Curso sobre mitigación de los efectos adversos del Cambio Climático mediante programas

de reforestación
Cartagena de Indias(Colombia), 12-16 septiembre 2016

Criterios de Selección (II):

Herramientas moleculares

José Climent
 Esquema

• Genes y genoma
• La base molecular de la variación (Evolución)
• Tipos de marcadores
• Aplicaciones
– Control de materiales genéticos
– Introgresión en poblaciones marginales
– Patrones de variación geográfica
– Asociación molecular-fenotípica
Niveles de variabilidad ADN

Proteínas

Fenotipos

Poblaciones

Especies

Ecosistemas
 ¿Qué es un gen?

Unidad de información en
un locus de Ácido
desoxirribonucleico (ADN)
que codifica un producto
funcional, o Ácido
ribonucleico (ARN)
o proteínas y es la unidad
de herencia molecular

Pero….
Paradoja 1: El tamaño del genoma (cantidad de ADN)
no explica la complejidad biológica.
Tampoco el nº de genes
Coníferas: 20 x 1012
Paradoja 2: Una gran parte del genoma es común entre
organismos muy diferentes
 La biología evolutiva no acaba en el ADN

ADN Replicación, mitosis, meiosis

Regulación, transcripción
ARN
Regulación, tradución

Proteínas Regulación, interacciones

Organismo
¿Qué son los marcadores moleculares?
Son segmentos de ADN con una ubicación física identificable (locus) en
un cromosoma y cuya herencia genética se puede rastrear.

Pueden ser
Genes (por tanto, con función conocida),
Secciones de ADN sin función conocida.

Dado que los segmentos del ADN que se encuentran contiguos en un

cromosoma tienden a heredarse juntos, los marcadores se utilizan a menudo
como formas indirectas de rastrear el patrón hereditario de un gen que todavía
no ha sido identificado, pero cuya ubicación aproximada se conoce.
Tipos de marcadores, por su papel evolutivo
•Neutros: no suponen ventaja o desventaja alguna, la
selección no actúa sobre ellos
 Informan sobre procesos demográficos, estructura
poblacional,
parentesco, etc.

• Adaptativos o funcionales: la selección actúa en

ellos
 Pueden informar sobre la adaptabilidad de los individuos y
poblaciones
Genes candidatos = genes con una función biológica conocida
relacionada con un carácter especifico
 Fuentes de variación genética molecular

Mutación
(sustitución, deleción, inserción)

Introducción de una base

incorrecta durante la replicación
del ADN
Fuentes de variación genética molecular

Duplicación
Un gen es copiado dos veces durante la replicación

Drosophila melanogaster
Fuentes de variación genética molecular

Recombinación

Unos fragmentos de ADN son intercambiados entre dos

moléculas distintas
 Fuentes de variación genética molecular

Poliploidía

Variación en el número
de cromosomas

1. Autopoliploidía = todos los cromosomas vienen de la misma especie

2. Allopoliploidía = los cromosomas vienen de diferentes especies

 Fuentes de variación genética molecular

Transposones

Genes que pueden moverse de un sitio a otro en el

genoma
transposon Mu en el maíz
La selección actúa sobre las nuevas
variantes

La mutación genera
variación

La selección actúa contra las

mutaciones desfavorables

La reproducción genera recombinación

y nuevas mutaciones

Las mutaciones favorables tienen

mayor probabilidad de sobrevivir

…y reproducirse
 1. Métodos de identificación directa
(mutaciones conocidas)

secuenciación

Amplificación del ADN

Extracción
PCR (reacción en cadena de la
del ADN
polimerasa)

Detección de
polimorfismos
(SNPs)
 2. Métodos de identificación indirecta
(mutaciones desconocidas)

Múltiples técnicas, pero todas basadas en la comparación de pesos

moleculares de los fragmentos amplificados en distintos individuos

• PCR Polymerase Chain Reaction

• PCR-RFLP PCR - Restriction Length Polymorphism
• PCR-SSCP PCR - Single Strand Conformation Polymorphism
• RACE Real-Time PCR o qPCR
• RT-PCR Reverse Transcripase PCR
• RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA
• AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
• Microsatelites Single Strand Repeat (unidad de repetición 1-6
• Minisatelites nts)
unidad de repeticioón 7-100 nts
 ¿Qué es un microsatélite?

Simplemente, una cadena de ADN repetitivo (T10, AT6, CGT4, etc.), sin función
Es uno de los mejores “códigos de barras” genéticos

Microsatelites del cloroplasto (cpSSR, herencia materna en frondosas)

1

4
3
5
Carpinus betulus
2

Haplotype 1 : CAGTTAATTACTCCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTGT
Haplotype 2 : CAGTTAATTACTCCTATTTTTTTTTTTTTTTTTT - - - -CTTTTTTTGT
Haplotype 3 : CAGTTAATTACTCCTATTTTTTTTTTTTTTTT - - - - - -CTTTTTTTGT
Haplotype 4 : CAGTTAATTACTCCTATTTTTTTTTTTT - - - - - - - - - -CTTTTTTTGT
Haplotype 5 : CAGTTAATTACTCCTATTTTTTTTTTT - - - - - - - - - - -CTTTTTTTGT
 Pinus banksiana (Jack
pine)
Godbout et al. 2005

nad7 (intron 1)

Intron 1

exon 1 exon 2

• Mitocondria
TCTCCTTATCAGTCGAGCCTGCTTGCGCATCC
• Minisatélite (32 nt) X 3-18 times
 SNP
Picea chihuahuana
Chihuahua spruce, Pinabete de G

Chihuahua

Jaramillo-Correa et al. 2006

I II I II
M M MboII

MseI
300

300

• Mitocondria 100

• SNP
100

MseI MboII
318 332 1019
1033
Mitotype I CAAAGAATAATTCAT // GGTCAAGGGGTTAAT
Mitotype II CAAAGAAGAATTCAT // GGTCAAGGGGTGAAT
¿Para qué sirven los marcadores moleculares? (y
para qué no…)
• Identificacion clonal (fingerprinting)

• Estructura geográfica de las poblaciones

• Caracterización de los niveles de diversidad y diferenciación de las

procedencias

• Introgresión y flujo genético

• Asociación molecular-fenotípica
Identificacion clonal
Estructura geográfica, identificación de
procedencias
 Zonas Genéticas en Pinus pinaster Ait.
(Bucci et al. 2007 Mol. Ecol.)

France
FFrr 0.0352***
aannc
cee
North
NNoorrS pain
tthh SS 0.0201***
ppaaiinn
Atlantic
AAttlla 0.0542***
0.0542***
annttiic
c
Central
CCeennttrr S pain 0.0302***
0.0302***
aall SS
ppaaiinn 0.0174***
0.0174***
East S pain
EEaasstt
SS
ppaaiinn
West Africa
WeWesstt
AAffrriicc 0.0693***
aa 0.0693***
North
NNoorr Italy
tthh 0.0258***
0.0258**
IIttaallyy *
East Africa
EEaasstt
AAffrriicc
aa
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50
0.55

Semi-Partial R-square

Basado en interpolación
espacial y haplotipos
FFrance SSouth
SououEast
thth Spain
obtenidos mediante análisis Ea
Frrananccee
North
EasstWest
t SSpSpain
paaiinn

de microsatélites del Atlantic

NNoorrthht WeWesstt SSppaaiinn N
NN o r t h IItttaalyayll
Nooorrrtht thhIItal
Central Spain
cloroplasto (cpSSRs) AAtltlanantiticc yy
EaEassttAAfrfriiccaa
EEaassttAAff
CCeenntrtralal SSppaiainn WeWesstt
r ri ic ca a
AAfrfriiccaa

Weesstt

AAffrriiccaa
El programa STRUCTURE
(Pritchard et al. 2000)

• Usa MCMC para estimar las frecuencias alélicas de las K poblaciones en las
que se estructura la variación y la probabilidad posterior de mezcla de cada
individuo.

• Inicialmente, se hacen grupos aleatorios y se calculan frecuencias alélicas.

A partir de ahí se reasignan los individuos a las poblaciones y se recalcula.
Con marcadores de alta resolución (SNPs), se puede
llegar a identificar el origen de una reforestación (ej.
Pinus pinaster)
 La estructura genética neutral puede descontarse de la variación
observada para confirmar patrones ecotípicos
(Asignación sexual en Pinus pinaster)
• Las procedencias de condiciones menos favorables para el crecimiento comienzan antes su
reproducción femenina, mientras que casi todas las procedencias inician la reproducción
masculina con tamaños muy semejantes.
• Pero la estructura basada en marcadores neutros puede extraerse, dejando sólo la variación
geográfica potencialmente adaptativa (ecotípica)

♀ ♂
Threshold size for reproduction (cm)

Atlantic Iberian Peninsula CO AF MO

Mediterranean Spain

Tesis Doctoral L. Santos. (Santos-del-Blanco et al 2012. Ann Bot)

Poblaciones marginales o relícticas:
viabilidad genética, singularidad, flujo
genético alóctono
Efectos de la deriva genética en una población

Tasa de pérdida de diversidad

0,9 Ne
t
 1  0,8
0,7
=500

He(t )  1   H e(0) 0,6 Ne =100

2Ne  0,5
0,4 Ne
0,3 =10

Similar a la 0,2
0,1
Ne
=5
reducción en VA 0
0 20 40 60 80 100
Número de generaciones
Algunas poblaciones marginales están depauperadas
genéticamente (cuellos de botella, etc) pero pueden
albergar variantes singulares

Pinus canariensis
(Vaxevanidou et al. 2006)
 Pinus sylvestris var. nevadensis
(Robledo Arnuncio, de Navascués, González-Martínez & Gil)

Plantaciones
Uso de
alelos/haplotipos
Pies ai slados de la masa natural discriminantes
inmerso s en repoblaciones en
“La Cort ijuela”

Frecuencias alélicas de alelos discriminantes entre plantaciones y masa relicta de pino silvestre.
Vista Se han sombreado aquellos alelos que aparentemente indican introgresión genética de las
de plantaciones
“La en la masa relicta.
Tre Cortijuela” desde
el
Distribución espacial de la introgresión
genética a nivel de semilla en P. sylvestris
var. nevadensis (P.N. S. Nevada).

Sin introgresión
Nivel moderado
Nivel alto
 Diversidad genética en plantaciones de Pinus
canariensis y su incremento en las generaciones
sucesivas por flujo genético
(de Navascués & Emerson)

Parque Nacional
de Las Cañadas Güímar

Fasnia

Arico

Bosque natural

1 km
Repoblación
N

Límites
municipales

Bosque natural Plantación Regenerado natural

Número efectivo de
haplotipos 25.78 15.96 * 25.96

*
Asociación molecular-fenotípica
Pasos:

1. Elegir los genes candidatos (asociados a un carácter

adaptativo)
2. Identificar las variaciones genéticas (SNP)
3. Testar estadísticamente si los genes candidatos son
sujetos
a la selección
4. Testar estadísticamente si existe asociación entre genotipos
y caracteres cuantitativos (condiciones controladas)
5. Genotipar en poblaciones naturales los SNPs asociados a
caracteres cuantitativos (condiciones naturales)
 Ital
y

Ejemplo: Pino de Alepo,

Spai
n Greec
Pinus halepensis
e

Algeri
a 5 poblaciones
Morocc
10 individuos por población
o Israe
l

Sebastiani et al. in prep.

• Calcium-dependent protein kinase (cpk3)

Genes candidatos relacionados
con la resistencia a la sequía …
10 genes - 500 secuencias
(5,000 bp)
• CuZn superoxide dismutase (chloroplastic)
• Dehydrin 1 (dhn-1)
• Erd3 (ct7738 - unigene set)
• Aquaporin/MIP (mip)
• Phenyalanine ammonia lyase (pal1)
• ABA and WDS induced gene (pLP3-1)
• S-Adenosyl methionine synthase (sam2)
• Cysteine protease (rd21a)
• unknown (ug-2)
 megagametophyto (materno) 2) Detección de loci sujetos a
la selección
ADN (materno)

secuencia Un gen bajo selección:

CAAATTTTTACTGGAAAAAAATATGGT cpk3
T
CAAATTTTTACTGGGAAAAAATATTGT
T

SNP SNP

TESTS de
Neutralidad
 3) Testar estadísticamente la asociación
entre genotipos y caracteres cuantitativos

Ensayos en ambiente común:

Población clonal

Mapa de asociación

Los porcentajes de la variación fenotípica

explicados por marcadores adaptativos es aún muy
escasa (< 10 %).
 Conclusiones
• Los genes son la unidad de herencia genética
• Sin embargo aspectos fundamentales de la evolución no se
explican por los genes, sino por otros mecanismos más
complejos (transcripción, etc)
• Los marcadores moleculares son partes de ADN que pueden
o no tener una función conocida
• Pueden ser neutros o adaptativos, dependiendo de si son o
no opacos a la selección
 Conclusiones
• Entre las aplicaciones más interesantes de los marcadores
neutros están:
– La identificación de variedades
– La determinación de la estructura genética de las poblaciones
– La determinación de la introgresión y flujo genético en
poblaciones
con interés de conservación
• Se van publicando cada vez más marcadores adaptativos con
una función conocida en especies forestales, pero el
porcentaje de variación que explican es aún escaso