduado el volumen total de cada fraccin

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B. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA La medida de la actividad lisozima se realiza utilizando una suspensin de agregados de pared celular del microorganismo Micrococcus Lysodeikticus en concentracin suficientemente elevada para atenuar, por dispersin, la transmisin de luz monocromtica a travs de la cubeta de un espectrofotmetro. Al incubar esta suspensin con lisozima, los fragmentos de pared celular se hidrolizan, originando otros ms pequeos, lo que reduce la dispersin de la luz, que se manifiesta en una reduccin en la absorbancia a una longitud de onda fija de 450 nm. La actividad enzimtica es proporcional a la disminucin de la absorbancia a 450 nm. Por definicin, en condiciones estndar (25C, pH 6,2 y 0,1 M fosfato), se considera que 1 unidad de actividad enzimtica de lisozima (U) produce una disminucin en la absorbancia de 0,001 en 1 minuto. METODO DE MEDIDA: 1. En una cubeta de espectrofotmetro, aadir 3 ml de suspensin de pared bacteriana. Meterla en el espectrofotmetro y anotar la densidad ptica (D.O.). Esta medida constituye el tiempo cero y hay que hacerlo para cada medida. 2. Aadir 25 l de la fraccin correspondiente a ensayar, tomar el tiempo por el reloj, agitar e introducir la cubeta en el espectrofotmetro y anotar la absorbancia observada al primer minuto y al segundo minuto. Calcular la variacin de absorbancia al primer minuto (A1/min) y al segundo (A2/min). Hacer la media de las dos medidas. Anotar los resultados en la tabla siguiente:
Volmenes (ml) Absorbancia a t 0 Absorbancia a t 1 Absorbancia a t 2

A1/min

A2/min

_ A/min

Actividad (U)

F0 F1 F2 F3 CALCULOS: 1. Actividad de cada fraccin 2. % Retencin de la resina: Actividad F0 Actividad F1 x 100 Actividad F0 3. % de Recuperacin: Actividad F3 x 100 Actividad Fo GUARDAR TODAS LAS FRACCIONES PARA USARLAS EN LAS PRXIMAS PRACTICAS

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PRACTICA 2 A.- ELECTROFORESIS: Separacin de protenas en geles de poliacrilamida OBJETIVO: utilizar la tcnica de la electroforesis en gel para analizar la purificacin de la enzima lisozima. Se analizar la composicin proteica de las distintas fracciones y se constatar el grado de pureza de la lisozima. FUNDAMENTO La electroforesis es la migracin de iones en un campo elctrico. Es una de las tcnicas analticas ms importantes dentro de la Bioqumica. Las molculas biolgicas (ADN, protenas, vitaminas, etc.) poseen cargas elctricas, y por tanto poseen esta propiedad de movilidad en un campo elctrico. La movilidad depender de la carga que presentan al pH que trabajemos. La electroforesis en gel es el mtodo ms conveniente para realizar separaciones de macromolculas (ADN y Protenas). El soporte de la electroforesis (el gel) es un entramado tridimensional que impide o reduce la difusin. Este gel ha de ser compatible con los tampones usados y debe permitir la entrada del lquido en los poros (reticulados hidratables). Los soportes pueden ser ms o menos restrictivos segn que el tamao de poros limite o impida el paso de las molculas. Los ms restrictivos, como los geles de acrilamidabisacrilamida, oponen impedimento al paso de las molculas, participando as en el proceso de separacin. Entre los menos restrictivos est la agarosa. El tamao de poro que da unas dimensiones moleculares de criba de los geles puede ser establecido previamente. El gel en la electroforesis retarda, en mayor o menor medida, a las molculas mayores respecto a las de menor tamao. Las separaciones moleculares estn pues basadas en el tamizado molecular junto a la movilidad electrofortica de las molculas que van a ser separadas.

Para llevar a cabo la electroforesis se necesita: A) una fuente de Tensin que proporciona el campo elctrico, mediante dos electrodos, positivo (nodo) y negativo (ctodo), entre los que se establece la diferencia de potencial. B) una cubeta o recipiente, en cuyos extremos se sitan los electrodos. C) un soporte electrofortico. D) el tampn de electroforesis: durante la electroforesis se produce electrolisis del agua, generndose protones en la proximidad del nodo e iones hidroxilos en la proximidad del ctodo; el tampn evitar que el entorno andico se acidifique y el catdico se haga ms bsico a lo largo de la electroforesis.

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El polmero utilizado para la formacin del gel es la acrilamida y la bis-acrilamida, los cuales se polimerizan mediante la adicin de catalizadores (persulfato amnico, TEMED). En nuestro caso, la separacin de las protenas se ver condicionada slo por su tamao y no por su carga ya que previamente las protenas sern desnaturalizadas utilizando un detergente (SDS), el cual despliega a las protenas y se queda pegado a su superficie confirindole una gran carga negativa. Esa gran carga negativa enmascara la carga intrnseca de la protena, y las protenas una vez tratadas con SDS presentan todas la misma carga, y la separacin ser debida solamente a la masa molecular de la protena.

PROTOCOLO La separacin electrofortica se lleva a cabo segn el mtodo descrito por Laemmli en geles de poliacrilamida Gel de separacin: poliacrilamida 16% - Acrilamida (30%) - Bis-acrilamida (1%) - Tampn de separacin 4X - H20 - TEMED - Persulfato amnico 50%

5.33 ml 1.32 ml 2.54 ml 0.81 ml 20 l 20 l

Verter, cuidadosamente, la acrilamida entre los cristales. Cubrir, cuidadosamente con agua (utilizar una pipeta Pasteur) para delimitar el frente. Esperar a que el gel polimerice.

Gel concentrador: poliacrilamida 3% - Acrilamida (30%) - Bis-acrilamida (1%) - Tampn de empaque 2X - H20 - TEMED - Persulfato amnico 50%

1 ml 1 ml 5 ml 3 ml 10 l 20 l

Retirar el agua. Verter, cuidadosamente, la acrilamida entre los cristales. Colocar los peines y esperar a que polimerice. Retirar los peines. El volumen final de los geles es aproximadamente 10 ml, para la preparacin de 2 cristales. El tampn de separacin se prepara 4X porque se diluye 4 veces en el volumen final de 10 ml. El tampn de empaque est preparado 2X, se diluye dos veces en el volumen final PROTOCOLO A 20 l de la Fraccin 3 se le aaden, en un eppendorf, 20 l de tampn de carga (MIXER): (Tris-HCI 0,125 M, pH 6,8; SDS 4%; glicerol 20%; 2-mercaptoetanol 10%; Azul de bromofenol 0,008%). Calentar las muestras a 95C durante 3 min. Calentar tambin el estndar de protenas que incluye las siguientes protenas: Albmina srica bovina (66kd), Ovoalbmina (40kD) y Lisozima (16 kD). Cargar en pocillos 20 l de F3 y 10 l del estndar de protenas Correr la electroforesis en tampn Tris-HCl 0,025 M, pH 8,8, glicina 0,192 M y SDS 0,1%, a una intensidad de corriente constante de 30 mA hasta que el azul de bromofenol est aproximadamente, a 1 mm del extremo inferior del gel. Desmontar el gel y teirlo con metanol/actico/H20 (5/1/5) con azul de Coomassie (1 g/l). Desteir el gel en metanol/actico/H20 (10/10/80).

Standard

Fo

F1

F2

F3

BSA 66 KDa BSA 66

OVOALBUMINA 40 KDa

LISOZIMA 14-17 KDa

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B.- EFECTO DE LA TEMPERATURA Y DE LA REDUCCIN DE LOS PUENTES DISULFURO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA LISOZIMA

OBJETIVO: estudiar la contribucin de los enlaces disulfuro y puentes de hidrgeno a la conformacin del centro activo de la lisozima y su efecto sobre la actividad de la enzima. La lisozima es una protena globular constituida por una sola cadena polipeptdica, su estructura presenta 4 hlices y 1 hoja extendida . Esta protena presenta cuatro puentes disulfuro cruzados que contribuyen a su elevada estabilidad. El DTT (ditiotreitrol) es un reductor de puente disulfuro. Por tanto, su adicin en concentracin suficiente, reducir los -S-S- de la lisozima y producir cambios en la estructura terciaria de la protena. Estos cambios pueden afectar a la actividad enzimtica de la lisozima. Por otra parte, los puentes de hidrgeno tambin estn implicados en el mantenimiento de la estructura de las protenas. Estos puentes de hidrgenos se pueden romper fcilmente por tratamiento con calor. Del mismo modo al caso anterior, la modificacin de la estructura de la protena por rotura de los puentes de hidrgeno puede modificar la actividad del enzima.

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PROTOCOLO El estudio se lleva a cabo en la fraccin F3 purificada en la prctica anterior 1. Preparar 4 tubos eppendorf numerados del 1 al 4 y pipetear las cantidades adecuadas segn se indica en la tabla siguiente: Tubo 1 2 3 4 Fraccin F3 200l 200l 200l 200l DTT (0.5 M)* 20l 20l 50C/30min + +

* La concentracin de DTT de 0.5M es concentracin inicial (75 mg/1000 ml) Los tubos 1 y 2 se mantienen a temperatura ambiente Los tubos 3 y 4 se calientan a 50C durante 30 min. 2. Medir la actividad como se indic en la prctica anterior. Anotar los resultados en la tabla siguiente: _ A/min

Absorbanci

Absorbancia a t 1

Absorbancia a t 2

Actividad
(U)/200 ml

Tubo 1 2 3 4

a a t 0

A1/min

A2/min

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PRCTICA 3 DETERMINACIN DE PROTEINAS OBJETIVO: Calcular la concentracin total de protenas contenida en una disolucin. Con este fin, utilizaremos las muestras obtenidas en la prctica de Purificacin de la Lisozima y seguiremos el mtodo de Lowry. FUNDAMENTO El mtodo de Lowry se basa en la reaccin de las protenas con el reactivo de Folin dando un complejo coloreado. Este reactivo es una disolucin de tungstato sdico y molibdato sdico en cido fosfrico y cido clorhdrico. El mecanismo del proceso es el siguiente: el Cu2+, en medio alcalino, forma un complejo con los enlaces peptdicos de las protenas reducindose a Cu+. Este ion, as como los grupos R de los residuos de tirosina y triptfano de las protenas, reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo inicialmente un reduce para formar un compuesto coloreado. La intensidad del color depende de la cantidad presente en las protenas de estos aminocidos aromticos y ser proporcional a la concentracin de protenas en la disolucin. La concentracin de una disolucin problema puede calcularse interpolando el valor obtenido de absorbancia en una recta de calibrado trazada con valores conocidos de concentracin de una protena y sus respectivas absorbancias. MATERIAL Y REACTIVOS Lowry A: Na2CO3 al 2,0% en NaOH 0,1N Lowry B: CuSO4 al 1% Lowry C: Tartrato sdico al 2% Reactivo de Folin-Ciocalteus: tungstato Na y molibdato sdico en PO4H3 y ClH Albumina: 500 g/ml producto inestable, que se

PROTOCOLO 1.- Diluir las muestras a las cuales vamos a determinarles la concentracin de protenas: F0 y F1, como tendrn una mayor concentracin de protenas se diluyen 100 veces (dilucin 1/100) (0.1 ml fraccin + 9.9 ml H2O) F2, fraccin que procede de lavar la columna de CM y que tendr una menor cantidad de protenas se diluye 10 veces (dilucin 1/10) (0.1 ml fraccin + 0.9 ml H2O) F3, fraccin de lisozima pura se diluye 50 veces (dilucin 1/50) (0.1 ml fraccin + 4.9 ml H2O)

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2.- Rotular tubos de plstico transparente del 1 al 10. En los tubos del 1 al 6 se prepara la curva patrn de albmina. Se parte de una solucin concentrada de albmina de 500 g/ml y se diluye con agua (tabla adjunta), para obtener concentraciones crecientes de albmina desde 0 a 500 g/ml. El volumen final en los tubos es de 400 l En los tubos del 7 al 10 se ponen 400 l de las soluciones problemas debidamente diluidas COMPROBAR QUE LOS 10 TUBOS TIENEN UN VOLUMEN FINAL DE 400 l 3.- Preparar la solucin D: Solucin D:

30 ml Lowry A 0.3 ml Lowry B 0.3 ml Lowry C

4.- Aadir a todos los tubos 2 ml de la solucin D. Mezclar y esperar 15 min a temperatura ambiente 5.- Aadir a todos los tubos 200 l de reactivo de Folin diluido en agua destilada 1/1 (vol/vol). Mezclar y esperar 30 min a temperatura ambiente 6.- Medir la densidad ptica a 750 nm ajustando el aparato a cero con el blanco TUBOS 1 2 3
Curva patrn

H2O 400 l 380 l 340 l 300 l 200 l -

4 5 6 7 8 9 10

Muestras Problemas

Blanco Alb 0 g/ml Albmina 25 g/ml Albmina 75 g/ml Albmina 125 g/ml Albmina 250 g/ml Albmina 500 g/ml F0 (1/100) F1 (1/100) F2 (1/10) F3 (1/50)

Albumina 500 g/ml 20 l 60 l 100 l 200 l 400 l -

Muestras diluidas 400 l 400 l 400 l 400 l

Solucin D 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Folin 1:1 200 l 200 l 200 l 200 l 200 l 200 l 200 l 200 l 200 l 200 l

CALCULOS: Representar los valores de absorbancia a 750 nm frente a los g/ml de albmina. Extrapolar los valores correspondientes a las distintas fracciones de la purificacin para el clculo de la concentracin de protenas en mg/ml. Tener en cuenta el factor de dilucin empleado.

12 N TUBO 2 3 4 5 6 7 8 9 10 [Protenas] 25 g/ml 75 g/ml 125 g/ml 250 g/ml 500 g/ml F0 (1/100) F1 (1/100) F2 (1/10) F3 (1/50) Absorbancia a 750

Fracciones

Volmenes de las fracciones de la prctica 1 (ml)

Protenas (mg/ml)

Protenas totales (mg)

F0 F1 F2 F3

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PRACTICA 4

ESTUDIO CINETICO DE UNA ENZIMA: ACTIVIDAD SUCCINATO DESHIDROGENASA

OBJETIVO: Determinar la actividad de la succinato deshidrogenasa en la fraccin mitocondrial de hgado de rata en presencia y en ausencia de un inhibidor competitivo de la enzima. Determinar los parmetros cinticos de la enzima: Km y Vmax y Ki

INTRODUCCION La enzima succinato deshidrogenasa (SDH, E.C. 1.3.99.1) es una flavoprotena que participa en el ciclo de Krebs y al estar asociada a la membrana interna mitocondrial, tambin forma parte la cadena de transporte electrnico mitocondrial. La SDH cataliza estereoespecficamente la deshidrogenacin en trans del cido succnico hasta cido fumrico. Esta enzima se inhibe por malonato y maleato, que son anlogos estructurales del succinato.

MATERIALES Y METODOS Material Hgado de rata. Succinato sdico 20 mM, pH 7.4; malonato sdico 0.5 mM, pH 7.4; acetato de etilo; cido tricloroactico al 10% (p/v). El medio de aislamiento est compuesto por: Tris-HCl 15 mM, pH 7.4; sacarosa 0.25 M, EDTA 1 mM y DTT 1 mM. La mezcla de reaccin enzimtica est compuesta por: Tampn fosfato sdico 0.1 M, pH 7.4, sacarosa 50 mM, INT al 0.2% (p/v) en etanol y EDTA 4 mM. Obtencin de la fraccin mitocondrial Se sacrifica al animal, se extrae el hgado y se introduce inmediatamente en un vaso de precipitado con medio de aislamiento fro. Se seca el rgano sobre papel de filtro, se pesa y se trocea con tijeras. Se homogeniza en fro con un homogenizador mecnico de tefln en medio de aislamiento (1g de tejido por cada 10 ml de medio).

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Las fracciones citoslicas y mitocondrial se obtienen mediante centrifugacin diferencial segn el esquema siguiente:

HOM OGENADO
8 0 0 X G 1 0 m in ( S o r v a ll R C 5 ,r o to r S S - 3 4 , 3 0 0 0 r p m )

P R E C IP IT A D O
(n c le o s , c e lu la s e n te ra s , g l b u lo s ro jo s )

SO BREN A DA N TE
8 2 0 0 x g , 1 0 m in S S -3 4 , 9 0 0 0 rp m

P R E C IP IT A D O
(F . m ito c o n d ria l)

SO BREN AD A NTE
(F . c ito s lic a )

El precipitado final, que corresponde a la fraccin de mitocondrias, se resuspende en medio de aislamiento (1g/7ml) y se vuelve a centrifugar a 8200xg, 10 min. El ltimo precipitado resuspendido finalmente en Tris-ClH 50 mM, pH 7.4, (1g/7ml), constituye la fraccin mitocondrial final. Se somete a dos pulsos de sonicacin de 30 segundos. La concentracin de protenas se determina por el mtodo de Lowry y deber ajustarse, por dilucin, a 1 mg de protenas/ml. Medida de la actividad enzimtica El mtodo de ensayo de la actividad SDH se basa en la utilizacin de un aceptor artificial de electrones, el cloruro de 2-[4-iodofenil]-3-[4-nitrofenil]-5-feniltetrazolio (INT) que al aceptar los H+ y e- de la enzima se reduce a formazano, tomando una coloracin violeta, que es soluble en acetato de etilo y absorbe a 490 nm. Clculo de la actividad enzimtica Aplicamos la ley de Lambert y Beer que relaciona la absorbancia con la concentracin a travs de una constante de proporcionalidad (A = bc). A es la absorbancia de la muestra, es el coeficiente de extincin molar 490 = 21.3 x mM-1cm-1, b el paso de luz a travs de la cubeta en cm y c la concentracin. La intensidad del color observado ser reflejo de los moles/ml del sustrato reducido. Teniendo en cuenta que el volumen de acetato de etilo empleado es de 5 ml, que el tiempo de reaccin es de 20 minutos, aplicamos la siguiente frmula para calcular la actividad de la enzima en Unidades Internacionales (moles/min) Absorbancia x 5ml Actividad SDH (U) = (mM-1/cm) x 1cm x tiempo (min) Para pasar las unidades de actividad (U = mol/min) a miliunidades (mU), el valor obtenido al aplicar la frmula anterior lo multiplicamos por 1000.

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PROTOCOLO Para determinar la Km, Vmx y Ki (malonato), vamos a medir la actividad enzimtica a distintas concentraciones de sustrato en presencia y ausencia del inhibidor malonato. 1. Rotular 11 tubos de plstico blanco y aadir a cada uno de ellos los reactivos que se indican en la tabla excepto la fraccin mitocondrial 2. Iniciar la reaccin aadiendo 150 l de fraccin mitocondrial a cada tubo. Incubarlos a 37C durante 20 minutos 3. A los 20 minutos, parar la reaccin agitando bien con 1 ml de cido tricloroactico al 10% (p/v). El tubo 1 se utiliza como blanco 4. Se aaden despus a todos los tubos 5 ml de acetato de etilo para extraer el formazano. Tapar los tubos y agitar vigorosamente en un Vortex. Se recoge la fase orgnica (coloreada) con pipeta Pasteur, midindose su absorcin a 490 nm frente al blanco, en un tubo de vidrio para espectrofotmetro Tubo H2O 1 mM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 350l 250l 150l 300l 250l 100l 200l 100l 250l 200l 50l 100l 200l 100l 200l Succinato 10 mM 50l 100l 50l 100l 20 mM 250l 250l 50l 50l 50l 50l 50l 500l 500l 500l 500l 500l 500l 500l 500l 500l 500l 500l 150l 150l 150l 150l 150l 150l 150l 150l 150l 150l 150l Malonato 0,5 mM Mezcla reaccin
Fraccin mitocondrial

Cmo se calcula la concentracin de sustrato o de inhibidor de cada tubo? Conociendo la concentracin de partida y la alcuota que ponemos, calculamos primero el factor de dilucin segn la frmula: Volumen final del tubo Factor de dilucin = Alcuota Una vez calculado el factor de dilucin de cada caso, dividimos la concentracin inicial por dicho factor. Por ejemplo, la concentracin de malonato en los tubos del 7 al 11 ser de 25 M, ya que como el volumen final del tubo es de 1 ml, la alcuota que hemos puesto es de 50 l, el factor de dilucin es 20. Dividiendo la concentracin inicial de malonato 0.5 mM por 20, da 25 M.

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[v] Tubos Abs 490 nm 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Actividad mU [S] Succinato mM [I] malonato M XXXXXXX XXXXXXX XXXXXXX XXXXXXX XXXXXXX 25 25 25 25 25 1/[v] (mU/min)-1 1/[S] Succinato mM-1

El clculo de los parmetros cinticos Km, Vmax y Ki pueden realizarse por el metodo de Lineweaver-Burk :

Lineweaver BurK :

1 = v

m )(1)+( 1 ) [S ] Vmx V mx

Km = Km ( 1+ [I]/Ki) A partir de esta frmula calculamos la Ki del malonato

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PRACTICA 5 PURIFICACIN Y DETERMINACIN CUANTITATIVA DE CIDOS NUCLEICOS

OBJETIVO: Extraer ADN a partir de hgado de rata y cuantificarlo por el mtodo de la difenilamina. Realizar una electroforesis en gel de azarosa para visualizar las bandas de ADN.

A. AISLAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS

INTRODUCCION Los cidos nucleicos son macromolculas que se encuentran tanto en el ncleo como en el citoplasma celular. Por ello para su aislamiento es necesario digerir previamente las membranas citoplasmticas y nuclear con un detergente adecuado. Este detergente a su vez desnaturaliza las protenas asociadas a los cidos nucleicos. Una vez que ha actuado el detergente, se trata la solucin con disolventes orgnicos (fenol, cloroformo, alcohol isoamlico, etc). Tras una centrifugacin, en el precipitado (fase orgnica ms densa) quedan los lpidos de membrana, en la interfase quedan las protenas desnaturalizadas y en el sobrenadante (fase acuosa menos densa) quedan disueltos los cidos nucleicos. Se separa el sobrenadante y se aade alcohol absoluto, el cual insolubiliza el ADN, que va quedando en forma de fibras.

MATERIALES Y REACTIVOS Higado de rata DNAzol Reagent (Reactivo preparado para aislar el ADN en un solo paso. Contiene un detergente, derivado de la guanidina, que hidroliza al ARN y es selectivo para la obtrencin de ADN a partir de lisados celulares. Los disolventes orgnicos de este reactivo son no fenlicos, obviando la toxicidad del mismo) Etanol 100% Etanol 95% NaOH 8 mM HEPES 1 M

PROTOCOLO 1. Se toman unos 800 mg de hgado de rata en un vaso de precipitado pequeo. Se aaden 16 ml de DNAzol Reagent. 2. Se trocea muy bien con unas tijeras y se homogeniza el tejido con un homogenizador. 3. Poner 1 ml del homogenizado en un tubo de 10 ml. Centrifugar 10 minutos a 5000 rpm.

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4. Se quita todo el sobrenadante con cuidado de no llevarnos el precipitado y se pasa a un eppendorf limpio. 5. Se precipita el ADN con 500 l de etanol al 100 % (se mezcla por inversin). 6. Dejamos a temperatura ambiente 1-3 minutos. 7. Se coge la madeja de ADN que se forma, con la punta de una pipeta y se pasa a un nuevo eppendorf dejndolo en la pared del tubo para que escurra bien. 8. Se deja 1 minuto escurriendo y a continuacin se recoge el lquido que haya soltado con una pipeta y se desecha. 9. Lavar la madeja de ADN 2 veces con 800 l de etanol al 95 % invirtiendo los tubos 3-6 veces. Dejarlos 1 minuto y quitar el etanol con la pipeta y desechar. 10. Dejar los tubos abiertos 10 minutos para que se evapore el resto del etanol. 11. Disolver el ADN con 500 l de NaOH 8 mM (con la pipeta muy despacito, subiendo y bajando). 12. Finalmente se le ajusta el pH con 15 l de HEPES 1 M. 13. Separar 15 l para el apartado C de la prctica y con los 500 l restantes se contina con el apartado B.

B. DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE DNA POR EL MTODO DE LA DIFENILAMINA

INTRODUCCION La concentracin de ADN en la muestra se puede estimar con la reaccin de la difenilamina. Este colorante reacciona selectivamente con 2-deoxipentosas. En disolucin cida la deoxipentosa se convierte en el altamente reactivo -hidroxilevuln aldehido que reacciona con la difenilamina para dar un compuesto azul. Una curva patrn de concentraciones conocidas de DNA nos permitir determinar el contenido en DNA del problema por interpolacin sobre la recta patrn de las densidades pticas de la disolucin problema.

MATERIALES cido perclrico (PCA) al 10% y 20%. Difenilamina (DFA) al 4% en cido actico glacial. Acetaldehido 0.8% V/V en agua (mantener en fro). ADN patrn (esperma de salmn) 1mg/ml. PROTOCOLO 1.- Preparacin de la curva patrn: Dilucin del ADN patrn: en un eppendorf de 2 ml poner 1 ml de ADN patrn y 1 ml de PCA al 20% . Concentracin de ADN patrn 500
g/ml.

2.- Rotular 7 tubos de 10 ml y aadir segn la tabla adjunta:

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1
BLANCO

2
[ADN] 25 g/ml

3
[ADN]
37.5 g/ml

4
[ADN] 50 g/ml

5
[ADN]
62.5 g/ml

6
[ADN] 75 g/ml

7
[ADN] muestra
Dil 1/4

? g/ml 150 l 200 l 250 l 300 l

[ADN] 500 g/ml

100 l

[ADN] muestra

500l

PCA 10%

2000 l

1900 l

1850 l

1800 l

1750 l

1700 l

1500 l

3. Poner todos los tubos tapados con tapn de plstico a hidrolizar en bao a 90C durante 30 min. 4. Poner los tubos en hielo. Cuando estn fros aadir a todos los tubos 4 ml de disolucin de difenilamina y agitar. 5. Aadir 50 l de disolucin de acetaldehido y agitar. Mantener en fro porque el acetaldehdo es muy voltil. Mantener siempre tos tubos cerrados 6. Dejar los tubos cerrados a 30C toda la noche. 7.Medir la absorbancia a 595 nm. Realizar las medidas en espectrofotmetros colocados en el interior de campanas extractoras. Echar las muestras en las cubetas de plstico con pipetas Pasteur de plstico. Limpiar bien las cubetas por fuera para no manchar el aparato.

CALCULOS Representar los valores de absorbancia a 595 nm frente a los g/ml de ADN patrn. Extrapolar los valores correspondientes a las distintas diluciones de la muestra para el clculo de la concentracin de ADN. Tener en cuenta el factor de dilucin empleado.

N TUBO 2 3 4 5 6 7

[ADN] 25 g/ml 37.5 g/ml 50 g/ml 62.5 g/ml 75 g/ml Muestra diluida 1/4

Absorbancia a 595

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C. SEPARACIN Y VISUALIZACIN DE CIDOS NUCLEICOS POR ELECTROFORESIS GELES DE AGAROSA- BROMURO DE ETIDIO. EN

INTRODUCCION Se pueden detectar fcilmente pequeas diferencias entre molculas similares de ADN y ARN separndolas mediante electroforesis en gel. En muchos tipos de geles, la movilidad electrofortica de un fragmento de ADN es inversamente proporcional al logaritmo del nmero de pares de bases, dentro de un cierto lmite. Se utilizan geles de poliacrilamida para separar fragmentos de hasta unos mil pares de bases, y geles ms porosos, de agarosa, para resolver mezclas de fragmentos mayores. La agarosa es un polmero lineal, procedente de las algas rojas, en el que se alternan D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa. Una caracterstica importante de estos geles es su alto poder de resolucin. Adems es posible visualizar los cidos nucleicos separados en el gel si a ste se le aade bromuro de etidio durante su preparacin. El bromuro de etidio es un compuesto fluorescente con capacidad de intercalarse entre los pares de bases de los cidos nucleicos, haciendo posible su visualizacin cuando el gel es iluminado con luz ultravioleta. Como se trata de un compuesto altamente cancergeno en esta prctica utilizaremos un reactivo alternativo denominado SYBR Safe TM con el que visualizaremos las bandas de ADN.

MATERIALES Y REACTIVOS Agarosa SYBR Safe TM Tampn de electroforesis 10XTAE: - 0.4 M Tris-Acetato - 0.02 M EDTA

Tampn de carga: - 25% Ficoll - 25 mM EDTA - 0.25% Verde de cianol - 0.25% Azul de bromofenol

PROTOCOLO Preparacin del gel. Se utilizar un gel de agarosa al 1.5 %. Para prepararlo se aaden 2.25 g de agarosa a 150 ml de tampn de electroforesis TAE, se mezcla bien y se calienta la mechero hasta que la agarosa se disuelva sin que llegue a hervir. Cuando no est tan caliente se aaden 7.5 l de

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SYBR Safe y se remueve para que se mezcle. Mientras tanto se prepara la placa donde va a polimerizar el gel cerrando sus extremos con celo e introduciendo el peine para formar los pocillos. Una vez que la agarosa no est tan caliente se vierte sobre la placa y se deja polimerizar. Cuando esto ocurra se saca el peine con cuidado y se retira el celo.

Electroforesis. 1. Aadir 5 l de tampn de carga a 5 l de ADN aislado previamente. 2. Introducir la muestra en el pocillo con ayuda de una punta y micropipeta. 3. Separar las muestras en tampn 1X TAE a 90 voltios durante 15-20 min. 4. Una vez terminada la electroforesis el gel se visualizan en un transiluminador con luz ultravioleta. Las bandas de ADN se vern de color verde.