Curso HPLC PUJ 2018PDF PDF

Facultad de Ciencias
Programa de Educación Continua
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Educación Continua y Consultorías
PRINCIPIOS DE CROMATOGRAFIA
LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
Profesor: Julián Esteban Contreras Patiño

La Cromatografía Líquida de Alta eficiencia, high performance liquid

chromatography (HPLC) representa hoy por hoy el mayor mercado en el mundo
del instrumental analítico, la popularidad de esta metodología se debe a su gran
versatilidad (cubre un amplio espectro de aplicaciones), excelente capacidad
para el análisis de trazas (ppm o ppb), rapidez y adaptabilidad al análisis
cuantitativo.
La HPLC se utiliza en casi todos los laboratorios industriales, organismos oficiales

de control, universidades y en todos los laboratorios donde se realicen
investigaciones farmacéuticas, medicas, de síntesis orgánica, bioquímicos,
biológicos, de control del medio ambiente y alimentarios.
Una de las mayores limitaciones de HPLC es la falta de operadores

experimentados. El entrenamiento en técnicas modernas de HPLC en las
universidades es escaso, casi nulo.
2
Objetivo
Por medio de este curso se busca establecer los conceptos

básicos de esta metodología químico analítica, basados en
los fundamentos teóricos y prácticos, proporcionando
ejemplos que faciliten su comprensión.
Historia de la Cromatografía
Mijaíl Semiónovich
Friedrich Ferdinand Tsvet 1872-1919 botánico, Kuhn, Lederer y
Runge 1750-1867 fundador Crom Colum. En Winterstein 1931 usaron
químico, descubrió la 1903 lleno un tubo con la técnica para separar
Cafeína, productos del carbonato de calcio y un pigmentos de plantas,
alquitrán, el tinte azul anilina, extracto, aisló clorofilas a y b. aumento el tamaño de las
cromatografía en papel inulina/huevo, probo 120 columnas, Crom. preparat.
mezclas; CROMATO-GRAFIA
Consden, Gordon y John Martin y Richard

Sober y Peterson Martin 1944 lograron Synge 1940-1950
1956 Prepararon las separar mezclas complejas Establecieron los principios de
primeras celulosas para de aminoácidos en papel por la C. de reparto, promovieron
intercambio iónico. LLC. la C papel, C gases, y la C
líquida de alta resolución. LLC
Premio Nobel 1952.
N. H. Ray Gas DuPont y Wilson 1954 Porath y Flodin 1959

chromatography. II. The crearon la crom. en fase- introdujeron la crom. de
separation and analysis of vapor (gas), varios equipos. filtración de gel.
gas mixtures by Wiley, McLaren y 1960
chromatographic methods Harrington 1955 cromatografía líquida de alta
J. appl. Chem., 1954, 4, 21 resolución HPLC
CG/Ms 10 kHz
“75 Years of Chromatography - A Historical Dialogue. L.S. Ettre A. Zlatkis (Editors) Journal of Chromatography Library - Volume 17 Elsevier Scientific
4
Publishing Company, Amsterdam Feb. 1979, 530 pages
Formas de Cromatografía Liquida
1. Cromatografía Liquido-Solido (LSC) o de Adsorción.
2. Cromatografía Liquido-Liquido (LLC) o de partición.
3. Cromatografía de Fase Ligada (BPC).
4. Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC).
5. Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC).

Definición
IUPAC; La Cromatografía es un método, Cromatografía
usado primariamente para la separación de los
componentes de una muestra, en la cual los Fase estacionaria Fase Móvil
componentes se distribuyen en dos fases, una
de las cuales es estacionaria, mientras la otra se Sólido Gel Líquido Gas
mueve. Líquido Fluido supercrítico
Keulemans; es un método físico de separación
en el cual los componentes a ser separados son
distribuidos entre dos fases una fase Retenido en un sólido
estacionaria de área superficial alta y la otra es Puede ser un sólido, un gel o un líquido. Si es
un fluido que percola a través de la un líquido, puede estar distribuido en un
estacionaria. sólido, el cual puede o no contribuir al
Stewar; Grupo de métodos por los cuales, los proceso de separación. El líquido puede
componentes de una muestra son separados y también estar químicamente unido al sólido
donde los resultados pueden ser usados para (Fase ligada) o inmovilizado sobre él (Fase
cualificar y cuantificar los componentes de la inmovilizada).
muestra.
Giddings; simplemente dice, la cromatografía
es un método de migración en zona.
7
Definición
Fluido que se filtra a través o a lo largo del

lecho estacionario, en una dirección definida.
Puede ser un líquido (cromatografía líquida),
un gas (cromatografía de gases) o un fluido
supercrítico (cromatografía con fluido
supercrítico).
En la cromatografía de gases se usa el

término fase líquida, caso más común de la
fase estacionaria “líquida”, frente a fase
gaseosa para la fase móvil “gaseosa”.
Clasificación de la cromatografía:
Las diversas formas de cromatografía se pueden clasificar teniendo en

cuenta diversos criterios:
1. Clasificación por la forma física del sistema de cromatografía.
2. Clasificación por la fase móvil empleada.
3. Clasificación por la fase estacionaria utilizada.
4. Clasificación por el modo de separación.
5. Clasificiación por la cantidad de muestra aplicada.
9
Terminología de la cromatografía:
• El analito es la sustancia que se separa durante la cromatografía, esta contenido en la

muestra.
• Cromatografía analítica se utiliza para determinar la existencia y posiblemente también la

concentración de analito (s) en una muestra.
• Cromatografía preparativa se utiliza para separar una cantidad representativa de analito

(s) en una muestra, para ensayos posteriores.
• Un cromatograma es el resultado visual de la cromatografía. En el caso de una

separación óptima, diferentes picos o patrones en el cromatograma corresponden a los
diferentes componentes de la mezcla separada.
• Cromatografía fase normal esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase
móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar.
• Cromatografía fase reversa consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de
polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de
cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl (trialquilclorosilanos), dónde la R es una
cadena alquil tal como C18H37 o C8H17.
6
Terminología de la cromatografía:
• El eluyente es el disolvente que llevará el analito, antes de.
• El eluato es la fase móvil que sale de la columna, después de.
• Una serie de eluotropica es una lista de disolventes clasificados de acuerdo a su poder

liberador, teniendo en cuenta la polaridad del disolvente.
• La fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida.
• La fase estacionaria es la sustancia que se fija a la partícula en la columna durante el

procedimiento de cromatografía.
• El tiempo de retención es el tiempo que tarda un analito en particular, para pasar a

través del sistema (desde la entrada de la columna al detector) bajo condiciones
establecidas.
La sigla HPLC se debió a "High Pressure Liquid Chromatography" fueron cambiadas cuando se
dieron cuenta de que la presión sólo constituía una herramienta que forzaba a la fase móvil a
atravesar la columna, sin constituirse por sí en una variable del sistema. Sin embargo, y ante la
"universalidad" del término "HPLC", se decidió simplemente buscarle otro significado,
resultando" High Performance Liquid Chromatography".
7
Fase ligada; Una fase estacionaria que está unida de forma

covalente a las partículas de soporte o a la pared interior de la
columna.
Fase inmovilizada; Una fase estacionaria que está
inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la pared
interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ
(entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento.
Percolación; En física, química y ciencia de los materiales, la

percolación se refiere al paso lento de fluidos a través de
materiales porosos. Ejemplos de este proceso son la filtración y
la lixiviación.
Fluido supercrítico (FSC); es cualquier sustancia que se

encuentre en condiciones de presión y temperatura superiores a
su punto crítico que se comporta como “un híbrido entre un
líquido y un gas”, es decir, puede difundir como un gas
(efusión), y disolver sustancias como un líquido (disolvente).
8
Pasos para la caracterización

de muestras investigación
Metal
Problema de
Tóxicos
Comp.s Activos
La mayoría de los métodos cromatográficos de análisis son en los
casos más favorables selectivos, pero no específicos. Por ello,
cuando se trata de muestras complejas la separación del analito de
las posibles interferencias es una etapa esencial.
Plasma cuarto estado de agregación de la materia, un estado fluido similar al estado gaseoso pero
en el que determinada proporción de sus partículas están cargadas eléctricamente, son buenos
conductores eléctricos y sus partículas responden fuertemente a las interacciones
electromagnéticas de largo alcance.
BTEX; benceno, tolueno, etilbenceno y xileno. 9

Tecnología de alimentos y Productos Naturales.- Puede realizarse la caracterización de Aceites

Esenciales y Aromas, los cuales son empleados en la elaboración de saborizantes, aromatizantes, licores,
perfumes, artículos de aseo, y como materias primas para productos farmacéuticos.
Control Ambiental.- Dentro de los contaminantes posibles de ser estudiados están: los
hidrocarburos aromáticos, BTEX, pesticidas organoclorados y organo-fosforados en muestras de aguas
superficiales, subterráneas, suelos y lodos.
Química Forense.- Es posible la aplicación de la cromatografía de gases y la espectrometría de

masas en la detección y cuantificación de analitos de interés en la química forense. Por ejemplo la
determinación, cuantificación de alcohol en sangre, análisis de licores, entre otros.
Campos de Aplicación:
Clasificación por la forma física

del sistema de cromatografía
En relación con la forma física del sistema, la cromatografía puede ser subdividida:
Líquida
Cromatografía
Gaseosa
en columna
Supercrítica
Papel
Cromatografía
plana Capa fina
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Clasificación por la
fase móvil
empleada.
(CLC)
Cromatografía
líquida (HPLC)
Cromatografía (GC)
gases
Cromatografía de
(CSC)
fluidos
supercriticos
11
Clasificación por la fase

estacionaria utilizada.
TLC
CLC
Sólida HPLC
GSC cromatografía gas-sólido
Fase estacionaria Líquida GC – GLC cromatografía gas-líquido
Modificada HPLC/CLC (matriz + Link + GFunc)
Pc análisis
Graficas
Columna
Inyector
Eluyente Detector Residuos

Bomba
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Clasificación por el modo

de separación.
Adsorción: es un proceso físico o químico por el
cual átomos, iones o moléculas son atrapadas o
retenidas en la superficie de un material
1- Adsorción
Absorción: es un proceso físico o químico en el
cual átomos, moléculas o iones pasan de una
primera fase a otra incorporándose al volumen de
la segunda fase.
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2- Partición
El coeficiente de reparto (K) [también

llamado coeficiente de distribución (D), o
coeficiente de partición (P)], de una
sustancia, es el cociente entre las
concentraciones de la sustancia en dos
fases formadas por dos disolventes
inmiscibles en equilibrio.
Separación Cromatográfica:
La cromatografía es un sistema de separación dinámico, porque

continuamente se producen equilibrios entre los componentes de la mezcla
a separar y las fases móvil y estacionaria (fija). La interacción de la mezcla
con las dos fases está influenciada por fuerzas intermoleculares diferentes;
iónicas, polaridad y efectos específicos de afinidad y solubilidad.
Fase móvil
Líquido
Gas
Fase estacionaria ↑Areas
Fase móvil polaridad
Líquido
Fase estacionaria ↑Areas
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Serie Eluotrópica – polaridad

de los solventes
Un disolvente es una sustancia en la
que se diluye un soluto (un sólido,
líquido o gas químicamente diferente),
resultando en una disolución.
La constante dieléctrica y el momento

dipolar de una disolvente, son
propiedades complementarias usadas
para caracterizar su polaridad.
Investigar una serie eluotrópica, disolventes próticos y apróticos

En el proceso de separación se establece un equilibrio entre la

concentración del componente presente en la fase móvil y la fase
estacionaria, es decir una competición entre las fases por el componente. A
esto se le denomina partición o reparto del componente distribuido entre
las fases.
Formas de cromatografía líquida
• Cromatografía de fase químicamente unida (BPC)
Fase normal (F.N.) y Fase reversa (F.R.)

El 90 % de las separaciones cromatográficas modernas se efectúa sobre material químicamente modificado, con un amplio
rango de polaridad y de selectividad: octadecilo, octilo, hexilo, butilo, etilo, ciano, diol, fenilo, amino, nitro, amonio cuaternario,
resto sulfónico, etc.
F.R. (RP-HPLC), Principio: La estructura hidrofóbica es responsable de la partición del analito entre la superficie hidrofóbica
y metanol. F.E.: Superficies hidrofóbicas en sílica gel RP-C18, RP-C8 y grupos fenilo. F.M.: Metanol o acetonitrilo y agua.
Aplicaciones: compuestos poco solubles en agua o metanol, proteínas, péptidos, azúcares, ácidos grasos, fármacos.
F.N. (NP-HPLC), Principio: utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de
interés es polar. F.E.: Sílica. F.M.: hexano o cloroformo. Aplicaciones: Compuestos hidrofílicos e isómeros estructurales.
La NP-HPLC cayó en desuso en los años setenta con el desarrollo de la fase reversa debido a la falta de
reproductibilidad.
• Cromatografía de intercambio iónico (IEC)
Principio: Adsorción reversible de iones en F.E. con grupos funcionales de cargas opuestas. F.E.: Para
cationes; SO32-, CO32-. Para aniones; NH4+, NH3+-R. F.M.: Buffer con pH y fuerza de buffer controlados.
Aplicaciones: Todos los compuestos ionizados, aniones, cationes, azúcares, ácidos carboxílicos, aminas,
etc.
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• Cromatografía Líquido-Sólido (LSC) o de adsorción.
Principio: Adsorción de los analitos en la superficie polar de la sílica gel, ligeramente ácida. F.E.: Sílica gel (pH 2-8);
Alúmina (pH 2-12). F.M.: Disolventes no-polares como hexano, CHCl3 (en raras ocasiones agua). Aplicaciones: Para
muestras no-polares y semi-polares; solubles en hexano; isómeros posicionales.
• Cromatografía de exclusión (GPC)
Cromatografía Permeación en Gel-GPC y Cromatografía Filtración Gel-GFC

GPC, Principio: Los poros internos de la F.E. excluyen a los analitos en función de su volumen hidrodinámico y su PM. F.E.:
estireno, 8% DVB, con diámetros de poro de 80, 100, 150, 300, 500 o 1000 Å. F.M.: Tolueno, Decalina o THF.
Aplicaciones: Polímeros orgánicos, poliestirenos, polietilenos, metacrilatos.
GFC, Principio: es una técnica que se utiliza como primer paso para analizar una mezcla compleja de proteínas o para
caracterizar la distribución de pesos moleculares de polímeros solubles en agua como la poliacrilamida. F.E.: geles
hidrofilicos, Sephadex. F.M.: buffer o agua. Aplicaciones: Biopolímeros solubles en agua.
Cromatografía Quiral: Los isómeros son compuestos que tienen la misma formula, pero difieren en la
orientación espacial de sus grupos funcionales, entre estos encontramos los enantiomeros, los cuales tienen
las mismas propiedades físicas y químicas y solo se pueden separar en ambientes quirales.
Cromatografía HILIC: Una técnica que se viene trabajando desde hace aproximadamente 50 años, pero que
ha tenido auge recientemente debido a al surgimiento de la Cromatografía liquida 2D o bidimensional y LC-
MS, y que genera una mejor separación de compuestos altamente polares como por ejemplo los Azucares.
NPC IIC
1. Fase estacionaria
HILIC
2. Analitos
3. Fase Móvil
RPC
Cromatografía de exclusión por

tamaño, SEC
•Usa las características físicas de los
analitos.
•Los componentes más grandes que el

límite de exclusión de la columna no se
pueden separar.
•Se requiere preparar una curva de

calibración con un conjunto de patrones
de calibración de PM conocido.
•Hay dos tipos de SEC: Una utiliza

disolvente orgánico y la otra utiliza
disolvente acuoso como fase móvil:
La que utiliza disolvente acuoso se

denomina cromatografía de filtración en
gel (GFC) o SEC acuosa. El método GFC
fue desarrollado por J.Porath y P.Flodin
en 1959.
La que utiliza disolvente orgánico se

llama cromatografía de permeación de
gel (GPC) o SEC orgánico. El método de
GPC fue desarrollado por J. Moore EE.UU.
en 1964.
http://shodexhplc.com/lessons/leccion-3-cromatografia-de-particionadsorcion/?lang=es
Cromatografía de afinidad, AFC
•Ofrece la mayor especificidad y

selectividad para el aislamiento y
purificación de biomoléculas.
•Se basa en interacciones bioespecíficas

gracias a las cuales la columna de AFC
absorbe únicamente de la muestra los
componentes que presentan afinidad
con los ligandos acoplados al soporte
cromatográfico.
•Cuando el compuesto retenido es

eluido, se consiguen niveles de pureza
extraordinarios.
•Algunas matrices permiten una fácil

inmovilización de diversos tipos de
ligandos.
http://www.teknokroma.es/userfiles/hplc/603-606.pdf
16
Cromatografía de interacción
hidrofóbica, HIC o RFC
•Separa las moléculas por su
hidrofobicidad superficial, y se
caracteriza por la adsorción de las
biomoléculas a la superficie
hidrofóbica de la resina en una
solución salina y su elución
mediante una gradiente salino
negativo.
•El mecanismo de separación es

similar al de la fase reversa, su
selectividad es diferente, con lo
que ambas técnicas son
complementarias.
•Como regla general, las proteínas

que pueden ser fraccionadas
mediante la precipitación con
sulfato amónico, pueden ser
separadas por esta técnica.
•El termino HIC es común cuando

se habla de purificación de
proteínas y carbohidratos, en tanto
que RPC se emplea para la
separación de moléculas
hidrofóbicas y no a
macromoléculas biológicas.
http://www.teknokroma.es/es/Productos/cromatografia-de-hplc/5/biocromatografia/44/177/interaccion-hidrofobica-hic.aspx 17
Cromatografía de intercambio
iónico, IIC
•Proceso que permite la separación
de iones y moléculas polares
basado en las propiedades de
carga de las moléculas.
•Se usa en casi cualquier tipo de

molécula cargada, incluyendo
proteínas, nucleótidos y
aminoácidos.
•Basandóse en las interacciones de

Coulomb, la fase estacionaria
muestra en la superficie grupos
funcionales iónicos que interactúan
con iones de carga opuesta.
•La cromatografía de intercambio

catiónico retiene catiónes debido a
que la fase estacionaria tiene
grupos cargados negativamente,
mientras que la cromatografía de
intercambio aniónico retiene
aniónes debido a que la fase
estacionaria tiene grupos cargados
positivamente.
19
Fuerzas intermoleculares en la
cromatografía liquida
¿Cuales son las F.
intermoleculares? Repulsión de Pauli
Fuerzas Átomo - átomo
repulsivas Repulsión ion-ion del Na+ Na+
mismo signo Na+ Cl-
Ion-Ion signo contrario
Ion-dipolo Cl-
Fuerzas Fuerzas de Coulomb
intermoleculares Ion-dipolo inducido
R-Fe3+ - O2+
Fuerzas hidrofóbicas
Fuerzas
atractivas dipolo-dipolo H-F
Fuerzas de van der Waals Dipolo instantáneo-dipolo
inducido -OCO+
Puentes de Hidrogeno
Cuanto más intensas sean las fuerzas intermoleculares y mayor

su cantidad aumenta la energía que se necesita para vencerlas.
Hielo
vapor
20
Na+ Na+ Na+ Cl-

Ion-Ion signo contrario
Son las que se establecen entre iones de igual o

distinta carga:
• Los iones con cargas de signo opuesto se atraen

• Los iones con cargas del mismo signo se repelen
La magnitud de la fuerza electrostática viene definida

por la ley de Coulomb. Con frecuencia, este tipo de
interacción recibe el nombre de puente salino. Son
frecuentes entre una enzima y su sustrato, entre los
aminoácidos de una proteína o entre los ácidos
nucleicos y las proteínas.
Asociación Disociación
21
Ión-dipolo
Son las que se establecen entre un ión y una
molécula polar. Por ejemplo, el NaCl se
disuelve en agua.
Esta solvatación de los iones es capaz de

vencer las fuerzas que los mantienen juntos
en el estado sólido.
La capa de agua de hidratación que se forma

en torno a ciertas proteínas y que resulta tan
importante para su función también se forma
gracias a estas interacciones
CL
-
22
Ión-dipolo inducido
Tienen lugar entre un ión y una molécula apolar. La
proximidad del ión provoca una distorsión en la
nube electrónica de la molécula apolar que la
convierte transitoriamente en una molécula
polarizada. En este momento se produce una
atracción entre el ión y la molécula polarizada.
Un ejemplo de esta interacción es la del ión Fe++

de la hemoglobina y la molécula de O2, la especie
ion triyoduro ( I3- ), se explica en base a la
interacción entre el yodo ( I2) y el ion yoduro ( I-).
- +
+ -
Sal Polar
Apolar
23
Interacciones
hidrofóbicas
Las moléculas hidrofóbicas tienden a asociarse en
un medio acuoso, lo hace por razones
termodinámicas: las moléculas hidrofóbicas se
asocian para minimizar el número de moléculas
de agua que puedan estar en contacto con las
moléculas hidrofóbicas.
Este fenómeno se denomina efecto hidrofóbico y

es el responsable de que determinados lípidos
formen agregados supramoleculares.
24
Fuerzas de polaridad
(dipolo-dipolo, fuerzas
de Keesom)
Cuando dos moléculas polares (dipolos) se
aproximan, se produce una atracción entre el
polo negativo de una y el positivo de la otra.
Esta fuerza entre dos dipolos es mas intensa
cuanto mayor es la polarización de las
moléculas, dicho de otra forma, cuanto mayor
sea la diferencia de electronegatividad de los
átomos.
Puentes de hidrógeno
Un puente de hidrógeno es la fuerza atractiva
entre un átomo electronegativo y un átomo de
hidrógeno unido covalentemente a otro átomo
electronegativo.
25
Dipolo Dipolo inducido
Fuerzas dipolo-dipolo inducido

(fuerzas de Debye)
Entre una molécula polar y una molécula apolar. En este caso,
la carga de una molécula polar provoca una distorsión en la
nube electrónica de la molécula apolar y la convierte, de
modo transitorio, en un dipolo. Gracias a esta interacción,
gases apolares como el O2, el N2 o el CO2 se pueden
disolver en agua.
- + - +
+ - + -
Polar Apolar
Polar
Apolar Polar
27
Fuerzas dipolo instantáneo-dipolo

inducido
Las fuerzas de dispersión son fuerzas atractivas
débiles que se establecen entre sustancias no
polares, aunque también están presentes en las
sustancias polares. Se deben a las irregularidades
que se producen en la nube electrónica de los
átomos de las moléculas por efecto de la proximidad
mutua.
La formación de un dipolo instantáneo en una

molécula origina la formación de un dipolo inducido
en una molécula vecina. Aumentan con el tamaño y
la asimetría de las moléculas. Son mínimas en los
gases nobles (He, Ne), algo mayores en los gases
diatómicos (H2, N2, O2) y mayores aún en los gases
poliatómicos (O3, CO2).
28
Cromatografía liquida y fuerzas

intermoleculares
Las fuerzas que intervienen

en este proceso de migración
de la fase móvil hasta el final
de la columna son las
fuerzas intermoleculares,
estas son fuerzas de
atracción entre moléculas,
son más influyentes en los
líquidos y en los sólidos,
determinando el grado de
interacción de las
moléculas a la resina a una
determinada temperatura y
presión.
29
Interacción
Fuerzas intermoleculares molecular
en la cromatografía
liquida Están biomoléculas
No
Son iones los
Si Están iones y
moléculas polares
poliméricas presentes involucrados
presentes
Si No Si No
Hay moléculas
Hay interacciones polares Fuerzas Fuerzas
especificas y selectivas Ion-dipolo Ion-ion
No Si
No Si
Hidrofobicidad -
Hay hidrógenos
Separación por Fuerzas de *Fuerzas de Van
unidos a N, O o F?
tamaño y velocidad afinidad der Waals
No Si
*Fuerzas Puentes de
dipolo-dipolo hidrogeno
Exclusión Afinidad
Hidrofobicidad Intercambio iónico
Adsorción y Reparto
*diferentes tipos de interacciones dipolo-dipolo

30
Características de los tipos de

cromatografía.
Método Aplicación Fases Principio de Propiedad

Móvil Estac. separación del analito
Cromatografía de Compuestos orgánicos Adsorción

líquido-sólido Polaridad
adsorción polares o poco polar, Adsorbente sólido
FNC Crom. fase normal
Cromatografía de Compuestos orgánicos líquido-líquido Adsorción-partición

Polaridad
partición apolares o poco polar, líquido-sólido Adsorbente líquido
FRC Crom. fase reversa
Cromatografía de Compuestos con grupos Competición

líquido-sólido Nat. iónica
inter iónico iónicos o ionizables, IIC Intercambio iónico
Cromatografía de Compuestos PM variado, líquido-sólido

Gel poroso
Tamaño
exclusión por SEC (GFCac, filtración y Peso molecular
tamaño GPCorg, permeación)
Cromatografía de Compuestos biológicos líquido-sólido

Comp. Inmovilizado Forma
Afinidad del tipo receptor- Llave -cerradura estructura
ligando, AFC
31
En Resumen
Modalidades de Cromatografia
Naturaleza
Fase
Naturaleza Estacionaria
Fase móvil • Fenómeno en
Columna
Gas : C. Gaseosa GC
•Liq-Sol (LSC)
Líquido: C Líquida LC •Liq-Liq (LLC) • Afinidad
•Gas-Liq (GLC) • Adsorción
•Capa Delgada TLC •Gas-Sol (GSC) • Partición
•Columna Abierta • Gel poroso
•HPLC * • Intercambio Iónico
• Hidrofobicidad
Líquido/Gas SFC :SFC
2. Tamaño molecular
Cantidad Muestra • Permeación por gel
Aplicada • Filtración por gel
•Analítica: Pg – g
•Semipreparativa: g – gramos
•Preparativa: gramos-
43
Características de HPLC Vs GC.

Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia Cromatografía de Gases
Separa, identifica (dep. detector) y cuantifica

compuestos solubles que dependiendo de las Separa, identifica (dep. detector) y cuantifica
Método interacciones entre las moléculas a ser compuestos que pueden ser vaporizados sin
separadas, la fase estacionaria y el solvente descomposición
usado.
Acrónimo HPLC GC
Moléculas orgánicas volátiles. Sustancias

Moléculas orgánicas, biomoléculas, Iones y
orgánicas volátiles, NO termolábiles, peso
Tipo de analitos polímeros. Volátiles o no, termolábiles o no
molecular promedio (<600 Da)
(amplio rango)
Movilidad de la
Bombas con altas presiones Gas transportador
muestra
Diferentes tipos de solventes con polaridades
Fase móvil Gases inertes N2, H2, He
distintas o mezclas de estos, buffes
Los tamaños van de 5 a 50 cm, hay muchos Los tamaños van de 20 a 100 m, separa muchos
Columnas
tipos de columnas compuestos
Ultravioleta- visible (UV/Vis), Arreglo de
Detector de ionización de llama (FID), Detector
fotodiodos (PDA), espectrometría de masas
de conductividad térmica (TCD),
(MS) e Índice de Refracción, conductividad.
Detectores Detector de captura de electrones (ECD),
Selectivos: GC/MS, Detector de fotoionización
Se requiere de un detector altamente sensible y
(PID), Detector fotométrico de llama (FDP)
"universal".
33

Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia Cromatografía de Gases
Es útil para el análisis de muestras que son

Temperaturas de Implica altas temperaturas, los compuestos son
susceptibles de descomponerse a
análisis estables a esas temperaturas.
temperaturas más altas.
Muestra NO Destructivo, recupera muestra Destructivo, no recupera muestra

Separación de Hidrocarburos, de aceites de
Médica (detección de vitamina D en
plantas, evaluación de la calidad de aceites, la
suero), legales (detección de drogas en la
dosis de un fármaco sólido, identificación y
orina), la investigación (separar los
Aplicaciones cuantificación en investigación de incendios,
componentes de una muestra biológica),
análisis de pinturas, en casos de toxicología,
fabricación (durante un proceso de elaboración
medición de diferentes especímenes biológicos
de productos farmacéuticos y biológicos)
y pruebas en la escena del crimen.
Diagramas de los
sistemas
La diferencia fundamental entre HPLC y GC se encuentra en el tipo de detectores y en la influencia de la

fase móvil. En GC es muy fácil encontrar detectores que diferencien la muestra de la fase móvil (un gas
inerte). Esto no es tan simple en HPLC, ya que la fase móvil no sólo no es inerte sino que su masa es
sensiblemente superior. La eficiencia > GC, viscosidad; la selectividad > HPLC, solventes.
34

Dónde encaja la HPLC: desde lo no polar a lo altamente cargado
Cromatografía
líquida
Cromatografía
Gases
Polycyclic aromatic hydrocarbon

Butylated hydroxyanisole
Butylated hydroxytoluene
Tertiary butylhydroquinone
Trimethylsilyl
Polychlorinated biphenyls
Propilenglicol
Organometallic 35
Instrumental
36
Instrumentación
La cromatografía líquida moderna ha experimentado muchos desarrollos:
• nuevas fases estacionarias
• bombas que permiten entregar caudales estables que varían entre μL y mL
• detectores con celdas intercambiables
• válvulas accionadas por microprocesadores
• control global de uno o más equipos cromatográficos
• desarrollo automático de métodos
• Conexión con otros sistemas cromatográficos HPLC – SFC
Sistema integrado Sistema modular
HPLC integrado Shimadzu LC-2010HT Prominence Shimadzu Modular HPLC

Los módulos son instrumentos individuales que permiten armar
Mejor aprovechamiento del espacio, menos cables, tuberías el equipo según la necesidad del analista y aumentar su
y conexiones expuestas y quizás menores riesgos. complejidad según los avances y requerimientos.
38
Instrumentación
Instrumentación
1. Reservorio; contiene la fase móvil
2. Bomba; impulse la fase móvil dentro del
Sistema de elución del HPLC.
3. Inyector (auto-muestrador); permite

introducir la muestra al sistema de
análisis
4. Columna (pre-columna, guarda

columna y horno); Sistema de
protección de la columna y análisis
(separación) de la muestra.
5. Detector; es un transductor que tiene

como función los cambios de registro y y
la identificación del paso de los
componentes de acuerdo a la elución.
6. Colector de fracciones; recibe y

almacena las fracciones de eluato que
contienen los componentes separados.
7. Computador; Sistema de recolección,

graficación, análisis y almacenamiento de
datos.
39
Reservorios
Puede ubicarse algunos centímetros sobre el nivel de la bomba para que

la fuerza de gravedad dirija el solvente hacia ésta, manteniendo llenas las
conexiones.
Puede emplearse cualquier frasco de buena calidad (vidrio o polímero
resistente como politetrafluoroetileno), con una tapa adecuada para
evitar el ingreso de partículas al sistema (el mismo envase comercial del
solvente).
Al extremo del tubo de salida de solvente se conecta un filtro de acero
(buzo) con 2 o 1Oμm de porosidad. Algunos sistemas necesitan procesos
de desgasificación continua ultrasonido.
La formación de burbujas de aire en el interior de

los pistones, con la consiguiente pérdida de
precisión en el caudal y consiguiente falta de
reproducibilidad en las mezclas y gradientes.
40
Tuberías
Tuberías
La fase móvil empleada debe circular por tuberías que conectan las
diferentes partes del equipo; los reservorios con las bombas, la
bomba con el inyector, éste con los detectores conectados en serie,
y los detectores con un colector de fracciones.
Las tuberías deben ser inertes y resistentes a altas presiones. Se
emplean tubos de acero inoxidable (316 o 304) o polímeros
(polipropileno o teflón).
Tuberías demasiado largas conducen a ensanchamientos extra-
columnares importantes.
PEEK, poliéter éter cetona; son compatibles, químicamente inertes y pueden

usarse en lugar de los tubos de acero inoxidable en la mayoría de los sistemas
analíticos líquidos.
41
Tuberías
Tuberías
Factores a tener en cuenta;
Diámetros internos
Presiones
Resistencia química
Resistencia biológica
Resistencia mecánica
Acero Inoxidable, Los PTFE, Inerte: ideal para Tubo de Acero Inoxidable
tubos de Ac Inox, Grado 304 transferir fluidos a baja 316 mecanizado, Este tubo
para uso general presión como líneas de se corta lectroquímicamente
cromatográfico ó Grado 316 solvente en HPLC y tiene un tratamiento de
para aplicaciones con electropulido, asegurando
máxima resistencia a la bordes perfectamente
corrosión, son adecuados perpendiculares sin rebabas.
para confeccionar columnas,
conexiones en HPLC
PEEK™, Es un poliéter PEEKSil™, La combinación de Tubo GLT™, Se ha

mecánicamente resistente y PEEK con un interior de sílice desarrollado y patentado la
con las características para fundida combina la cualidades de producción de tubo de acero
ser conectados con férulas ambos materiales: Resistencia inoxidable con revestimiento
metálicas ó de polímero. química y mecánica, interno de vidrio (Glass Lined
Excelente inercia química compatibilidad con todos los Tubing).
y biocompatibilidad. solventes y total
biocompatibilidad.
Uniones
Conexiones o uniones
Conectores
Con. Waters SS rosca
Con. Valco SS rosca
Con. SS Fingerlok
Las uniones permiten conectar las tuberías, y con ellas, los distintos
componentes del sistema cromatográfico.
férula tornillo Al fabricar una unión, la férula queda fijada a la tubería y luego al
realizar el primer ajuste esta no se puede mover.
Existen dos tipos de uniones, las convencionales  y las universales
 ; donde la férula está constituida por un polímero deformable y el
tornillo férula tomillo posee una cabeza algo mayor y fresada.
La selección incorrecta de los conectores y el mal ajuste férula -
tubería puede llevar a complicaciones
Picos corridos y ensanchamiento 42

Uniones
Incorrecto ajuste Unión/tubo en

el extremo de la columna
Longitudes requeridas del vástago (distancia de la

tubería más allá del extremo de la férula) para los Conector de
fabricantes de herrajes de columnas comunes columna/precolumna
Volúmenes muertos creados (sombreados
o entre dos en rojo)
cuando se utilizan combinaciones de tuercas /
columnas
casquillos de otros fabricantes
Férula híbrido de titanio/PEEK

utilizado en una tuerca de dedo y
tubo metálico para conexiones de
columna UHPLC
Bombas
Las bombas de HPLC impulsan la fase móvil a través de todo el

sistema. Su caudal de trabajo puede ser muy variable (µL/min –
mL/min), según la escala de trabajo escogida.
Las bombas utilizadas en el HPLC son muy potentes, libres de
pulsos, constantes, reproducibles y precisas, la presión puede ser
hasta de 6000psi (lbs/in2) y todos los componentes deben ser
resistentes a la corrosión.
Existen tres tipos de bombas: bombas recíprocas, bombas de
presión constante o neumática y bombas de jeringa. Las
primeras son las de uso más difundido; son muy versátiles y fáciles
de adaptar a la rutina del laboratorio.
43
Bombas
Columna
Fase
Pistón móvil
Fase
móvil
Pistón
Reservorio
Bomba reciproca o pistón Bomba neumática o constante

Bomba reciprocante de pistones
(va y viene, sube o baja)
Columna
Fase
móvil
Fase
Pistón móvil
Reservorio 35 y 400 µL.
Bomba reciproca o pistón
La mayor parte de los equipos cromatográficos utilizan bombas con pistones de tipo
reciprocante. Existen varios tipos de bombas: de un solo pistón, de dos pistones (equipos
nuevos), de tres pistones, bomba tándem, y bomba a pistón y diafragma.
Esquema de un cabezal de bomba de pistón, a) y b)

entrada y salida de solvente de limpieza del pistón, e)
pistón, d) y e) válvulas de entrada y salida.
Cuando el pistón retrocede por el mecanismo inverso se

cierra la válvula de salida y se abre la de entrada
dejando que el solvente llene la cámara del pistón.
44
Bomba reciprocante de pistones
(va y viene, sube o baja)
Se generan pulsos indeseables ya que durante este ciclo no circula fase móvil, se recomienda;
empleo de atenuadores o amortiguadores de pulsos, empleo de dos o más pistones
sincrónicos, uso de una bomba tándem (cabezal con dos pistones de diferente tamaño,
movidos a distinta velocidad).
Las fases móviles constituidas por solventes puros no causan problemas, pero las soluciones
salinas pueden producir depósitos por evaporación que rayan los pistones, es recomendable
lavar el sistema con un solvente apropiado luego de emplear fases móviles salinas.
Bomba de diafragma
con pistón y soporte
Bombas de diafragma
con pistón El elemento de bombeo en este caso es un diafragma flexible,
colocado dentro de un cuerpo cerrado que se acciona desde el
exterior por un mecanismo reciprocante, que hace aumentar y
disminuir el volumen debajo del diafragma. El diafragma está
constituido por un material flexible, en general acero inoxidable o
politetrafluoroetileno - teflón (PTFE).
Un par de válvulas convenientemente colocadas a la entrada y la

salida forzan el líquido a circular en la dirección de bombeo.
La diferencia principal es que el mecanismo de acción solo mueve

el diafragma en la dirección de la succión, por el empuje de un
resorte. La fuerza de este resorte es la que determina la presión
máxima de bombeo.
Bombas de diafragma
con resorte.
45
Bomba de jeringa
Dispositivo de desplazamiento continuo, donde

el recorrido del pistón y el volumen desplazado
es, en los casos en que se aplica, suficiente para
efectuar un número determinado de ensayos
completos, sin necesidad de recargar su cámara.
La principal ventaja de estas bombas es la total ausencia de pulsos ya que la cámara no

necesita ser recargada, mientras que la principal desventaja está dada por el caudal y/o el
tiempo necesario para recargar esa cámara cuando se vacía.
Este tipo de bomba no es compatible con los sistemas convencionales, con caudales de 1 o
más mL/min, pero es el sistema ideal para la modalidad microbore y capilar, en las cuales el
rango de trabajo se limita a pocos µL/min.
Aumento de la sensibilidad de un sistema Microbore HPLC columns for both

microbore a velocidades de flujo lineales general and specialized use.
comparativos.
12
Válvulas Check para bomba de

pistón
Válvulas Check para bomba de

pistón
Factores que afectan la válvula Check: Aire,

residuos de muestra o fase móvil y solventes
como ACN.
Características de las bombas

Caudal o flujo. Los equipos convencionales operan con caudales entre
línea de
0.1 y 10.0 mL/min y trabajan con presiones de hasta 6000 psi.
base errática
Exactitud en el caudal. La exactitud en la medición del caudal se refiere

a la divergencia entre el caudal de trabajo establecido y el caudal real
entregado (medir volumen de salida).
Ruido. Se refiere a las variaciones (pulsaciones) que presentan las

bombas del tipo reciprocante, y que conducen a variaciones en el caudal
del solvente entregado, en intervalos cortos de tiempo, se deben a: mal
funcionamiento de las válvulas de retención, precipitación de sustancias y
a la aparición de burbujas de aire.
Deriva. La deriva es un cambio continuo (positivo o negativo) en la

entrega de solvente que se produce en intervalos de tiempo muy largos,
que conducen a diferencias en las áreas de los picos.
línea de base causado

por la presencia de aire Sistema de corte. Es conveniente el sistemas de corte de caudal cuando
se superen los valores límites de presión tanto superior como inferior,
evitando; por excesos en la presión, que se dañen los componentes más
sensibles como columnas y celda de los detectores. Por defecto en la
presión, permite detectar las pérdidas de solvente o la incorporación de
burbujas de aire al agotarse la fase móvil.
12
Sistemas de Gradientes
Las eluciones isocráticas sirven para las necesidades básicas, son capaces de separar un
número limitado de picos, 10 o 12. Para sistemas más complejos, o cuando hay “diferente
polaridad" de los componentes, se puede optar por dos alternativas: la corrida
multidimensional (columna switching, acoplamiento CL-CL) o la utilización de un
gradiente de solventes.
Elución Elución con No confundir la programación de solventes con

isocrática gradiente
la programación de caudales. La primera
involucra un cambio de la fuerza de elución,
mientras que la segunda se refiere a la
modificación del caudal o flujo de trabajo.
Isocrática Gradiente en rampas
El gradiente de solventes se gradúa, por la

velocidad de cambio del solvente "débil" al
"fuerte“, (contenido porcentual de los Gradiente lineal o
componente FM). Existen básicamente dos curvado
tipos de formadores de gradientes: los de
baja presión y los de
alta presión.
12
Sistemas de Gradientes
Different strategies of gradient elution. Efectos de la velocidad de flujo de eluyente en la

resolución en HPLC Gradiente.
La composición de eluyente se cambia

continuamente hacia condiciones que favorecen la
disociación del medio de cromatografía. La
posición de elución difiere entre las sustancias
dependiendo de su fuerza de unión
Separación típica de Isocrático y Gradiente de

contaminantes ambientalmente persistentes.
Gradientes
IIC, pH can alter resolution of a method

Figure 18: Use of an isocratic hold to improve

resolution in the mid-section of a gradient elution
chromatogram.
Gradientes
35%
Figure 1 Chromatograms showing the influence
15% 15% of composition of mobile phase on the
separation of the five triazines in the core-shell
column. Chromatographic conditions:
30% (a) 0 to 5 min, isocratic at 15% ACN, 5 to 7
min, linear gradient of 15 to 35% ACN, 7 to 9.5
min: isocratic at 35% ACN, 9.5 to 12 min,
15% 15% gradient of 35 to 15% ACN, and finally, 12 to
15 min, isocratic at 15% ACN;
35% (b) 0 to 5 min, isocratic at 15% ACN, 5 to 7
min, linear gradient of 15 to 30% ACN, 7 to 9.5
min: isocratic at 30% ACN, 9.5 to 12 min,
13% 13% gradient from 30 to 15% ACN, and finally, 12 to
15 min, isocratic at 15% ACN;
35% (c) similar as (a) but starting and finishing the
elution with 13% ACN;
10% 10% (d) similar as (c) but starting and finishing the
elution with 10% ACN.
Flow rate = 1.5 mL min-1, sample volume = 20
µL, detection at 223 nm.
Column; 50 × 4.6 mm internal diameter (i.d.) OnyxTM C18 monolithic column coupled to 5 × 4.6
mm C18 monolithic guard column from Phenomenex® (Torrance, CA, USA)
Bombas binarias y cuaternarias

Existen básicamente dos tipos de formadores de gradientes: los de alta presión y los de baja
presión.
Los gradientes de alta presión utilizan una bomba de alta presión para cada
solvente individual y el solvente se mezcla en una cámara de bajo volumen.
Los gradientes de baja presión emplean, sólo una bomba y válvulas solenoides
que entregan cada solvente en una cámara de mezclado de pequeño volumen.
La bomba binaria se basa en un diseño

en serie de dos pistones y dos canales.
Los flujos individuales de bombeo de
cada una de estas bombas recíprocas
están controlados electrónicamente,
permitiendo mezclar proporcionalmente
el solvente de los dos canales.
Puesto que la mezcla de solventes se produce después de las bombas, se denomina “mezcla a
alta presión”.
12
Bombas binarias y cuaternarias
La desgasificación del disolvente es imprescindible en un sistema de gradiente a baja presión

por lo que el desgasificador de vacío forma parte del sistema de la bomba cuaternaria.
La bomba cuaternaria está compuesta

por un des-gasificador de vacío y una
bomba de gradiente de cuatro
canales. Esta última comprende una
válvula de partición de alta velocidad
y un dispositivo de bomba.
Proporciona un gradiente por mezcla
a baja presión.
• Menor reproducibilidad del

gradiente
• Efectos de Cavitación (burbujas)
• Líneas de base ruidosas y erráticas
(inmiscibilidad) Bomba de gradiente de
cuatro canales
Bomba y válvulas solenoides

Desgasificador de disolventes
En el momento que se comienza una nueva botella de solvente, su contenido se

expone a la atmósfera y empieza a acumular gases disueltos
Los gases que acumulan los disolventes,

sobre todo el oxígeno, pueden ocasionar
problemas de interferencias en los
detectores de fluorescencia y electroquímicos
del HPLC. El nitrógeno disuelto en el eluyente
puede producir burbujas en la columna de
HPLC de forma que cuando el eluente entra
en el detector pueden producir picos
falsos o bien provocar desviaciones en la
línea de base, mientras que el CO2 puede
ocasionar la modificación de pH de los
eluyentes. Se desgasifica por vacío, sonicado
o burbujeo de un gas inerte, He.
12
Inyectores
El inyector es una válvula que permite introducir la muestra en solución sin

interrumpir el flujo a través del sistema, orientan el caudal hacia la
columna, pasando o no según su posición, a través del loop en el cual se
introduce la solución a inyectar. Las válvulas pueden accionarse manual o
automáticamente.
El loop es intercambiable, de modo que la

cantidad de muestra inyectada puede
escogerse entre una serie de medidas
estándar (en los inyectores convencionales,
entre 5 y 2000 µL). Se debe llenar con 3 a 5
volúmenes.
12
El rotor tiene un rango de pH que depende de los

diferentes materiales; Tefzel, ETFE (etilene-
tetrafluoroetileno) fluoropolimero, PEEK, (Poliéter éter
cetona) y Vespel marca comercial de una gama de alto
rendimiento de poliimidas, plásticos fabricados por DuPont.
Mantener el inyector en la posición

"inject" (paso principal) el tiempo
necesario para permitir que la fase
móvil fluya a través del loop, esto se
controla solo en los automuestreadores,
en la posición de “load” debe
permanecer el equipo.
Inyectores
12
Detectores
La separación real de cada componente en la muestra se realiza

dentro de una columna, sin embargo, esta separación tiene que ser
“registrada” para que seamos capaces de verlo.
El detector es la parte del equipo cromatográfico que permite "ver" y

ubicar en tiempo y espacio la posición de cada componentes de una
muestra a la salida de la columna cromatográfica.
No hay un detector universal que pueda revelar todos los compuestos,

hay muchos detectores para el análisis LC. Los componentes separados
de un equipo HPLC se controlan y se comunican electrónicamente.
12
Detectores
Visión y los colores
12
Detectores PDA
Three-dimensional chromatogram of SR extract. High-

performance liquid chromatography photo-diode array analysis
was used to produce a three-dimensional chromatogram in
order to confirm and quantify the major components of SR
extract (baicalin, baicalein and wogonin). SR, Scutellariae
Radix.
12
Características de los Detectores

Amplio rango dinámico de respuesta. Es el rango de
concentraciones de una sustancia en análisis, en la que un cambio
en la concentración produce un cambio en la señal. Como puede
deducirse, esto incluye tanto la respuesta lineal como no lineal.
Respuesta lineal. El detector debe medir alguna propiedad del

analito que se incremente linealmente al aumentar su
concentración. Analito ∝ Respuesta lineal (concentración).
Ensanchamiento de banda extra-columnar. se refiere a la

pérdida de eficiencia, tanto por las dimensiones de la celda (3 a
12µL) como la longitud y diámetro de la tubería de conexión.
Responder a todos los solutos. La situación ideal es, obviamente, que el

detector responda a todo tipo de solutos.
Tener una constante de tiempo baja. La constante de tiempo de un

detector indica la velocidad con que éste responde a un cambio
instantáneo de la concentración del analito. Los valores habituales en un
detector cromatográfico son; Resp. rápida 0.5, 1.0 y 5.0 Resp. Lenta.
No afectarse por cambios de temperatura. En lo posible los cambios de

temperatura no deben modificar la señal emitida por los detectores.
Poseer una buena relación señal/ruido. El ruido de un detector es la

combinación de los términos de ruido largos y cortos en un tiempo, se
deben a la electrónica propia del instrumento, a variaciones de temperatura,
oscilaciones en la línea eléctrica o a fluctuaciones en el caudal.
12
Detectores Generales;
índice de Refracción
Los detectores generales miden el cambio de alguna propiedad física de la fase móvil que
contiene el analito en comparación con la misma fase móvil pura. Ejemplos típicos son
el detector de índice de refracción y el de conductividad.
Este detector mide la diferencia de índice de refracción

entre el solvente puro y el solvente que contiene la
muestra. Es un detector universal y no destructivo,
poco sensible, lo cual limita su campo de aplicación y es
afectado por cambios de temperatura. No puede
utilizarse gradiente de solventes. Existen tres tipos
diferentes de detectores de Índice de Refracción: Fresnel,
Deflexión, Interferométrico.
Opera según la ley de Fresnel, "la cantidad de luz reflejada

en una interfase líquido/vidrio varía con el ángulo de
incidencia y con el índice de refracción del líquido".
12
Filtro IR
3µL
Se emplea en muestras que no tienen absorción UV, tal

como azúcar, alcohol, o iones inorgánicos, obviamente, no
puede ser medida por un detector de UV., donde la
intensidad observada por un detector RI es comparable a la
concentración del analito.
En el interferométrico, la luz emitida por la fuente se
polariza y divide en dos haces por un divisor de onda.
Luego atraviesan la celda de referencia y la de medida.
Finalmente, se recombinan por una segunda lente y por
un divisor de onda para llegar al fotomultiplicador.
Cuando se produce una diferencia en los índices de

refracción de las celdas se da un cambio de fase
entre ambas ondas y se origina una diferencia en la
intensidad de luz que llega al fotomultiplicador.
Un detector diferencial que, al contrario del

Fresnel, sólo usa un prisma para todo el rango de
índices de refracción, pero emplea celdas de mayor
tamaño, del orden de 8 a 10μL.
Una celda contiene la fase móvil pura, y a través de otra

celda fluye el eluído de la columna. Cuando se produce
un cambio del índice de refracción, es registrado por el
sistema óptico.
12
Detectores generales;
Otros detectores
Efluente de
columna
Regulador
de presión Nebulización Detector evaporativo de dispersión de luz (ELSDE,
Gas Nitrógeno vaporativo Light Scattering Detector), ofrece una buena
Nebulizador
sensibilidad para analitos no volátiles a nivel de ng. El
Tubo de
calentamiento
Evaporación
fase móvil
eluyente de la columna se nebuliza y después se evapora
Gotitas de para formar partículas finas. El analito es entonces irradiada
muestra
con un haz de láser y la radiación dispersada es detectada. Se
Detección analizan lípidos, azúcar y analitos de alto peso molecular. El
ELSD se puede utilizar por el método del gradiente.
Fuente de Detector
luz laser
Escape
Detector de conductividad, Se basan en cambios de

conductividad de la fase móvil en presencia de moléculas de
analito, formado por dos celdas asiladas que contiene dos
electrodos a los que se aplica una diferencia de potencial,
de manera que se mide la resistencia que ofrece la mezcla
eluida. Mas utilizado en GC.
Útil para la determinación de analitos iónicos. Su límite de

detección esta entre 0,5 y 1 ng. es sensible a los cambios de
temperatura y no puede emplearse en elución en gradiente.
12
Detectores selectivos;
Detector UV
Los detectores selectivos son aquellos sensibles a alguna cualidad propia del soluto, por
ejemplo el detector UV, que producirá una señal proporcional a la absorbancia por el soluto a
una longitud de onda dada. Otro, detector de fluorescencia, empleado para la detección de
solutos con fluorescencia natural o conferida por reacción (derivatización) con un reactivo
fluorogénico.
Es el detector más empleado en HPLC. Posee

buena sensibilidad y rango lineal, y permite
detectar analitos en el orden de los ng. No es
destructivo y puede emplearse con gradientes de
solventes. En general permiten cambiar el
volumen de su celda, típicamente con volúmenes
de 1 a 12 µL.
El detector UV opera en el rango 190 a 350 nm, y

en algunos equipos se puede extender a la zona
del visible del espectro (350 a 700 nm) recibiendo
así el nombre de detector UV Visible.
12
Detector UV
Detector de onda fija o fotométrico
Este detector opera a longitudes de onda prefijadas

(254Hg, 214 Zn, 229Cd), suelen emplearse filtros que
permiten trabajar a 313, 334, 365 y con filtros de óxidos
de fósforo a 280 nm.
Estos filtros, al ser irradiados con la lámpara de mercurio

emiten a estas longitudes de onda.
12
Detector UV
Detector de onda variable o
espectrofotométrico
Este detector es simplemente un
espectrofotómetro, en el cual se reemplaza el
compartimiento de cubetas por una celda de
flujo.
Emplea una lámpara de emisión contínua

(Deuterio o Xenón). La luz se enfoca en un
monocromador, habitualmente una red de
difracción, y la luz monocromática escogida se
dirige a la celda y de allí al fotomultiplicador.
Los detectores UV, VIS, y PDA se clasifican como detectores de

absorbancia. Proporcionan una buena sensibilidad para que
compuestos que absorbe la luz a nivel ~ pg.
Detectores UV y VIS visualizan el resultado obtenido en dos

dimensiones (intensidad de la luz y el tiempo), pero PDA añade la
tercera dimensión (longitud de onda).
12
Análisis de compuestos que presenten diferente longitud

de maxima absorción y tiempos de retención,.
This paper describes the development and

validation of a simple and efficient bioanalytical
procedure for simultaneous determination of
alprazolam, clonazepam, diazepam in human
serum samples using high performance liquid
chromatography with photodiode-array
detection, regarding a fast elution methodology
in 4 min
Detector UV
Selección de una celda de flujo Evite el uso de soluciones alcalinas con pH > 9.5
que pueden atacar el cuarzo y perjudicar el
rendimiento óptico.
Los solventes acuosos permiten el crecimiento de

algas.
Cuando deje el HPLC sin funcionar, bombee fase

móvil con al menos 5-10% de solvente orgánico
(por ejemplo: acetonitrilo o metanol ).
Si va a estar largo tiempo sin usar la celda de

flujo o va a transportar el equipo, dejarla con
Isopropanol.
Utilice la celda de flujo más grande para obtener el
Respete los límites
mejor límite de presión
de detección. dela
Utilice las celdas
celda de
de flujo
flujo.
más pequeña para obtener la mejor resolución de
los picos.
12
Detector UV y fluorescencia
Detector de ordenamiento o
En los dispositivos "convencionales", la red de
arreglo de fotodiodos, PDA
difracción se ubica antes de la celda, la que recibe
la luz monocromática seleccionada. En el detector
PDA se emplea un sistema óptico invertido: la celda
se ilumina con luz "blanca" y la luz emergente de la
celda llega a la red de difracción y de allí hacia el
elemento fotosensible. En lugar de una fotocélula se
emplea un conjunto de fotocélulas o fotodiodos
aberración cromática y un doblete acromático
montados en un chip de silicio. De esta forma, se
consigue medir todo el espectro de absorción del
eluato en tiempo real.
Monocromador de excitación Monocromador de emisión
El detector de fluorescencia. se utiliza

para el análisis de sustancias con
fluorescencia "natural" o por derivatización
Fotomultiplacador
con un reactivo fluorogénico. Presenta una de control
alta sensibilidad y selectividad. Se utilizan Red de Rejilla Red de

Rejilla
dos longitudes de onda, una de excitación y difracción Divisor
de Haz
difracción
Lámpara Modulador
otra de emisión. Al excitar la muestra a una de Xenón Fotomultiplacador
longitud de onda varios componentes de la
muestra podrían absorber energía, pero
pocos emitirán a la longitud de onda elegida.
12
Detector electroquímico
Detector electroquímico Este tipo de detectores responden a analitos
susceptibles de reducirse u oxidarse.
Es un detector muy sensible, unas 1000 veces más
sensible que el detector UV, y altamente selectivo. La
selectividad se debe, a que detecta compuestos
capaces de ser oxidados y reducidos, y a que puede
disminuirse el número de esos compuestos
detectados por una elección del potencial aplicado.
La cubeta de flujo admite varios electrodos

de referencia.
Varios modos de detección se pueden usar,

incluidos los modos de corriente continua,
amperométrico pulsante y de barrido
12
Detector electroquímico
Este detector emplea tres electrodos: el
electrodo de trabajo, el de referencia y el auxiliar.
En el electrodo de trabajo se mantiene el
potencial a un valor seleccionado, respecto a un
electrodo de referencia (Ag/AgCl); potencial fijo y
estable, y se mide la corriente que pasa entre el
electrodo de trabajo y un electrodo auxiliar, en
función del tiempo. Un potenciostato provee la
diferencia de potencial entre el electrodo de
trabajo y el auxiliar, que se monitorea por
feedback desde el electrodo de referencia.
La desgasificación es esencial, la presencia de aire disuelto

da lugar al gasto de potencial en la reducción del oxígeno, lo
que crea señales ruidosas y baja sensibilidad.
El electrodo de carbón es compatible con solventes orgánicos, como fases móviles se emplean
buffers (ya que deben ser conductoras), en general de fosfatos, de concentración menor a
0.02M para permitir el empleo de modificadores orgánicos (metanol, acetonitrilo, THF).
12
Espectrometría de masas
Ionización
Sistema de espectrometría Electrospray ionization (ESI)
de masas
Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)
Fuentes de ionización
Ionización por impacto electrónico

Ionización química
Fuente de bombardeo con átomos rápidos
Desorción con láser
Ionización a presión atmosférica:
HPLC Electronebulización asistida con un gas: electrospray
Ionización química a presión atmosférica
Fotoionización a presión atmosférica
Atmospheric pressure photoionization (APPI)

Ionización
Sistema de espectrometría
de masas
Electrospray ionization (ESI)

La fase móvil con el analito se nebulizan a un elevado voltaje
asistidos con una corriente coaxial de N2 generando un fino aerosol,
con formación de microgotas altamente cargadas (la solución ya
contiene iones)
A medida que el solvente se evapora, la densidad de

carga en las gotas aumenta y al llegar al límite Rayleigh
la gota sufre explosiones de Coulomb y se rompe en
gotas más pequeñas. Los iones libres de solvente
(desolvatados) se mueven hacia el analizador de masa.
Ionización
de masas Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)
Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)

La fase móvil y el analito se nebulizan (dispersan en pequeñas gotas) y
vaporizan a elevada temperatura, y entran en la región corona (entre la
aguja y el capilar).
Las moléculas de fase móvil se ionizan en la región corona por
electrones provenientes de una descarga eléctrica, transformándose en
iones gaseosos reactivos (solvente cargado).
Estos iones reactivos (iones formados de la fase móvil) reaccionan con
las moléculas de analito, ionizándolas
Reacciones de ionización positiva

negativa
Ionización
de masas
Atmospheric pressure photoionization (APPI)

El solvente y la muestra se nebulizan y son completamente vaporizados
por calefacción. La ionización del solvente y la muestra ocurre por
bombardeo con fotones a partir de una lámpara UV.
Mecanismos de ionización por APPI
Ionización
Analizador de masas
de masas
Los analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) que operan

en monitoreo de reacciones múltiples (MRM) se utilizan
mayormente para la cuantificación de analitos. En el
modo MRM, el primer cuadrupolo filtra un ión precursor
específico; luego el segundo, la celda de colisión, genera
fragmentos (iones producto); finalmente, éstos se filtran
en el tercer cuadrupolo
El cuadrupolo, se compone de 4 barras alargadas en

formación cuadrada, conectadas eléctricamente entre sí
en pares opuestos. A dichos pares (polos) se les aplica
una tensión de radiofrecuencia y voltaje variable que
sintoniza con un determinado ion. Cuando existe
sintonía entre el ion que está pasando por ellas y la
frecuencia aplicada, dicho ion continúa su camino
desviándose todos los demás no sintonizados fuera del
cuadrupolo y de esta manera no impactan en el
detector.
Analizador de tiempo de vuelo (TOF), El TOF es el

analizador que más comúnmente se acopla a la
fuente MALDI, la determinación de la masa en una
región de alto vacío se realiza mediante una medida
muy precisa del período de tiempo desde la celeración
de los iones en la fuente (source) hasta que impactan
con el detector.
Analizador de trampa iónica (ITD), Es un dispositivo

formado por tres electrodos, el sistema tiene el mismo
fundamento que el analizador de cuadrupolo. Se aplican,
simultáneamente, una corriente continua y un potencial
de radiofrecuencia, de tal forma que los iones generados
quedan confinados dentro del anillo toroidal. Los iones
son expulsados de la cámara tras la aplicación de
rampas de radiofrecuencia. Conforme aumenta el
voltaje, aumenta la amplitud de su movimiento
oscilatorio hasta ser expulsados.
La espectrometría de masas de resonancia ciclotrónica

(Fourier transform ion cyclotron resonance mass
spectrometry, FTICR-MS), los iones son atrapados en
una celda, generalmente con estructura cúbica,
compuesta por tres pares de placas. Un par sirve para
mantener al ion atrapado, otro sirve para excitarlo, y el
último realiza las labores de detección. Los átomos que
se desean analizar se introducen en el interior de esta
celda, y un haz de electrones provoca su ionización.
Estos adquieren un movimiento circular ciclotrónico,
causado por un poderoso campo magnético. La
frecuencia de este movimiento es característica, y
depende de la masa del ion y de la intensidad del
campo.
Modos de adquisición de la señal
Modo SCAN:
consiste en hacer barridos entre dos masas para
tener una información total del contenido de la
muestra a analizar. Es el modo a emplear en
análisis cualitativo para la identificación de
compuestos por búsqueda en biblioteca de
espectros. También puede utilizarse para análisis
cuantitativos.
MSD* es un Sensibilidad media cuando TIC (Total Ion Chromatogram): cromatograma

detector se trabaja con el TIC correspondiente a la suma de abundancias a todas las
universal masas adquiridas. Menor sensibilidad..
Figura 3 El cromatograma de iones totales (TIC)
En modo de LC-MS y el cromatograma de iones electivos
SCAN (EIC) de la solución de muestras de tabaco
Muy selectivo y con buena curado por combustión en modo iones positivos.
sensibilidad cuando se trabaja EIC (Extracted Ion Chromatogram):
con iones extraídos EIC. cromatograma correspondiente a una
determinada masa (extraída del bárrido). Mayor
sensibilidad..
*detector selectivo de masas

Modo SIM:
consiste en una monitorización selectiva de iones
característicos de los compuestos presentes en la
muestra. En modo SIM el MSD es un detector muy
sensible y muy selectivo. Es el modo a emplear
para análisis cuantitativo de trazas de compuestos
conocidos.
La comparación de las respuestas de los

MSD* es un iones (cualificadores), el patrón confirman
detector muy la identificación del compuesto.
select. y senc.
La sensibilidad se incrementa con la
En modo
reducción del nº de masas seleccionado y la
SIM
selectividad con el aumento de la masa
monitorizada.
La modalidad SIM con cuadrupolo
proporciona, especialmente a nivel de
trazas, una mejor reproducibilidad
cuantitativa que el modo SCAN
Espectros de masas en modo SIM de OPP. Muestra de

AEL (a); espectro de patrón de OPP guardado en
biblioteca (b)
Modo SRM
El control de reacción seleccionado es un método usado
en espectrometría de masas en tándem en el que se
selecciona un ión de una masa particular en la primera
etapa de un espectrómetro de masas en tándem y se
selecciona un producto iónico de una reacción de
fragmentación del ión precursor en la segunda
Espectrometría de masas para su detección.
Tenemos 3 péptidos entrando en el masas. El péptido A de

interes, se selecciona esa masa en la primera fase (MS1). Con
esto ya nos quitamos el péptido C, sin embargo, tenemos al
péptido B que nos daría “ruido” en la medición de nuestra
proteína. Para ello pasamos los péptidos por la celda de
colisión y de los fragmentos generados solamente
seleccionamos en una segunda fase (MS2) aquellos que
provengan de nuestro péptido de interés A.
Q1 Q2 Q3
Quadrupole Collision Cell Quadrupole
Ion Ion
Source Optics Detector
Scan, SIM, Scan, SIM,

or ion guide CID or ion guide
or ion guide
Scan Mode Q1 Q2 Q3
Q1 Scan Scan Ion guide Ion guide
Q3 Scan Ion guide Ion guide Scan
Product ion SIM Fragment Scan
scan
Precursor Scan Fragment SIM
ion scan
Neutral loss Scan Fragment Scan
scan
■Q3 Scan (more

common)
Q1:Pass all Q3:Scan

ions Q2:Pass all
ions
Q1:Scan Q3:SIM
Q2:CID
• Q1 : modo scan
• Q2 fragmenta los iones usando el gas y la energía de
colisión
• Q3 operata en modo SIM para seleccionar una
específica m/z generada de todos los precursores
• Elucidación de la estructura
Detectores
Detector de copa de Farada;

Consiste en un simple electrodo, normalmente en
forma de copa o caja, que recibe el impacto de los
iones a detectar. Los iones se neutralizan por
transferencia de electrones, y la señal se mide como
una corriente analógica igual o superior a la
corriente iónica original, dependiendo de la forma del
electrodo. Es un detector de baja sensibilidad y
gran sencillez.
Multiplicador de electrones secundarios;

Son los detectores más utilizados en espectrometría de masas, es el
multiplicador de electrones de dínodos. El cátodo y los sucesivos
dínodos tienen superficies de Cu/Be de las que se emiten ráfagas de
electrones al ser alcanzadas por iones o electrones de elevada
energía.
El ión a detectar choca con el primer dínodo, provocando la emisión

de un elevado número de electrones, que van a incidir sobre el
segundo dínodo. El proceso de multiplicación se repite sucesivamente
en los demás dínodos, obteniéndose al final del sistema una
amplificación de señal del orden de 106 a 108. Es un detector mucho
más sensible que el de copa Faraday.
Detector "Channeltron"
Este detector es uno de los más utilizados hoy en día en
espectrometría de masas para uso general. Es similar al
multiplicador de electrones clásico, con la principal diferencia
de que no tiene múltiples dínodos discretos, sino que está
formado por un tubo de vidrio en forma de corneta, a veces
terminado en forma de espiral o caracol, cuyo interior está
recubierto por un óxido de plomo semiconductor de composición y
características especiales.
Sistema de toma y
procesamiento de datos
Computador e impresora
El resultado del ensayo cromatográfico es un gráfico o cromatograma, de cuya interpretación

pueden extraerse conclusiones cualitativas y cuantitativas. Una computadora, permite con el
software apropiado tanto el registro gráfico del cromatograma, como los cálculos apropiados,
la manipulación de datos, el almacenamiento de ensayos, la generación de reportes e incluso
el manejo global de varios cromatógrafos.
12
Disolventes
La fase móvil en HPLC cumple un rol fundamental, ya

que puede por sí misma modificar completamente la
selectividad de las separaciones en fase normal y
es, a la vez, el verdadero "motor" de las separaciones
en fase reversa, es la variable del sistema que
permite mayor variación, dando esos pequeños
retoques necesarios para lograr una perfecta
separación. En HPLC es posible lograr un número muy
grande de diferentes separaciones con una columna,
tan sólo variando la composición de la fase móvil.
Propiedades de los solventes
Un solvente apropiado para HPLC debe cumplir

con algunos requisitos, entre los cuales
podemos destacar los siguientes:
Alto poder solubilizante Baja reactividad

Compatibilidad con el detector Alto punto de ebullición
Baja viscosidad Alto grado de pureza
Seguridad
12
Disolventes
Poder solubilizante
Es conveniente que el solvente de disolución de la

muestra sea la misma fase móvil. De no ser así, debe
tenerse en cuenta tanto la miscibilidad entre el
solventes, como la posible precipitación de
componentes de la muestra.
Miscibilidad; se refiere a la propiedad de los

líquidos para mezclarse en cualquier
proporción, formando una fase homogénea.
La precipitación se da por una reacción química,

por evaporación del solvente, por enfriamiento o
por cambio de polaridad del disolvente.
Los compuestos menos solubles precipitan en la cabeza de la columna, lo que genera un

aumento de la presión luego de varias inyecciones, la aparición de picos extraños al
cromatograma verdadero (impurezas retenidas). Si la precipitación se da en un sector central
de la columna, y se interrumpe el caudal del solvente, o no puede restablecerse, la columna
no podrá ser lavada ni recuperada.
12
Disolventes
Poder solubilizante
12
Disolventes
Poder solubilizante
Se muestran varios
solventes “misibles
universales”, como el
THF miscible con la
mayoría de disolventes.
El IPA es una elección
muy popular como
solvente intermedio
cuando hay cambio de
eluyentes de fase reversa
a fase normal y
viceversa.
12
Disolventes; Propiedades de los
solventes
Efecto de la fuerza del disolvente
Los disolventes que interaccionan fuertemente con los solutos, se les denomina disolventes
“fuertes”. Para revelar cuantitativamente la polaridad de los disolventes se han desarrollado
varios índices (índice de polaridad, parámetro de solubilidad, la fuerza eluotrópica).
Índice de polaridad; se basa en las medidas de solubilidad

para la sustancia en cuestión en tres disolventes: dioxano (un
aceptor de protones de dipolo débil), nitrometano (un aceptor
de protones de dipolo intenso) y etanol (un donador de
protones de dipolo intenso). (Snyder, 1978).
Parámetro de solubilidad; es una medida de las fuerzas entre

moléculas o, de la presión interna de una substancia. (Hildebrand,
1962).
Fuerza eluotrópica; Este parámetro define la energía de adsorción

de cada disolvente por unidad de superficie de sílice respecto al
valor del pentano, que es igual a “zero”.
*donde, t1r y tnr son los tiempo de retención del primero

y del ultimo compuesto, tg es el tiempo de gradiente.
12
Si los disolventes son miscibles, se pueden

hacer combinaciones binarias, ternarias o
cuaternarias variando las proporciones.
En cromatografía en “fase reversa”, la

fuerza de arrastre de la fase móvil es menor
cuanto mayor sea el valor de εo.
Reglas generales para las operaciones

en gradiente
a) El empleo de gradiente se justifica

cuando se trata de mezclas con un amplio rango
de polaridad.
b) Se hace un gradiente (entre el 5% y
el 100% de disolvente fuerte, en 40-60 minutos),
para decidir si se utiliza una elución isocrática o en
gradiente.
• Si [(t1r-tnr)/tg] > 0,25, utilizar elución en

gradiente.
• Si [(t1r-tnr)/tg] < 0,25, utilizar elución isocrática.
solventes
Reactividad
Los solventes con un elevado grado de
reactividad no se utilizan en HPLC, ya que
pueden reaccionar con la muestra
(modificación), la fase estacionaria (alteración),
o los componentes del equipo cromatográfico
(oxido/reducción).
Adición nucleofílica
FM FE
Compatibilidad con el detector utilizado
El detector de HPLC más difundido es el

espectrofotométrico UV-Vis, es habitual elegir un
solvente "transparente" a la longitud de onda de
trabajo.
UV 400-200 y Vis 400-700 nm
12
solventes
Punto de ebullición
Si el solvente tiene bajo punto de ebullición,
su volatilidad es alta y la composición de la
fase móvil varia durante la corrida, da lugar a
la formación de burbujas, irregularidades del
caudal y atascamiento de pistones.
Un alto punto de ebullición se correlaciona, con

alta viscosidad, alta presión y baja eficiencia
de separación. En general, se prefieren los
solventes de punto de ebullición intermedio.
Viscosidad
Con solventes viscosos, la eficiencia de la

separación es menor porque se dificulta la
transferencia de masa del soluto entre la fase
móvil y la fase estacionaria, y aumenta la
presión.
P Presión (Atm) obtiene con agua a un caudal de 1 mL/min
f Factor que vale 1000 para columnas de acero
p= 2.1 f L L Longitud de la columna (cm)
dp2 D2 dp Tamaño de las partículas expresada en µm
D El diámetro interno de la columna medido en mm.
12
Disolventes y aditivos de
“fase reversa”
Disolventes de “fase reversa”
Las fases móviles de fase reversa están constituidas por mezclas de solventes polares, en
general agua, y un modificador orgánico (metanol, acetonitrilo, THF), con o sin el agregado
de aditivos (sales inorgánicas o reactivos de apareamiento iónico).
15 minutos
El agua; es el solvente más utilizado en HPLC. El agua Evaluación de la calidad del agua
para cromatografía, (C18) a 254 nm (MeOH)
destilada y desionizada presenta sustancias orgánicas

de tipo ftalatos, cloraminas, trihalometanos, etc., que
no se eliminan y que actúan como “recubrimientos
líquidos" de la columna, modificando su selectividad.
Algunos métodos de purificación son destilación doble

con permanganato de potasio o pasaje a través de
columnas o cartuchos (copolímero de estireno y
divinilbenceno, C18).
El metanol es el modificador orgánico más

utilizado, en mezclas con agua o buffers, se
prefiere por su poder disolvente de sales.
El acetonitrilo tiene una selectividad muy diferente al metanol y constituye, la primer

alternativa ensayada cuando se busca cambiar. Almacenar en la oscuridad y bien cerrado es
muy higroscópico.
12
El tetrahidrofurano, es un solvente que tiende a formar rápidamente peróxidos, por lo cual

se lo suele comercializar con antioxidantes, no debe utilizarse con el detector UV. El THF
grado HPLC no contiene estabilizantes, se recomienda adquirir envases pequeños y confirmar
su estado de pureza..
El dioxano tiene una selectividad semejante al tetrahidrofurano, pero su alta viscosidad

limita su uso en en HPLC, salvo como aditivo en pequeñas proporciones.
Hoy en día, los nuevos equipos funcionan con presiones

más altas (4x107 Pa, 6000 psi) y solventes de alta
pureza son disponibles. Por lo tanto, algunas fases
móviles menos comunes merecen nueva investigación.
Entre los disolventes disponibles con alta pureza y bajo
absorbancia en UV-VIS, esta el etanol, un disolvente que
es mucho menos tóxico que el metanol y acetonitrilo. Es
un modificador de fase móvil prometedor para el uso
rutinario de laboratorio, especialmente a temperaturas
altas, donde la viscosidad de la fase móvil es menor.
“fase reversa”
Aditivos de “fase reversa”
Numerosos métodos cromatográficos requieren el uso

de sales en la fase móvil, generalmente para el
control y regulación del pH o de la fuerza iónica;
requieren alta pureza (Porapak Q o C18 o carbón
activado.
Los fosfatos son muy usados en cromatografía de

fase reversa debido a su baja absorción UV. Los
buffers de acetato o de citrato se utilizan menos. El
primero porque presenta una alta absorción al UV y el
segundo porque forma complejos con la sílice de las
columnas reduciendo su vida útil.
No se recomienda el uso de sales de haluros,

formiatos y sus ácidos ya que atacan al acero
inoxidable (cambiar por titanio y PTFE).
12
“fase reversa”
Control del pH; Cuando un ácido esta 2 unidades
de pH por encima o por debajo de su pKa,
estará > 99% ionizado o no ionizado,
respectivamente. Las bases son ionizadas por
debajo de su pKa y no ionizados por encima de su
pKa.
La forma no ionizada será menos polar (más

hidrofóbica), por lo tanto, a pH bajo, los ácidos
serán más retenidos, mientras que bases serán
más retenidos a pH alto.
Las aminas se utilizan habitualmente para reducir el tailing (asimetría de pico) de los picos de
sustancias de carácter básico. Las alquilaminas de uso más común son la trietilamina,
etilamina, dietilamina y dibutilamina, en bajas concentraciones (1 - 20 mM).
Los ácidos más utilizados son el acético y el fosfórico. Se los emplea generalmente para
controlar el pH en RPLC.
Los reactivos de apareamiento iónico, empleados para el análisis de sustancias orgánicas

iónicas o ionizables. Básicamente, existen dos tipos de reactivos de apareamiento iónico: las
sales de tetraalquilamonio empleadas para el análisis de solutos ácidos y los alquilsulfonatos,
para los solutos básicos.
12
No ionizada No ionizada
pH de trabajo; Influencia del pH





Columnas; Criterios de Selección

pH de trabajo; Limitaciones
Disolventes de
“fase normal”
En cromatografía de fase normal, donde se emplean solventes no polares, el problema más
frecuente es la desactivación de la columna de sílice o alúmina por adsorción de agua.
Para eliminar el agua de los solventes, se puede utilizar un desecante como el sulfato de
sodio anhidro, la alúmina básica o tamices moleculares de 4 Á.
Los éteres etílico, propílico e isopropílico tienen una alta presión de vapor, y son altamente
inflamables y susceptibles de formar peróxidos, por ello su uso es muy limitado en HPLC.
Los hidrocarburos halogenados todos los compuestos halogenados pueden contener

trazas de ácido clorhídrico o bromhídrico, muy reactivos frente al acero inoxidable.
• El cloruro de metileno es uno de los hidrocarburos halogenados más estables. Su

degradación térmica se produce a temperaturas mayores a los 120 oC con producción
de ácido clorhídrico y trazas de fosgeno.
• El cloroformo se puede descomponer a la luz, en presencia o no de aire,
formando fosgeno y ácido clorhídrico. En NP la presencia del etanol (estabilizante)
modifica la polaridad y selectividad de la fase móvil, por lo que los cromatogramas
obtenidos utilizando cloroformo con o sin estabilizador pueden diferir.
• El tetracloruro de carbono no se utiliza en HPLC, dado que es muy sensible a la
ruptura oxidativa por exposición al aire, humedad o luz y es un solvente tóxico.
• El 1,1,2-tricloro-l,2,2-trifluoretano (FC-113) Este solvente se caracteriza por su
baja toxicidad, alto grado de pureza y buena transparencia UV (corte a 231 nm) con
una fuerza de elución comparable a la del n-hexano
12
Los hidrocarburos alifáticos son solventes muy transparentes a bajas longitudes de onda y
poco viscosos. Debido a estas propiedades son especialmente adecuados para trabajar en
HPLC. Desafortunadamente, suelen contener trazas de olefinas o benceno los que dificultan su
empleo por debajo de los 260 nm.
Disolventes; Preparación de las

fases móviles
Preparación de las fases móviles
Naturalmente, el trabajar con solventes de
alto grado de pureza, implica también el
empleo de materiales volumétricos muy
limpios. Un factor a tener en cuenta es la
posible contracción de volumen, que se
produce al mezclar solventes muy polares
(Metanol-agua, 98 mL, no usar probeta).
Filtración
La filtración de las fases móviles se considera
como parte de un tratamiento preventivo para
cuidar el adecuado funcionamiento del equipo
de HPLC.
El empleo de guardacolumnas, altamente recomendado, constituye un filtro final previo a la
columna. La filtración se efectúa por medio de membranas de 0.45 ó 0.22 µm de
porosidad en equipos de filtración adecuados y es útil para eliminar tanto las partículas como
las bacterias. Se recomienda descartar los primeros mililitros del filtrado.
Las soluciones a inyectar también deben filtrarse, idealmente a través de membranas
semejantes a las empleadas para la fase móvil, si la cantidad de muestra es muy pequeña,
se puede reemplazar por centrifugación.
12
12
Disolventes; Preparación de las

fases móviles
Desgasificación
Los gases disueltos en la fase móvil pueden producir varios inconvenientes, entre ellos:
liberación de burbujas en el cabezal de la bomba, el caudal es irregular, y se
producen variaciones en la línea de base y en los tiempos de retención.
formación de burbujas en la celda del detector, en este caso, se producen
oscilaciones en la línea de base y aparición de picos espurios por descompresión.
pérdida de sensibilidad en los detectores de fluorescencia, el oxígeno
molecular contribuye al decaimiento de la eficiencia fluorescente de una molécula.
alta corriente residual en “detectores electroquímicos”, trabajando en forma
reductiva, el oxígeno disuelto consume parte del potencial.
oxidación de analitos, la presencia del oxígeno puede oxidar ciertos analitos
durante la corrida cromatográfica.
aumento en la línea de base de los detectores UV, la presencia de oxígeno en
la fase móvil puede producir un aumento de la línea de base en los detectores UV.
Absorbancia del metanol, a

distintas longitudes de onda,
saturado con los diferentes gases.
12
Métodos de desgasificación
La cantidad de gas disuelto en un líquido depende de tres

factores: Temperatura (Si el proceso de disolución es
exotérmico, a ↑ T < solubil.; si es endotérmico a ↑ T > solubil.),
Presión (solubil. ∝ Pa) y la Afinidad.
• Reflujo. Consiste en el calentamiento o la ebullición a reflujo

de la fase móvil con la ayuda de agitación durante unos 15
minutos.
• Burbujeo de un gas inerte. Se puede realizar en forma

continua o por cortos períodos de tiempo. Se realiza a través
de una pieza de acero inoxidable sinterizado ("buzo'') con
diámetro de poro de 2 a 10 µm, ya un caudal de unos 80-100
mL/min.
• Ultrasonido. El ultrasonido es una onda electromagnética,

producida por la propagación de un choque mecánico
generado por un cristal piezoeléctrico. Genera ondas alternas
de compresión-descompresión, dando lugar a la formación e
implosión de micro-burbujas (cavitación).
• Vacío. Es el método más frecuente, si se prepara fase móvil"

para más de un día, debe filtrarse y desgasificarse a diario. Cavitación
12
Mantener constante L / dp mientras se reduce el

tamaño de partícula permite separaciones más
rápidas mientras se mantiene la integridad de la
separación
La relación L/dp es útil cuando se trata de determinar

qué material de empaquetado (tamaño de partícula)
y longitud de columna pueden ser necesarios para
una aplicación dada.
Cromatografía de Fase Ligada

El Material de Relleno
El material de relIeno de una columna de BPC está

constituido por partículas, definidas por una serie
de características:
• morfología
• tamaño
• porosidad
• estructura química
Morfología, el material empleado puede

adoptar básicamente dos formas, irregular o
esférica, con un tamaño comprendido entre los
2 y 60 µm de diámetro.
Las columnas analíticas modernas se rellenan

con partículas de entre 3 y 10 µm de diámetro.
12
Cromatografía de Fase Ligada;

el Material de Relleno
La porosidad de la partícula es la relación entre el volumen interno de los poros y el
volumen de la partícula. Básicamente, se habla de microporos cuando su diámetro es menor
que 20 A, mesoporos cuando su diámetro está comprendido entre 20 y 500 A y
macroporos cuando es mayor que 500A.
12

La porosidad es responsable de los fenómenos de
Gráfico de Van Deemter
exclusión y de la velocidad de transferencia de
masa de soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria
(término "C" de la ecuación de Van Deemter:
H = A.u + B/u + C.u.
12

El área superficial, parámetro que determina la capacidad de retención de la fase
estacionaria, está compuesta por el área externa (superficial) de la partícula, con sus
depresiones y prominencias, y por el área de las paredes internas de los poros.
donde (p) es la densidad del sólido

(aproximadamente 2 g/mL) y dp el diámetro de
la partícula (Unger).
Cuanto menor sea el tamaño de partícula, el

área superficial se hace más grande,
Una partícula de 10 µm tiene as de 0.3 m2/g.
relativamente. Además cuanto mayor sea el
número de poros, mayor será el área
superficial.
Solo las moléculas que penetran en los poros

Pd diámetro de partícula participarán de los procesos separativos.
12
Tipos de geles envasados
El gel de sílice o silicagel empleado para cromatografía

de adsorción es un sólido amorfo y poroso, de gran área
superficial (30 a más de 500 m2/g), alto volumen de
poro (0.4 - 1.2 m1/g) y un diámetro de poro uniforme
y comprendido entre 60 y 300 A
Puente de
hidrogeno
Hidroxilo
libre
partículas
poros
siloxanol
vecinal
Químicamente, puede definirse como un óxido

de silicio hidratado, de tipo (Si02.H20)n, en el unión
siloxano
cual sus átomos metálicos internos están ligados
entre sí por átomos de oxígeno (puentes
siloxano Si-a-Si) y los superficiales a grupos
siloxanol
hidroxilo, constituyendo los grupos silanoles (Si- geminal
OH). Estos silanoles pueden ser de tipo "libre",
"vecinal" o "geminal" y son los responsables
de la actividad superficial.
12
Gel de polímero, en principio en HPLC, casi

siempre se utiliza geles de sílice. Sin embargo,
columnas a base de polímeros se están haciendo
populares. Las columnas utilizan varios tipos de
polímeros como, Poliestileno (copolímero de
estireno-divinilbenceno) (2) polimetacrilato (3)
Polihidroximetacrilato (4) alcohol polivinílico
Otros gel, aparte de sílice y geles de polímeros,

los geles utilizados incluyen sustancias naturales
tales como celulosa, agarosa, dextrina, y
quitosano, y miembros de cerámica tales como
hidroxiapatita y zirconia. Sin embargo, el uso es
muy limitado.

Preparación de la fase ligada (BP)
La mayor parte del material disponible comercialmente
está formado por silicagel a la cual se ha unido un grupo
funcional por unión covalente de tipo siloxano
(Partícula-Si-O-R).
Tipos de reacciones
Tipo éster (Si-OR); por la baja estabilidad a la hidrólisis de la unión éster esta unión fracasó
en LC.
1. Partícula-SiOH + R-OH  Partícula-Si-OR + H2O
Tipo amino (Si-NR2); Preparada por reacción de la silicagel con cloruro de tionilo y el
producto de ésta reacción con una amina. Esta fase es más estable, pero sólo en el rango de
pH entre 5 y 7.
2. Partícula-SiOH + SOCl2  Partícula-Si-Cl
3. Partícula-Si-Cl + HNR2  Partícula-Si-NR2 + H2O
Tipo Carbono (Si-CR3); Este tipo de BP, no tuvo difusión en LC., el orden de reacción 2. y
seguida por una reacción con un Grignard (bromuro de naftil, bencil o alquil magnesio).
Siloxano (Si-O-SiR3); Es la de mayor difusión (prácticamente total en rellenos de base
sílica). Se sintetiza por reacción de los silanoles de la sílica con organo-n-halo-silanos
(clorosilanos), que pueden ser (a) monofuncionales, (b) bifuncionales y (c) trifuncionales.
12

Reacciones Siloxano (Si-O-SiR3)
Alquil clorosilano
12

Algunas de las rutas de síntesis de la fase ligada a silicagel, mostrando

la unión de un organo-monoclorosilano a un silano libre
12
En general, a mayor carga carbonada (CH2)n o

a mayor lipofilicidad del sustituyente,
corresponde mayor retención.
Bondapak CN
Bondapak Fenil
Bondapak C18
Retención en tres columnas para una mezcla de

(1) Fenilefrina, (2) Fenilpropanolamina, (3)
Nafazolina (4) Clorfeniramina
Tipos de relleno de fase ligada
IPC cromatografía por supresión iónica (pKa)

12
Cromatografía en fase reversa
Mecanismo de retención
Se ha sugerido que el modo de interacción entre el soluto y la fase ligada puede ser de tres
tipos, partición del soluto entre la fase móvil y una fase estacionaria líquida, adsorción
sobre una fase estacionaria sólida, o bien un proceso mixto partición-adsorción.
En RPLC,la fase estacionaria es no polar y la

fase móvil es muy polar (en general mezcla
de agua y un modificador orgánico, MeOH, AcN
o THF) las únicas fuerzas de interacción posibles
deberían ser las de Van der Waals y un aumento
de entropía.
La interacción entre moléculas de soluto y de

solvente es mucho más débil que la interacción de
las moléculas de solvente entre sí. Como
consecuencia, el soluto es expulsado de la fase
móvil y forzado a penetrar en la fase estacionaria,
que actúa como receptor pasivo
Efecto solvófobo, las flechas indican
las fuerzas que tienden a unir y las
fuerzas que tienden a separar
12

ε = 0,95
Triethanolamine
El soluto es expulsado de la fase móvil y forzado a

penetrar en la fase estacionaria, que actúa como
ε = 0,65 receptor pasivo.
La magnitud de la interacción soluto-BP, será mayor

cuanto mayor sea el tamaño del grupo apolar y
consecuentemente, la superficie de contacto. Por el
contrario, las funciones polares del soluto favorecerán
la interacción con los solventes polares y reducirán la
retención.
Cambio de la selectividad por

variación del modificador orgánico.
Columna LiChroCART 125-4 con LiChrospher RP18
12
Ordenar de acuerdo al orden de salida en la columna.
Columna LiChroCART 125-4 con LiChrospher RP18

MeOH – H2O (60-40)
12

Columna LiChroCART 125-4 con LiChrospher RP18 ACN – H2O (70-30)
MeOH – H2O (60-40)

Orden de salida de los compuestos
12

El mecanismo de separación en RP HPLC se
Columna LiChroCART 125-4 con LiChrospher RP18 basa en la distribución del soluto entre la fase
móvil y la estacionaria. La elución o el arrastre
del soluto mediante la fase móvil, se inicia con
un eluyente de elevada polaridad (fase A).
Para lograr la desorción secuencial de los
solutos unidos, se disminuye la polaridad de la
fase móvil. Esto se hace mediante la adición
gradual de solventes orgánicos a la fase móvil
A, como son el metanol o el acetonitrilo
(fase B), es la que presenta menor polaridad y
tiene el mayor poder de elución. La fuerza del
solvente está definida cuantitativamente por
el parámetro εo.
MeOH – H2O (60-40)

Orden de salida de los compuestos
Salen en el mismo orden pero
mas cerca los picos
12
Retención en función de la longitud de la cadena

hidrocarbonada de la BP. Fase móvil: MeOH-H20 (80:20). La
recta indica la longitud de cadena critica
La Cadena Hidrocarbonada, En RPLC, se observa que para igual carga de carbono, a

mayor longitud de cadena corresponde mayor retención y para igual longitud de cadena
alquílica, a mayor cobertura, mayor retención.
12
RP Regular, A mayor polaridad del soluto, mayor predilección de éste

por la fase móvil y menor tiempo de retención. Los solutos no polares
tendrán comportamiento inverso.
Control de la Ionización (Supresión Iónica), El término "control de la

ionización" se prefiere a "supresión iónica", lo que se busca es controlar
la separación, permitiendo (o impidiendo) la presencia de la forma no
disociada del analito (pH Vs pKa) .
Apareamiento Iónico, la fase móvil contiene un contraión a la del

Formas de
analito formando un complejo "neutro" que se transporta dentro de la
Cromatografía
columna. IPC permite la separación de solutos iónicos y no iónicos en un
en Fase Reversa
mismo cromatograma.
Complejación con Iones Metálicos, La unión entre un metal (Ag,Cu,

Cd, Ni, Zn) y el doble enlace (olefinas o isómeros geométricos) se
produce por transferencia electrónica, entre el compuesto orgánico que
actúa como donante y el metal, que funciona como aceptor de electrones.
RP en Medio No Acuoso, la RP empleada con fase móvil de baja

polaridad, sin agua agregada, tiene muchas veces la suficiente
selectividad y poder de retención para permitir su resolución..
12
Control de la Ionización (Supresión Iónica) Apareamiento Iónico
Complejación con Iones Metálicos RP en Medio No Acuoso
12

Aplicaciones
La cromatografía líquida en fase reversa es, como se ha indicado, la modalidad de mayor
empleo en HPLC.
12
Cromatografía Intercambio Iónico

En la cromatografía de intercambio iónico (lEC), la
fase estacionaria contiene grupos funcionales iónicos
y retiene el soluto, de características iónicas pero de
signo opuesto, intercambiándolo por un proceso
reversible con iones de la fase móvil.
La retención se debe a dos procesos

independientes, en primer lugar, a una reacción
reversible entre el soluto y el grupo cargado de la
fase estacionaria (intercambio iónico) y en segundo
lugar, a una distribución del soluto entre la fase
móvil y la fase estacionaria, semejante a la que
ocurre en fase reversa.
Las especies ionizables, por su parte, corresponden a

los ácidos y bases débiles y sus sales, que coexisten
en su forma iónica y no iónica, en proporción
determinada por el pH del medio de disolución. "C", correspondiente a la distribución del
analito entre la fase móvil y la fase estacionaria
12
En el pH correspondiente al pKa, la forma iónica y

no iónica coexisten en igual proporción. Dos
unidades de pH por encima del pKa, el ácido
contendrá un 99 % de forma iónica y dos
unidades por debajo del pKa, sólo el 1 % de
la forma iónica. La mismo se cumple para una
base débil.
Asociado Disociado
99% 2 unidades 2 unidades 99%

Proporción de la forma iónica en función del
pH para un ácido débil de pKa 5.0
La primer variable a ajustar en la IEC de compuestos ionizables es el pKa/b. La segunda

variable está dada por la concentración del buffer y eventualmente una sal agregada. El
catión o anión de igual carga a la del soluto compite con éste para la ocupación de los sitios
activos de intercambio y la fuerza iónica modifica la posición de los equilibrios
12
Polímeros orgánicos, IEC describe varios tipos de polímeros, formados

por reacción de ácido acrílico o metacrílico con poliaminas o con
divinilbenceno, de epiclorhidrina con aminas, de formaldehido con
fenol o con m-feniléndiamina. El mas empleado es, el copolímero EDVB.
Intercambiadores de Fase Ligada, Constituido por un soporte,
silicagel, al cual se une un grupo ionogénico ácido o básico, fuerte o
débil. Se producen partículas muy pequeñas de hasta 3 µm de diámetro,
con un estrecho rango de distribución, áreas superficiales de más de
500 m2/g y diámetro de poro entre 60 y 250 Á. (grado de sustitución)
Intercambiadores
iónicos en IEC Oxidos Inorgánicos, Todos los óxidos y sales insolubles son
intercambiadores iónicos potenciales, sus propiedades anfotéricas están
dadas por su pH isoeléctrico (pH con carga neta cero). Por encima del
pI, el óxido tendrá carga negativa (intercambiador catiónico) y por
debajo de ese pH tendrá carga positiva (intercambiador aniónico), se
han empleado para la separación de iones en HPLC.
Intercambiadores Peliculares, estos materiales están compuestos

por una fina capa de material de intercambio que recubre un core inerte,
generalmente de vidrio o micropartículas de sílica. El empleo actual de
materiales peliculares está muy limitado, a la confección de guarda
columnas.
12

Polímeros orgánicos EDVB
La principal ventaja de los polímeros

orgánicos respecto de los de fase ligada
reside en su amplio rango de pH de
trabajo, entre 1 y 13. La principal
desventaja, se debe los fenómenos de
hinchamiento-compactación.
12

Materiales de relleno
SAX
WAX
SCX
WCX
strong o weak anion o cation exchanger

12

La fase móvil Variables en Cromatografía de Intercambio iónico
La fase móvil en IEC es una solución

acuosa de pH y fuerza iónica controlados
por un buffer y puede contener
cantidades moderadas (30%) de un
modificador orgánico.
Un aumento de la temperatura reduce la

viscosidad de la fase móvil, lo que resulta
en un aumento de la eficiencia. Sin
embargo, debe manejarse con cuidado
con rellenos de base sílica ya que su
solubilidad aumenta a altas temperaturas,
especialmente por efecto del pH y la
fuerza iónica.
Detector de Conductividad.
Detector Espectrofotométrico (nitrito,
nitrato, ioduro, iodato, bromuro)
Detector Electroquímico
12
Cromatografía Quiral
La cromatografía quiral se puede dar de diferentes maneras, sin embargo las mas comunes
son por complejos de inclusión o por afinidad especifica.
Complejos de Inclusión o Fases de Cavidad

Cromatografía Quiral
Afinidad Especifica o Intercambio de Ligandos
Se utiliza una fase móvil que contenga un metal como por ejemplo Cu2+, para inmovilizar
dicho metal y generar la interacción especifica que genera la separación de dos especies
isómeras.
L-Prolina
Eluent : 8mM CuSO4 aq. Flow Sample : DL-Aspartic acid 0.02%, 50μL
rate : 1.0mL/min Detector :
UV(230nm) Column temp. : 1. D-Aspartic acid
50°C 2. L-Aspartic acid
Cromatografía de Exclusión
Molecular
Entre los métodos clásicos de cromatografía líquida:
adsorción, partición, fase reversa, intercambio iónico
y exclusión, la cromatografía de exclusión molecular
(SEC por size exclusion chromatography) fue el
último en ser desarrollado.
Según la naturaleza de los compuestos que se han de

separar por SEC, esta metodología se clasifica en
cromatografía de filtración por gel (GFC por gel
filtration chromatography) empleado en proteínas,
péptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono o de
permeación por gel (GPC por gel permeation
chromatography) empleado en polímeros sintéticos y
elastómeros; cauchos, plásticos, resinas.
Si bien la aplicación de la SEC al análisis de

compuestos de bajo peso molecular no se
encuentra demasiado difundida, es útil para la
separación de compuestos siempre que los mismos
tengan una diferencia de mínimo, 10% en sus pesos
moleculares
Molecular
Entre los métodos clásicos de cromatografía líquida:
adsorción, partición, fase reversa, intercambio iónico
y exclusión, la cromatografía de exclusión molecular
(SEC por size exclusion chromatography) fue el
último en ser desarrollado.
Según la naturaleza de los compuestos que se han de

separar por SEC, esta metodología se clasifica en
cromatografía de filtración por gel (GFC por gel
filtration chromatography) empleado en proteínas,
péptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono o de
permeación por gel (GPC por gel permeation
chromatography) empleado en polímeros sintéticos y
elastómeros; cauchos, plásticos, resinas.
Si bien la aplicación de la SEC al análisis de

compuestos de bajo peso molecular no se
encuentra demasiado difundida, es útil para la
separación de compuestos siempre que los mismos
tengan una diferencia de mínimo, 10% en sus pesos
moleculares
12
Molecular
Por su parte, Screenivasan y col, utilizaron esta
metodología para la separación de Aspirina de su
producto de hidrólisis, el ácido salicílico,
compuestos cuyos pesos moleculares difieren sólo
en 28.05 unidades.
La cromatografía de exclusión separara sustancias
en base a su tamaño efectivo en solución. Como
el tamaño efectivo de una molécula en solución y
su peso molecular son parámetros proporcionales
(en determinadas condiciones), esta modalidad
cromatográfica suele utilizarse tanto para la
determinación del peso molecular y como la
distribución de pesos moleculares.
12
Molecular
Ventajas de la SEC
Entre las ventajas de la SEC podemos enumerar las siguientes:
• Separación por dimensión molecular, válida no sólo para el análisis directo

sino como método preliminar de fraccionamiento de muestras
complejas, para su posterior estudio por otros métodos.
• Picos angostos. Como el volumen de elución es pequeño, no mayor del
volumen de exclusión, la dispersión es baja y la detectabilidad alta.
• Tiempos de separación cortos y predecibles, pues toda la muestra eluye
antes o en el volumen de exclusión.
• Elución predecible, en base a su peso (dimensión) molecular.
• No hay pérdida de muestra, ya que no existe interacción con la fase
estacionaria.
• No hay desactivación de la columna, pues en ella no se acumulan
impurezas por fenómenos químicos de retención aunque puede, por
supuesto, bloquearse mecánicamente con partículas si se inyectan
muestras sin filtrar o que precipiten en contacto con la fase móvil, o bien
sufrir disolución de lecho según la naturaleza de su matriz, tipo de solvente,
condiciones operativas, etc).
Se denomina al volumen del efluente que corresponde al pico de la curva trazada para determinar el perfil de elusión.
12
Desventajas de la SEC
La SEC no está, sin embargo, libre de algunas desventajas, entre ellas:
• Limitada capacidad de picos, típicamente no más de 10 o 12, ya que todos deben

eluir entre Vt y Vo.
• Incapacidad de resolver muestras de peso (dimensión) molecular similar.
• La resolución no puede manipularse. La elección de la fase móvil sólo tiene por

objeto evitar la interacción muestra-fase estacionaria y no existe la
"selectividad" disponible en otros métodos como variable de ajuste. El único
modo de aumentar la resolución es el aumento de la longitud de la columna (o
acople de varias columnas).
• El efecto de la temperatura debe tomarse con cuidado, ya que influye sin duda
sobre la dimensión de la molécula.
Volumen de permeación total Vt

Volumen ínter-partículas Vo
Molecular
El volumen de retención de un compuesto determinado
(VR) está dado por la suma del volumen entre las
partículas, y el volumen de los poros accesible a un
tamaño molecular determinado.
Volumen íntra-partícula Vi, volumen

Kd disponible en los poros
Volumen ínter-partículas vo, volumen
volumen de retención disponible, fuera de las partículas.
de un compuesto (VR) Coeficiente de distribución del
soluto en el gel Kd,
Volumen de permeación total Vt
Si Kd = O, VR = Vo Comprende a las moléculas cuyo

tamaño es mayor al de los poros del gel.
Si Kd = 1, VR = Vo + Vi Comprende a las moléculas que
eluyen en la zona de permeación total.
Si O < Kd < 1, las sustancias se separan selectivamente
en la columna cromatográfica.
12
Molecular
Geles Blandos, los dextranos son geles blandos que tienen muy baja
resistencia mecánica y se emplean en columnas largas a muy bajas
presiones y con caudales moderados, existen otros materiales como
poliacrilamida, polisacáridos y agarosas, no pueden utilizarse en HPLC
porque el caudal y la alta presión generada. Sephadex LH20 Y G25
Geles Semirrígidos, geles del tipo semirrígido denominados también

La Fase macroporosos, están constituidos por polímeros con un elevado grado de
Estacionaria entrecruzamiento, son estables mecánicamente y poseen poros
permanentes, a temperaturas elevadas pierden su resistencia mecánica.
Geles Rígidos, Los materiales de relleno rígidos son materiales

inorgánicos, típicamente vidrios porosos y sílica porosa que se asemejan
más a vidrios que a geles. Estos materiales son estables a altas
temperaturas, poseen una distribución de poros estrecha y bien definida y
sus permeabilidades son independientes de la presión.
12
Molecular
12
Molecular
12
Molecular
Las columnas clásicas de SEC tienen

habitualmente 25 a 30 cm de longitud,
0,4 hasta 0.8 cm de diámetro interno, y
se rellenan con partículas de 4 a 10 µm
de diámetro.
La eficiencia de las columnas se mide en

función del número de platos teóricos, Una
columna de 10 µm de tamaño de partícula
tiene una eficiencia mayor a 20.000
platos/m, mientras que una columna rellena
con un gel blando, con un tamaño de
partícula de 50 µm tiene una eficiencia de
1500 platos/m. (UPLC 110000platos/m)
12
Molecular
La fase móvil
En SEC la resolución no depende de la
naturaleza de la fase móvil sino de la
eficiencia de la columna y de la pendiente
de la curva de calibración.
La fase móvil no es un simple vehículo inerte

de los solutos disueltos sino que debe cumplir
ciertos requisitos: debe ser un "buen"
solvente para el polímero, tener capacidad de
hinchar al gel, no presentar soluciones de
polímero demasiado viscosas y evitar los
fenómenos de retención secundaria.
Las columnas de GFC presentan mayores

problemas de adsorción de solutos al material
de relleno. La sílice contiene grupos silanol, de
naturaleza acídica, que pueden actuar como
intercambiadores de cationes. La
poliacrilamida y los dextranos por su parte
presentan una pequeña cantidad de grupos
carboxilo que pueden actuar de la misma
forma.
12
Molecular
Cromatografía de Permeación por Geles
La cromatografía de permeación por geles (GPC)

se utiliza para el análisis de polímeros
sintéticos y elastómeros y tiene su origen en el
año 1964, se diferencia de la cromatografía de
filtración por geles (GFC) sólo en el tipo de
sustancias analizadas y en el vehículo
empleado como fase móvil. En GPC la fase móvil
por excelencia es el tetrahidrofurano debido a que
resulta ser un buen disolvente de la mayoría de
los plásticos. Existen algunos polímeros de alto
peso molecular, poliolefinas (polietileno) y
poliamidas (nylon), que no se disuelven a
temperatura ambiente, pero lo hacen a mayor
temperatura (100 – 150oC).
Análisis GPC de un copollmero de óxido2,6

polidimetilfenileno y poliestireno. Columna:
PLGel 5 µm, 108 Å, y 104 Å, Fase móvil: THF, Caudal: 1
ml/min, Temp:40 oC, Detector: UV 254 nm.
12
Molecular
El volumen de inyección debe mantenerse
dentro de ciertos límites para evitar el
ensanchamiento de banda y la concentración de
analito debe mantenerse baja para operar en la
zona lineal de la isoterma de distribución
Los copolímeros fueron identificados con los códigos

IxCyn, IxSyCzn y SxIyCzn donde los subíndices indican la
proporción en peso de cada uno de los comonómeros en
el bloque (determinada por 1H-RMN) y el superíndice, el
peso molecular promedio en número en kg/mol de todo
el copolímero (determinado por GPC ).
12
Molecular
Cromatografía de Filtración por Geles
La cromatografía de filtración molecular (GFC), es

una modalidad de la SEC que se ocupa de la
separación de polímeros biológicos solubles en
agua o en solventes polares (IR, UV).
Las columnas de GPC empleadas para el análisis de

polímeros sintéticos no resisten los solventes
polares por lo cual no pueden utilizarse como
material de relleno para las columnas de la GFC; los
materiales rígidos como la sílica poseen grupos
silanol que causan adsorciones indeseadas y
desnaturalizan los biopolímeros 50mM Sodium phosphate buffer(pH7.0)
+ 0.3M NaCl, 1.0mL/min, UV(220nm
La detección de péptidos y proteínas se efectúa a

210 nm (absorción de la unión peptídica) o a 280
nm (absorción de los grupos fenilalanina y triptofano
presentes en la molécula). Se recomienda una fase
móvil conteniendo un buffer de fosfatos pH 7.4 0.15
M, cloruro de sodio 1 M y 1 % de dodecilsulfato de
sodio.
12
Molecular
Cálculo del Peso Molecular
Peso Molecular y Distribución de Pesos Moleculares
Un polímero está formado por unidades que se
repiten en cadenas. La variabilidad en la longitud
Un polímero tiene un único
valor de Mn, Mw o Mz, pero
de la cadena de un polímero se genera en el
Mv varía con el solvente y la
temperatura.
proceso de producción, debido a variables
termodinámicas y cinéticas. En este caso no es
posible definir un peso molecular único y debe
Mn es sensible a indicarse el peso molecular promedio y la
cambios en los pesos
moleculares bajos distribución de pesos moleculares.
La cromatografía de exclusión molecular es capaz

de evaluar esa distribución y de determinar el
peso molecular medio numérico (Mn), el peso
molecular medio ponderal (Mw), el peso
molecular medio de centrifugación (Mz) y la
dispersidad o polidispersidad (D).
• Mn, resulta de tomar el peso total de la muestra y dividirla por el número de moléculas contenida en ella.
• Mw, resulta de sumar las fracciones en peso de cada especie y multiplicarla por el peso molecular de la fracción.
• Mz, es sensible a las fracciones más pesadas de todas y puede obtenerse por GPC o por centrifugación.
• Mv, se refiere a la viscosidad del polímero.
• D, la dispersidad de un polímero es el cociente entre Mw y Mn, se relaciona con la desviación estándar de la
distribución.
12
Molecular
Curvas de Calibración
Calibración Simple
Para determinar el peso molecular de una
macromolécula (por ejemplo una proteína o un
polímero de baja dispersión) basta con
correlacionar el volumen de elución del máximo del
pico de la sustancia desconocida con una curva de
calibración construida con polímeros estándar de
baja dispersidad y pesos moleculares conocidos.
El peso molecular se determina por comparación del

volumen ( o tiempo) de elución de las fracciones con
los correspondientes a la curva de calibración.
12
Molecular
Comparación de la eficacia de separación de dos columnas. Tres

componentes debían ser separados. Cada columna proporciona la curva de
calibración. La columna que tiene menor pendiente proporciona una mejor
separación entre los tres componentes.
12
Molecular
Calibración Universal
Grubisic y cops propusieron que el volumen hidrodinámico Vb de un polímero se relaciona

con su viscosidad intrínseca en la “fase móvil” de HPLC, y que éste puede utilizarse para
generar una curva de calibración universal para todos los polímeros.
En general, se ha encontrado que esta calibración es útil para la mayor parte de los
polímeros, excepto para el caso de electrolitos o materiales excesivamente ramificados,
siempre que se pueda precisar con exactitud los valores de las constantes de Mark -Houwink -
Skurada, lo cual no siempre es posible en la práctica.
Otros métodos
Existen otras modalidades para calcular el peso molecular de un polímero, algunos muy
simples como los que multiplican el peso molecular referido al poliestireno por un factor Q
para el cálculo del peso molecular real, y otros muy complejos como los que involucran la
calibración con estándares polidispersos. El método del factor Q es sencillo y resulta
bastante exacto para el análisis de poliolefinas utilizando poliestireno como estándar.
12
Selección de
columnas
Las diferentes compañías que

suministran las columnas tiene en
sus catálogos una guia para la
mejor elección de la columna que
Yo voy a requerir.
12
Cromatografía; Preparación de
las muestras
La preparación de las muestras es una etapa decisiva en todo método de análisis en especial
en la determinación de microcomponentes (trazas) y en los casos donde la muestra que rodea
al analito es muy compleja, depende de muchos factores como ser
• Propiedades físicas y químicas del analito, el conocimiento de algunas de las

características fisicoquímicas del analito es esencial en el diseño de un método para
la preparación de las muestras. Es conveniente conocer su estructura química,
peso molecular, solubilidad, propiedades ácido base (pKa) y respuesta frente
al tipo de detector seleccionado.
• Concentración de analito en la muestra, este factor tiene importancia decisiva.

Para analitos en altas concentraciones en general se requieren preparaciones de
muestras sencillas como la solubilización y filtración. Analitos en bajas
concentraciones, por su parte, pueden requerir metodologías más elaboradas que
involucren numerosas operaciones para lograr una solución cuya concentración sea
"aceptable“.
• Naturaleza de la matriz de la muestra, La remoción de los componentes de

la matriz puede ser un paso crítico en los casos donde la concentración de analito en
la muestra se detecta con dificultad o no se detecta.
12
las muestras
• Forma en la que se presenta el analito en la muestra, en muestras de origen

biológico el analito puede no encontrarse como tal sino unido a proteínas
transportadoras (análisis de fármacos en suero o plasma), metabolizado como éster,
amida o éter de los ácidos sulfúrico o glucurónico (análisis de diversas sustancias en
orina) o metabolizado a otra sustancia diferente.
• Compatibilidad de los medios de solubilización, Se requiere que la solución a

inyectar sea compatible y miscible con la fase móvil. Es recomendable que el
solvente de la muestra sea la misma fase móvil o, en su defecto, un solvente débil.
Si se disuelve en un solvente fuerte, algunas sustancias pueden precipitar con las
fases móviles acuosas, dar picos anchos. La clasificación de solventes “suaves” o
“fuertes” para referirse a su poder disolvente sólo tiene sentido en función del
material que se desea remover.
• Tipo de detector y compatibilidad, La sensibilidad y selectividad del detector

tienen un rol muy importante en el diseño de los métodos para la preparación de las
muestras. En la selección de un medio para la solubilización del analito debe
considerarse su compatibilidad con el detector a utilizar.
12
las muestras
Tratamiento Previo, tanto para el tratamiento previo como para posteriores pasos de
purificación pueden utilizarse las operaciones de la química analítica como: liofilización,
evaporación, filtración, centrifugación, precipitación, y solubilización.
Desproteinización, las proteínas en las matrices biológicas deben eliminarse antes de

inyectar la muestra en el HPLC para evitar que precipiten dentro del cromatógrafo. Se
realiza con la adición de varios agentes, entre ellos: solventes orgánicos (acetona,
metanol, acetonitrilo), sales, ácidos o cationes (túngstico, tricloroacético, perclorico,
convencionales
metafosforico; Hg2+, Cd2+, Fe3+, Cu2+y Zn2+), o bien por ultrafiltración.

Metodologías
Extracción líquido-sólido, también denominada lixiviación, comprende la

solubilización del analito presente en una muestra sólida previamente molida con un
solvente adecuado (Soxhlet y SFE).
Extracción líquido-líquido, es la distribución (partición) de un analito entre dos

líquidos inmiscibles. Las sustancias neutras de características no polares pueden
extraerse desde sistemas acuosos a orgánicos directamente. Las sustancias con
características ioniza bies requieren la supresión de su disociación modificando el valor
del pH del medio.
Filtración, tanto las muestras como los estándares a inyectar deben estar totalmente
libres de partículas en suspensión. Las partículas presentes en las muestras pueden
rayar los sellos del inyector, o bloquear algún componente del equipo cromatográfico
especialmente tuberías o filtros de columnas o guardacolumnas.
12
las muestras
Extracción en Fase Sólida
La extracción en fase sólida se lleva a cabo en pequeñas

columnas o cartuchos de plástico (usualmente
polipropileno). Estas columnas se rellenan con cantidades
variables (desde 100 hasta 500 mg) de distintos materiales.
El relleno de las columnas es de mayor granulometría

(típicamente de 40 µm) y con una pequeña distribución de
tamaños de partícula. Los materiales para el relleno
comprenden desde adsorbentes polares como la sílica, hasta
poco polares como la sílica unida a los grupos C18, también
por materiales de intercambio iónico y las resinas Amberlite
XAD-2, XAD-4, y XAD-7, el DVB y el Porapaq.
Columnas para
concentrar compuestos
a nivel de trazas
12
las muestras
Derivatización
La derivatización se refiere a la reacción
química que se produce entre el analito y un
reactivo determinado ya sea dentro o fuera del
equipo cromatográfico. Si se efectúa antes de
inyectar la muestra, la derivatización se
denomina precolumna y los derivados se
separan en la columna cromatográfica. También
puede realizarse después de inyectar la
muestra, en cuyo caso se denomina post-
columna.
Mejorar la detección, Esta es la causa por la que se producen derivatizaciones químicas en

HPLC, muchos compuestos que no poseen grupos cromóforos o fluoróforos y no pueden ser
detectados.
12
Mejorar la selectividad, En este caso la derivatización se utiliza para separar compuestos

que, de otra manera, o bien no se pueden separar o bien la separación resulta muy compleja.
La derivatización para mejorar la selectividad es muy rara en HPLC (combinación de fases
estacionaria y móvil), un caso especial se refiere a la separación de isómeros ópticos.
Derivatización de ácidos grasos Derivatización de amino ácidos

las muestras
Reactores
Para definir un método de análisis por derivatización post-columna de las muestras se debe
conocer el tiempo para completar la reacción. En general no es necesario que la reacción
alcance su punto máximo, y puede operarse sin dificultad con reacciones incompletas.
Mezcladores
Los mezcladores, como su nombre lo indica, tienen la función de mezclar el eluyente de la

columna cromatográfica con el reactivo para la derivatización. Para efectuar la mezcla suele
utilizarse una pieza en T.
12
Cromatografía; Bases de la
Separación
Cuando la muestra y la fase móvil son forzados a

atravesar la fase estacionaria, entran en juego
distintos tipos de interacción entre cada uno de
estos componentes. Interacciones hidrofóbicas,
puentes de hidrógeno, interacciones dipolares y
electrostáticas, son las responsables de la mayor
o menor afinidad de cada uno de los
componentes de la muestra por la fase móvil o la
fase estacionaria.
12
Separación
El cromatograma comienza en el momento en que la solución en ensayo es inyectada. A
partir de ese punto, las señales encontradas en el cromatograma pueden clasificarse como:
Volumen de elución (Ve) es el volumen de

fase móvil eluida entre la inyección y la elución
de la concentración máxima del soluto.
Volumen muerto (Vo) es el volumen total de

solvente entre el punto de inyección y el de
detección, exceptuando el correspondiente a
las partículas de fase estacionaria (soluto que
no se retenga en la fase estacionaria).
Línea de base: es la porción del

cromatograma donde sólo se aprecia la elución
de la fase móvil, sin señal debida al soluto.
vo
Tiempo de retención (tr) es el tiempo ve
Línea de base vb vc vd
medido entre la inyección y la elución de la te
tb tc td
concentración máxima del sol uta enésimo
(máxima señal). La distancia entre este to
máximo de la señal y la línea de base es la

altura del pico (hn) en cuestión.
Vr = tr(min) F(mL.min-1)
12
Separación
Velocidad lineal (u): es la velocidad a la cual la
fase móvil se desplaza a través de la columna no
es sólo función del caudal sino también de la
sección interna de la misma.
Coeficiente de partición o distribución

(K) Relaciona la concentración de soluto en la
fase estacionaria o móvil.
Factor de retención (K´) mide la relación

línea de base entre el tiempo que las moléculas del analito
están en la fase estacionaria y el que están
en la fase móvil.
Anchura del pico
12
El valor de k' puede ajustarse modificando

la fuerza de elución de la fase móvil;
• en fase reversa, k' disminuye al
aumentar la proporción del componente
orgánico (MeOH, AcN, THF) y aumenta al
aumentar la proporción de agua.
• en fase normal, k' disminuye al
aumentar la proporción de solvente polar
y aumenta al aumentar la proporción del
no polar.
• en cromatografía de intercambio iónico,
k' disminuye al aumentar la concentración
del contraión (buffer o sal agregada), o la
proporción de solvente orgánico. La
variación del pH de la fase móvil puede
aumentar o disminuir k' de acuerdo a las
características ácido-base del analito.
Separación
Constante de
Distribución
Factor de separación (α): es el cociente entre
los factores de capacidad (k') de un par de picos.
Si no existe separación, α es igual a la unidad y
su valor aumenta cuando aumenta la separación.
La selectividad es una manera de medir la Factor de
eficiencia de una separación cromatográfica. capacidad
Modificación del componente "activo" de la fase móvil (en fase reversa, MeOH por AcN o
THF; en fase normal, cloroformo por cloruro de metileno o metil terc butil éter), modificación
del pH de la fase móvil, empleo de aditivos (reactivos de apareamiento, complejantes, etc) y
cambio de la fase estacionaria.
• α > 2 se tiene una mala separación, son necesarios periodos largos

para realizarla.
• Si 1< α <2 se obtiene una buena separación cromatográfica.
Resolución (R). Como se ha dicho, el objetivo

primario de la cromatografía es la separación de
los constituyentes de una muestra.
12
Separación
12
Separación
Ancho de pico (w) Esta medición se puede
efectuar con varios objetivos: para calcular la
eficiencia de la columna (platos teóricos), la
resolución, para el cálculo manual del área de
picos y en algunos integradores electrónicos se
ingresa como dato de ajuste de integración. línea de base
Platos Teóricos (N) El concepto de plato teórico

fue desarrollado en 1941 por Martín y Synge para
la cromatografía de partición líquido-líquido Anchura del pico
(LLC). Para explicar el fenómeno separativo
H, cada corte se llamó "plato" y su

espesor "altura equivalente del plato
teórico" (HEPT)
L es el largo de la columna.
(Rs)1 = √N1
(Rs)2 √N2
12
Separación
Calcular a) el factor de capacidad o de retención k’, b) la resolución Rs, de los siguientes
analitos en un sistema cromatográfico por HPLC, con los datos que figuran en la siguiente
tabla: (to= 1.12 min), la longitud de la columna es de 15 cm, c) Indicar si los picos
cromatográficos de los componentes de la muestra están bien resueltos, d) calcular el
número de platos teóricos efectivos y la altura del plato, e) dibujar el cromatograma.
Analito tr, min w, s

Tiempo retencion Ancho pico 2 1
propoxur 1.72 29 - 0,48 (ω

2 2+ω
1 1)
carbaryl 5.52 39 - 0,65

1-naftol 7.34 30 - 0,50
methiocarb 7.70 65 - 1,08 N=L/H H=L/N
12
Separación
Comparar velocidad de migración
K’= (1,72-1,12)/1,12= 0,536
K’= (5,52-1,12)/1,12= 3,923
K’= (7,34-1,12)/1,12= 5,553
K’= (7,70-1,12)/1,12= 5,875
Separación entre las bandas
Rs= (5,52-1,72)/((1/2)*(0,48+0,65)) = 6,72
Rs= (7,34-5,52)/((1/2)*(0,50+0,65)) = 3,16
Rs= (7,70-7,34)/((1/2)*(1,08+0,50)) = 0,46
Eficiencia
N = 16*(1,72/0,48)2= 205,4
N = 16*(5,52/0,65)2= 1153,9
N = 16*(7,34/0,50)2= 3448,0
N = 16*(7,70/1,08)2= 813,3
N = (205,4+1153,9+3448+813,3)/4 = 1405,15 Selectividad de la columna
α = 3,923/0,536 = 7,32
Altura del plato teórico α = 5,553/3,923 = 1,41
H = 15/1405,15 = 0,0106cm α = 5,875/5,553 = 1,05
12
Separación
La sustancia A y B tiene tiempos de retención de 16,40 y de 17,63 minutos en una columna
de 30 cm. Una especie que no es retenida pasa en 1.30 min. El ancho de los picos en la
base es de 66,6 y 72.6 seg, respectivamente. calcule a) el factor de capacidad o de
retención k’, b) la resolución Rs, de los siguientes analitos en un sistema cromatográfico
por HPLC, c) Indicar si los picos cromatográficos de los componentes de la muestra están
bien resueltos, d) calcular el número de platos teóricos efectivos y la altura del plato, e)
dibujar el cromatograma y la longitud necesaria de la columna para que se resuelvan bien.
12
Separación
Asimetría (As) La asimetría es una de las
formas más comunes de alejamiento de la curva
gaussiana y su medición es importante puesto
que puede llevar, de acuerdo a su magnitud, a
errores considerables de cuantificación.
f f´
Picos con Cola, se dice que un pico tiene cola cuando

muestra una asimetría mayor de 1.2, La principal
causa es la coincidencia de más de un mecanismo de
retención. En las separaciones por Fase Reversa, el
principal modo de retención de los analitos es a
través de interacciones hidrofóbicas no-
específicas con la fase estacionaria. Sin embargo,
también son frecuentes las interacciones polares
con grupos de silanoles residuales existentes en el
soporte de sílice (grupos amino). Cambio de pH,
forma protonada
12
Separación
Uso de Columnas “End-capping” es el nombre que se da al proceso químico por el cual los
grupos silanoles residuales de la fase estacionaria se transforman en otros grupos funcionales
sustancialmente menos polares en su superficie.
Mezcla de cinco
fármacos básicos fase móvil a pH 7.0, en estas fase móvil a pH 3.0 en estas
condiciones As 2.35 condiciones As se redujo a 1.33
consiste en
Fenilpropanolamina,
Efedrina,
Anfetamina,
Metanfetamina y
Fenteramina (Picos
1−5)
La disminución del pH de la fase móvil reduce la interacción de los analitos básicos con los
grupos silanol residuales eliminando de esta forma la cola excesiva de los picos.
12
Separación
Picos con frente, si todos los picos muestran
frente debe considerarse la posibilidad de una
sobrecarga de la columna por exceso de muestra.
Si se ha inyectado un volumen grande de muestra, y el

solvente de la muestra y la fase móvil no están
homogenizados, pueden producirse dos equilibrios
de distribución, provocando una partición diferencial
en la columna.
Un único pico que muestre frente puede deberse a un

pequeño pico que eluye justo antes del pico
cromatográfico de interés. Esta posibilidad es la
principal razón por la que un pico con frente nunca
debe ser ignorado, podemos confirmar la presencia
de un interferente cambiando la longitud de onda de
detección.
Ajuste la selectividad del sistema frente a

compuestos co-eluyentes variando la composición o el
tipo de la fase móvil, la temperatura, o la fase
estacionaria de la columna.
12
Separación
Procesos de Ensanchamiento de Banda
Este ensanchamiento de banda es normal y como depende de la

eficiencia (N) de la columna, los procesos que la gobiernan se
conocen como procesos de ensanchamiento de banda
intracolumnares.
Según Van Deemter, las contribuciones al ensanchamiento de banda dentro de una

columna cromatográfica son cuatro, a saber:
• Proceso multipaso (o de caminos múltiples), En una columna rellena con

partículas de la fase estacionaria, el soluto encontrará diversos caminos, los
cuales será impulsado a recorrer por la fase móvil.
• Difusión longitudinal, Si un soluto se deja en un líquido (la fase móvil), sus
moléculas se difundirán en todas direcciones hasta que su concentración
sea uniforme en todo el seno del líquido.
• Resistencia a la transferencia de masa en la fase móvil, a medida que el
soluto se desplaza a través de la columna hay una transferencia (FM-FE).
• Resistencia a la transferencia de masa en la fase estacionaria, Las
moléculas de soluto se retienen en la fase estacionaria y son luego
devueltas a la fase móvil en un tiempo finito.
12
Difusión Longitudinal
Difusión de Eddy
(u) velocidad lineal de la fase móvil

(Dm) coeficiente de difusión del
soluto en el solvente
(λ) constante.
(Hi) es la contribución del proceso multipaso a

la altura equivalente a un plato teórico.
(dp) diámetro de la partícula
(y) constante que depende del relleno y de la Resistencia a la transferencia
calidad de su empaquetamiento. de masa en la fase móvil
(fm) factor dependiente de k‘

(u) velocidad lineal de la fase móvil.
(dp) diámetro de la partícula
(Dm) coeficiente de difusión del soluto
en la fase móvil
(fs) factor de capacidad al espesor de
la fase estacionaria.
(df) la profundidad del poro.
(Ds) coeficiente de difusión del soluto. 12
Separación
Ecuación de Van Deemter
De la ecuación de Van Deemter pueden extraerse valiosas

conclusiones. Se deduce que la HEPT será menor, lo que
equivale a mayor N en las siguientes condiciones:
• Cuanto menor sea el diámetro de la partícula.
• Cuanto menor sea la viscosidad de la fase móvil (menor

coeficiente de difusión).
• A mayor temperatura
• Cuanto mejor sea el empaquetamiento del relleno, por la

menor distancia entre partículas de fase estacionaria.
• Cuanto menor sea el espesor de la capa de fase estacionaria

fija al soporte de relleno (se emplea solamente en LLC, no
reviste actualmente mucha importancia).
12
Cromatografía; Desarrollo de
Métodos
Diagrama de flujo los pasos a seguir en un desarrollo sistemático
de métodos en HPLC
El desarrollo de un método se encara tratando de fijar pautas generales que podrán (y

Objetivos
deberán, cuando sea necesario) ser modificadas y adaptadas al caso particular empleando
¿Se requiere identificación, screening o
herramientas fundamentales para todo analista: lógica cuantificación?
y sentido común.
¿Cuál es el nivel presente (macro o
• El primer paso debería consistir en una investigación bibliográfica.
microcomponentes)?
• ¿Cuál es la precisión
Consulta en una base de datos-adecuada, dirigida al analito requerida?
específico oa
compuestos químicamente relacionados que puedan aportar informacióndesean
¿Cuántos componentes se útil
valorar?
• El desarrollo es costoso e insume mucho tiempo, es preferible emplear caminos
¿Cuántas muestras se desea procesar?
sistemáticos, efectuando los ensayos en una dirección segura o al menos con buenas
probabilidades de éxito.
Informacion
Identidad de componentes de interés.
Rango de pesos moleculares de los
componentes de interés.
Estructura química, pKa, solubilidad,
espectros VV.
12
Ajuste de los parámetros

cromatográficos
Una vez que se ha probado

exitosamente un sistema (columna-
solvente-parámetros instrumentales)
de acuerdo a lo indicado, estaremos en
presencia de un método preliminar.
Este método preliminar debe

optimizarse para mejorar al máximo la
separación cromatográfica, α, N, Rs, H.
Cromatografía; Resolución de
Problemas
Anormalidades en la forma de los picos
12
Cromatografía; Resolución de
Problemas
12
12
12

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Formas de cromatografía líquida

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