Unidad 4:

Método
Cromatográfico y
electroforesis
 Cromatografía de Gases
En la cromatografía de gases se hace pasar el analito en forma gaseosa a través de la
columna, arrastrado por una fase gaseosa, llamada gas portador.

 Fase móvil: es un gas (normalmente He, N2 O H2)

 Fase estacionaria: es un líquido no volátil pero también puede ser un sólido.

 Analito:debe ser un gas o líquido volátil

Las mediciones se realizan en

un CROMATOGRAFO DE
GASES
 Cromatografía de Gases
El cromatógrafo de gases consta de las siguientes partes:
La muestra de un líquido o de un gas se inyecta a través de un
septo (un disco de goma de silicona), en un portador caliente, en
donde se evapora rápidamente. El vapor es arrastrado a través de
la columna por el gas portador que puede ser He, N2 o H2.

septo

Sistema de inyección para la columna

 Tipos de Columnas
La columna es el componente clave en el proceso de separación.
Existen dos tipos de columna en la cromatografía:

-Columnas tubulares

- Columnas empacadas
 Columnas Capilares
La columna capilar está compuesta de dos partes: el tubo capilar y la fase
estacionaria.
El tubo capilar de sílice fundida, cuarzo sintético de alta pureza, es uno de
los más difundidos en la actualidad. Generalmente se recubren con una
capa de poliimida. El límite superior de empleo para las cubiertas normales
es de 360 °C, para columnas de alta temperatura es de 400 °C.
Las columnas de alta temperatura son de metal (aluminio). El límite de T
va a estar determinado por la fase estacionaria.
La columna capilar se instala en el horno y se mantiene la
hermeticidad del sistema mediante ferrulos de grafito u otro de
material similar, que por lo general es necesario cambiar cuando la
columna se cambia o se quita por algún motivo.
 Columna Empaquetada
Entre los sólidos utilizados en las columnas empaquetadas, la alúmina (Al 2O3) es una
fase estacionaria que se utiliza para separar hidrocarburos.

Los tamices moleculares son materiales orgánicos o polímeros orgánicos provistos de

grandes cavidades, donde pueden penetrar moléculas pequeñas y quedar retenidas
parcialmente (H2, O2, N2, CO2 y CH4).
Diferencias entre columna capilar y empaquetada
 Programación Temperatura
La programación de temperatura consiste en aumentar la temperatura de la columna
durante la separación para aumentar la presión de vapor de los solutos y de este
modo disminuir los tiempos de retención de los componentes que eluyen al final.

Temperatura
de 150 °C

Aumento de
temperatura a
250 °C
 Detectores
Una vez separados los compuestos de una mezcla en la columna
cromatográfica, se les tiene que detectar a su salida de modo que puedan ser
identificados y medidos. Por lo general, un detector no identifica qué sale de la
columna, sólo nos dice que algo está saliendo.

IONIZACIÓN DE
LLAMA

CONDUCTIVIDAD
TÉRMICA
DETECTORES
CAPTURA
ELECTRÓNICA

OTROS
Detector de Conductividad Térmica (TCD)
La celda del detector contiene un filamento calentado
con una corriente que se le aplica.

Cuando pasa el gas portador con la muestra la

corriente varía la resistencia eléctrica. Se compara
la conductividad térmica del gas portador y de la
muestra La diferencia se mide y genera una
señal.

Los gases portadores más adecuados son el hidrógeno o el helio, pues su

conductividad térmica es mayor (los analitos al mezclarse con estos gases
disminuyen su conductividad térmica).
 Detector de Ionización de Flama (FID)
Los compuestos se queman en una llama de aire-H2. Los compuestos carbonados
producen iones que son atraídos al colector. El número de iones que llegan al
colector es medido y se genera una señal.

El detector de ionización de llama es insensible a otros gases como H2, He, N2, O2, CO,
H2O, NH3, NO, H2S , o sea que no es universal
 Aplicaciones de la Técnica

Esta técnica es muy utilizada en la industria farmacéutica, para determinar:

 Impurezas de materias primas
 Concentración de principios activos,
 En general para el control de calidad de productos.

En la industria de alimentos es útil para la cuantificación de:

 Antioxidantes,
 Colorantes,
 Edulcorantes.
 Cromatografía de Líquidos
La cromatografía de líquidos es importante porque la mayoría de los compuestos
que no son suficientemente volátiles para que se pueda aplicar la cromatografía
de gases.

La cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC) utiliza una presión

elevada para forzar el paso del disolvente por una columna que contiene
partículas muy finas, consiguiendo la separación.
 Aspectos importantes de la técnica
 Las presiones requeridas se alcanzan con bombas reciprocantes o de
desplazamiento.

 El gas impulsor es helio o nitrógeno de ultra alta pureza.

 El equipo cuenta con detectores para las sustancias que abandonan el

medio de separación midiendo alguna propiedad física de los eluatos
(fluorescencia, conducción eléctrica, índice de refracción, etc.).

 Los actuales equipos, llamados cromatógrafos de HPLC o HPLC

simplemente, cuentan con un equipo de cómputo a partir del cual es
posible controlar los diferentes parámetros que permiten hacer
eficiente una separación.
 Usos
Esta técnica permite estudiar sustancias como aminoácidos, carbohidratos,
terpenoides, plaguicidas, esteroides, hidrocarburos, drogas, proteínas,
antibióticos, órgano metálicos, especies inorgánicas y otros.
 ELECTROFORÉSIS
La electroforesis es una técnica que emplean los científicos en el Laboratorio para
separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en base a su tamaño y carga
eléctrica.
Corriente eléctrica se utiliza para mover las moléculas y que se separen a través
de un gel. Los poros del gel actuán como un colador. Este procedimiento permite
separar moléculas en el tamaño que se desee.
Presenta
carga
negativa
 APLICACIONES
Se utiliza en una gran variedad de aplicaciones... como en medicina forense para determinar la
identidad de las personas que puedan haber participado en un delito, mediante la vinculación de
su patrón de ADN -su patrón de electroforesis- a uno que esté en una base de datos. El proyecto
genoma humano se llevó a cabo con algo que se llama electroforesis capilar, mediante la
separación de ADN en piezas más cortas y su separación en geles de electroforesis que permite a
los patrones de A, C, T y G ser caracterizados.
 También son muy importantes en la investigación de proteínas, y en la
investigación de mutaciones genéticas, porque cuando las proteínas o el ADN
están mutados, son con frecuencia más o menos largos, y por lo tanto,
aparecen en un gel de electroforesis de manera diferente de lo normal.