FASE 3.

DISCUSIÓN

401542- CROMATOGRAFÍA

JESUS ALBERTO BECERRA VERA

Cód.: 1065891491

Mg. MARCELA ANDREA ZAMBRANO

TUTORA

GRUPO_6

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS, TECNOLOGÍA E INGENIERIA

Mayo de 2019
Pasó 4. De la lectura realizada en el paso anterior, de manera individual
y en documento con normas APA, documente el resultado de hacer una
búsqueda de información relacionada a las técnicas cromatográficas
descritas en dicha lectura, en donde debe indicar:

a. ¿Qué es?

Cromatografía de fluidos supercríticos

(SFC) es una técnica que combina lo mejor de la cromatografía de gases (GC) y la
Cromatografía liquida de alta resolución HPLC. Específicamente, aplica para compuestos
no volátiles o térmicamente inestables que no pueden ser separados mediante GC, o
aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su detección en HPLC
trayendo consigo múltiples aplicaciones que lo hacen técnicamente apreciado para el
análisis químico.

b. ¿Cuál es su aplicación? Ejemplos.

La cromatografía de fluidos supercríticos se ha aplicado a la separación de un amplio
conjunto de sustancias, entre los que se cuentan productos naturales, fármacos, alimentos,
pesticidas y herbicidas, tensoactivos, polímeros, aditivos de polímeros, combustibles fósiles
y explosivos y propelentes.

c. Cuáles son las condiciones operativas?

Las presiones y las temperaturas son variables importantes para el análisis
Cromatográficos de fluidos supercríticos pero dentro de su funcionamiento encontramos
variables importantes:
El empleo de un horno termostático para poder controlar con precisión la temperatura de
la fase móvil
El uso de un restrictor, empleado para poder mantener por una parte la presión en el
interior de la columna y por otra parte permitir la bajada de la presión a la salida para que el
fluido supercrítico (SF en adelante) pase al estado gaseoso y pueda ser detectado
adecuadamente el analito.
Las variaciones de presión en cromatografía de fluidos supercríticos tienen un efecto
muy marcado sobre el factor retención o de capacidad, k’. Este efecto es una consecuencia
del incremento de la densidad de la fase móvil a medida que aumenta la presión. Tal
incremento de la densidad origina un aumento de la capacidad disolvente de la fase móvil,
lo cual acorta los tiempos de elución.

d. De los ejemplos citados ¿cuál es el fundamento para aplicar

esas técnicas?

La SFC es una herramienta de gran importancia en la separación y determinación de

compuestos para los que las cromatografías de gases o de líquidos no son adecuadas:
 Compuestos no volátiles o termolábiles, que descomponen térmicamente antes de
volatilizarse, por lo que la cromatografía de gases no se puede aplicar.
 Compuestos sin grupos funcionales que puedan ser detectados mediante técnicas
espectroscópicas o electroquímicas que se emplean en cromatografía de líquidos.
Los fluidos supercríticos son capaces de disolver moléculas grandes no volátiles y los
solutos disueltos en ellos se pueden recuperar con facilidad dejando que las disoluciones
se equilibren con la atmósfera a temperaturas relativamente bajas.

e. Descripción de la fase móvil y fase estacionaria.

Fases estacionarias. En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas
rellenas, aunque las primeras son las más empleadas. Las columnas abiertas son similares a
las columnas de sílice fundida con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos
enlazados y de enlaces cruzados.

Fases móviles: La fase móvil más utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente
par un conjunto de moléculas orgánicas no polares. Además, es una sustancia transparente
en el ultravioleta, es colora, no tóxica, fácilmente disponible y muy barata cuando se
compara con otras fases móviles cromatográficas.

f. ¿Cuáles son sus detectores?

 La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se pueden utilizar como en la

cromatografía de gases, detectores de ionización de llama. Este detector es de
respuesta universal a compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad.

 Los espectrómetros de masas también se pueden adaptar como detectores más

fácilmente para SFC que para HPLC.

 Otros detectores utilizados son de absorción en el ultravioleta y en el infrarrojo, de

emisión de fluorescencia, termoiónicos y fotométricos de llama.

g. Consideraciones generales.

En la bibliografía química se ha visto un aumento en la publicación de trabajos que

describen las propiedades y aplicaciones de los fluidos supercríticos, en particular dióxido
de carbono y agua supercrítica. Uno de los estímulos para este interés es la búsqueda de
disolventes verdes que sustituyan los compuestos orgánicos volátiles.
Un fluido supercrítico posee propiedades de disolvente que se parecen a las de un líquido,
pero también exhibe propiedades de transporte parecidas a las de un gas. De esta manera,
un fluido supercrítico no solo puede disolver solutos sino que también es miscible con los
gases ordinarios y puede penetrar en los poros de los sólidos. Los fluidos supercríticos
tienen una viscosidad más baja y un coeficiente de difusión más elevado que los líquidos.
La densidad de un fluido supercrítico aumenta al aumentar la presión y, al aumentar la
densidad, la solubilidad de un soluto en el fluido supercrítico aumenta de manera
espectacular. El hecho de que las propiedades puedan ajustarse variando la presión y la
temperatura tiene ventajas para la aplicación de estos fluidos como agentes de extracción.

a. ¿Qué es?
Cromatografía de electroforesis capilar

Es una técnica analítica de separación que se basa en la diferente velocidad de

desplazamiento que tienen las distintas proteínas en el seno de un medio líquido, contenido
en un tubo capilar, al someterlas a la acción de un campo eléctrico.

b. ¿Cuál es su aplicación? Ejemplos.

La Electroforesis tiene múltiples aplicaciones, se usa como técnica a la resolución de

proteínas y productos de biología molecular (análisis de pureza de oligonucleótidos, terapia
génica, secuenciado de DNA y análisis de productos de PCR y de química forense).

Se han encontrado múltiples aplicaciones dentro de las que destacamos su aplicación en la

industria cervecera en el cual se hace una determinación directa y simultánea de analitos
presentes en cerveza, además de múltiples aplicaciones Biológicas y Bioquímicas.

c. Cuáles son las condiciones operativas?

El montaje de una CE es muy sencillo. Consta de un generador de corriente eléctrica de alto

voltaje de hasta 30 KV conectado a dos electrodos de platino que se sumergen en dos
recipientes con tampón. Luego se encuentra el tubo capilar de sílice fundida, que tiene un
diámetro interno de 20 a 200 micrometros y una longitud también variable que suele oscilar
entre 50 y 100 centímetros. Los extremos del capilar se encuentran conectados con los
recipientes de tampón antes mencionados. Las señales son recogidas por un detector. Un
ordenador conectado al detector permite almacenar, interpretar y representar los datos.

d. De los ejemplos citados ¿cuál es el fundamento para aplicar

esas técnicas?

La CE permite la separación de numerosos compuestos orgánicos e inorgánicos con o sin

carga. Así:
Pequeñas moléculas o iones inorgánicos pueden ser separados por electroforesis capilar de
zona (CZE) en una sola fase libre.
Carbohidratos aromáticos, ácidos nucleicos, vitaminas, antibióticos y barbitúricos por
MECK.
Péptidos y proteínas como las enzimas por electroforesis capilar de zona (CZE).
Carbohidratos no aromáticos por CZE en una sola fase libre y también por MECK.
 e. Descripción de la fase móvil y fase estacionaria.

Fase estacionaria: en general esta fase es una capa de resina de sílice fundida que permite
atrapar los iones para que el sistema pueda detectarlos y posteriormente se puedan recoger
los datos con el sistema operativo.
Fase móvil: la fase móvil es el electrolito que lleva la sustancia de interés por el capilar
separando la sustancia dependiendo de su carga electrónica.

f. ¿Cuáles son sus detectores?

Una amplia variedad de detectores han sido desarrollados para la EC (incluyendo

fluorescencia, electroquímica y conductividad) pero los detectores más usados
comercialmente son los que emplean el ultravioleta y UV visible.

Las fuentes de luz generalmente provienen de un haz de luz entre un fotodiodo de

referencia y un micro enfocado óptico en el estuche del capilar.

El scanning es a través de un detector que ilumina el capilar con luz blanca luego
dispersada y analizada a través de un policromador por arreglo de fotodiodos (detector PDA
para óptica reversa). Alternativamente, el sistema óptico convencional (forward optic)
puede ser empleado por una banda espectral aislada por un monocromador colocado entre
la fuente de luz y el capilar. El escaneo puede ser controlado rápidamente por un sistema
computarizado que controla el movimiento del monocromador en el rango espectral en el
tiempo de milisegundos. Este sistema de detección produce menos ruido de fondo, y mucha
más sensibilidad que el detector con arreglo de diodos PDA.

g. Consideraciones generales.

La electroforesis capilar es la modalidad más utilizada a causa de su simplicidad

operacional y versatilidad. El intervalo de aplicaciones, es diverso y las áreas de aplicación
pueden ir desde problemas relacionados con la separación de especies pequeñas hasta la
separación de especies de gran volumen. Esto junto con el hecho que se requieren pequeños
volúmenes de muestra, ha despertado una gran expectación en diferentes campos, tal como
lo demuestra el incremento de publicaciones realizadas en el área de bioquímica y
biotecnología, industria farmacéutica, análisis químico o medio ambiente.

La CE está basada en dos fenómenos:

• Migración electroforética. Los iones y moléculas cargadas migran a través del gradiente
creado por el campo eléctrico en función de sus fuerzas eléctricas.
• Electroósmosis, también llamada electroendósmosis. Ocurre en todos los procesos de
separación electroforética. Se puede definir como el movimiento relativo de un líquido con
respecto a una superficie cargada (como el capilar de sílice fundida) provocado por un
campo eléctrico. Este movimiento recibe el nombre de flujo electroosmótico.
 a. ¿Qué es?

Cromatografía iónica
La Cromatografía de intercambio iónico esta conceptuada como proceso que permite la
separación de iones y moléculas polares basadas en las propiedades de carga de las
moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada. En la actualidad
presenta varias aplicaciones dentro de las que se destacan las aplicaciones bioquímica e
industriales.

b. ¿Cuál es su aplicación? Ejemplos.

La Cromatografía de Intercambio iónico tiene un sinnúmero de aplicaciones de orgánicos y
bioquímicos como fármacos metabolitos además del uso para separaciones de
macromoléculas

c. Descripción de la fase móvil y fase estacionaria.

Una fase móvil en donde se presenta un compuesto que es retenido más fuertemente que
los componentes de la muestra a analizar y por lo general, responde a especies de tipo
iónicas y con bajo peso molecular. La Fase Móvil es generalmente una solución
amortiguadora de pH.
La fase estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados,
teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones).
La fase estacionaria consta de intercambiadores iónicos, que son grupos cargados unidos
covalentemente a un soporte o matriz. Están asociados a iones de carga opuesta o contra
iones (A-); la asociación reversible de éstos se intercambia y está en equilibrio con la de
moléculas de los solutos de su misma carga presentes en la muestra, entre los que está
nuestra molécula de interés

d. De los ejemplos citados ¿cuál es el fundamento para

aplicar esas técnicas?

Esta técnica cromatográfica es una de las más empleadas en Bioquímica, por la versatilidad
que proporcionan la gran variedad de grupos intercambiadores disponibles, y sus respuestas
a condiciones cambiantes de pH y concentración iónica. Está muy indicada en las primeras
etapas de los procesos de purificación, por su buena resolución y alta retención de solutos,
aunque por la misma razón se puede usar en cualquier momento.

e. Cuáles son las condiciones operativas?

Este tipo de cromatografía ocurre mediante dos mecanismos:
  Intercambio iónico debido a la formación de enlaces iónicos competitivos
 Exclusión iónica debido a la repulsión entre moléculas en la fase móvil que tienen
carga similar y iones fijos en el soporte cromatografíco.
Consta de 4 etapas:

 Equilibrio: de la fase estacionaria a las condiciones iniciales deseadas.

 Aplicación de la muestra y lavado: formar en laces con las moléculas deseadas y
lavar todo el material que no se haya unido. El buffer de la muestra debe tener el
mismo pH y fuerza iónica que el buffer de la solución inicial con el fin de enlazar
todas las proteínas de carga apropiada.

 Elución: Las biomoléculas se liberan del intercambio iónico mediante un cambio en

la composición del buffer. Por lo general, se realiza aumentando la fuerza iónica de
la solución: la concentración de cloruro de sodio o alguna sal simple. Con el fin de
sorber las proteínas adsorbidas. Las proteínas se adsorben de acuerdo con el número
de grupos cargados en su superficie.

 Regeneración: Se remueven las moléculas que aún se encuentran unidas a las

superficies.

f. ¿Cuáles son sus detectores?

La Cromatografía iónica trabaja con diferentes detectores, entre los más comunes se
encuentran el conductimétrico, amperométrico y UV, el cual es el encargado de hacer el
registro de la señal en relación a su tiempo de retención, permitiendo obtener resultados de
tipo cualitativo en razón al ion presente que se refleja en los máximos picos del
cromatograma, y la información cuantitativa que corresponde al ion y a un cálculo
relacionado con el área del pico cromatográfico.

g. Consideraciones generales.

La cromatografía de intercambio iónico se basa en las interacciones electrostáticas y

permite la separación de macromoléculas en función de sus cargas mediante su interacción
diferencial con una fase estacionaria de naturaleza iónica. En este tipo de Cromatografías,
la fase estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados,
teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es
generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía de
intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta
de las proteínas a un valor de pH determinado.
 Referencias

Doria, G. (2013). Técnicas cromatográficas específicas. En Módulo Cromatografía (pp. 45-

57). Bogotá, Colombia: UNAD - Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Recuperado
de http://hdl.handle.net/10596/9904
- Torres, R. R. (2010). Procesos de separación en la biotecnología. México, D.F., MX:
Instituto Politécnico Nacional. (pp. 3-46). Recuperado
dehttp://bibliotecavirtual.unad.edu.co:2077/lib/unadsp/reader.action?
ppg=10&docID=10378316&tm=1480309229488
- Morante, Z. S., & Sierra, A. I. (2007). CE. En Desarrollo de métodos analíticos para la
separación quiral y su aplicación al estudio de procesos de síntesis asimétrica. (pp. 137-
175). Madrid, ESPAÑA: Dykinson. Obtenidos
dehttp://bibliotecavirtual.unad.edu.co:2077/lib/unadsp/reader.action?
ppg=15&docID=11217259&tm=1480309912342
- Gismera, G. M. J., Quintana, M. M. D. C., & Da, S. D. C. M. D. (2012). Cromatografía de
cambio iónico. En Introducción a la cromatografía líquida de alta resolución. (pp. 119-
124). Madrid, ES: Editorial Universidad Autónoma de Madrid. Recuperado
dehttp://bibliotecavirtual.unad.edu.co:2077/lib/unadsp/reader.action?
ppg=9&docID=11002011&tm=1480310325624
- Santamaria, M. R. (2003). Extracción con fluidos supercríticos. En Industria alimentaria:
tecnologías emergentes. Barcelona, ES: Universitat Politècnica de Catalunya. (pp. 131-
204). Recuperado dehttp://bibliotecavirtual.unad.edu.co:2077/lib/unadsp/reader.action?
ppg=14&docID=11046281&tm=1480365231405
- Zambrano, M. (2016). OVI – Aplicaciones de la Cromatografía. Bogotá, Colombia:
UNAD - Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Recuperado
de http://hdl.handle.net/10596/10124

Skoog, Holler, Nieman Ed. Mc Graw Hill 5ª ed II. “Análisis Instrumental”, Douglas A.
Skoog y James J. Leary 4ª ed.Mc Graw Hill III. “Capillary Electrophoresis: Principles and
Practice.” R. Kuhn, S. Hoffstetter-Kuhn. Springer Laboratory. IV. “Capillary
Electrophoresis: Theory and Practice.” Patrick Camilleri et al. 2ª Ed. V. “Análisis Químico
Cuantitativo” C. Harris, D. 2ª Ed. Reverte S.A. 2001. Tomado de:
http://www.bioquimica.ucv.cl/paginas/central/met.%20separacion/separaciones
%20cromatografia%20y%20electroforesis.pdf
 Consultado el 02 de mayo de 2019. Tomado de:
http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-qumicos/electroforesis-capilar

Consultado el 02 de mayo de 2109. Tomado de:

https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/6423/04cap1.pdf?sequence=4