Cromatografía de gases/líquidos

Iza Fernanda Pérez Ramírez

Introducción
 La cromatografía es un método que permite la separación de los
componentes presentes en una mezcla compleja.

 La primera separación cromatográfica es

atribuída al botánico Mikhael Tsvet, quien utilizó
una columna con carbonato sódico para la
separación de pigmentos (1901).
Clasificación de métodos cromatográficos

Cromatografía

Gas Líquido
Fase móvil (adsorción) (partición)

Fase Sólido Líquido Sólido Líquido

estacionaria (GSC) (GLC) (LSC) (LLS)
Clasificación de métodos cromatográficos
Cromatografía

Fase normal
(GC)

Fase reversa
(LC)

No polar Polar
Cromatografía gaseosa-sólida (GSC)

Fuente de gas

Sistema de inyección

Columna cromatográfica

Sistema de detección
Sistema para recolección
de datos e interpretación
Cromatografía gaseosa-sólida (GSC)
 Consiste en el acarreo de una muestra a través de la fase
estacionaria (columna) por la fase móvil (gas).

 Los componentes de la muestra

interactúan con las fases y son
eluidos dependiendo de sus
propiedades fisicoquímicas, lo que
conlleva a diferentes velocidades de
migración.
Gas acarreador
 El gas acarreador debe ser anhidro, libre de oxígeno e inerte.

 Helio e hidrógeno son los gases más utilizados, sin embargo la

selección del gas depende del rendimiento deseado y el tipo de
detector.
Gas acarreador

 Hidrógeno/Helio

 Nitrógeno
Inyector
 El puerto de inyección permite la introducción
de la muestra directamente en la columna.
 Existen dos métodos de inyección de la
muestra: split/splitless.
 Se utilizan temperaturas elevadas de
inyección (~240 °C) para la vaporización
instantánea de la muestra.
 La muestra vaporizada se mezcla con el gas
acarreador para su transporte en la columna.
Horno
 Programación isotérmica.
 La temperatura es constante durante toda
la separación, y la temperatura óptima es
alrededor del punto medio del rango de
ebullición de la muestra.

 Programación de temperaturas.
 La temperatura es incrementada de
manera continua o en pasos con respecto
a la progresión de la separación.
Columnas
 Los principales tipos de columna son: empacadas y capilares.

FSWC: fused-silica wall-coated; WCOT: wall-coated open tubular; SCOT: support-coated open tubular
Columnas
 Consideraciones para la selección de la columna:

 Tipo de analito

 Características de la columna

 Espesor

 Diámetro interno

 Longitud

 Recubrimiento (afinidad y polaridad)

Sistemas de detección
 Es un equipo localizado al final de la columna que provee una
medición cuantitativa de los componentes de la mezcla que han
sido eluidos con el gas acarreador.

 El detector cuenta con un sensor y

un digitalizador, los cuales en
conjunto sirven como transductores
para la conversión de cambios de
la propiedad física detectada en
una señal eléctrica que es
registrada como un cromatograma.
Tipos de sistemas de detección
Detector Muestras Sensibilidad

Espectrómetro de masas Universal 0,25 – 100 pg

Ionización de flama Hidrocarburos 1 pg/s

Conductividad térmica Universal 500 pg/ml

Captura de electrones Hidrocarburos halogenados 5 fg/s

Emisión atómica Elementos 1 pg

Vapores y compuestos
Fotoionización 0.002 – 0.2 ppm
gaseosos
Tipos de sistemas de detección
Detector de ionización de llama (FID)
 Los detectores de ionización (FID, ECD, PID) interactúan con los
solutos eluídos de la columna del GC para producir una corriente
que varía en proporción de la cantidad de soluto presente.

 El FID es sensible a moleculas con se ionizadas en una flama de

hidrógeno-aire, incluyendo la mayoría de compuestos que
contienen carbonos.

 Los iones formados en el detector son forzados hacia un

electrodo por un potencial eléctrico, produciedo una corriente en
el orden de picoamperes (10-12 A), la cual es convertida en voltaje,
filtrada y amplificada.
Detector de ionización de llama (FID)
Detector de ionización de llama (FID)
 El gas acarreador de la columna entra al fondo del detector,
donde es mezclado con gas de combustión (hidrógeno) en el
área de bajo del "jet” de flama.

 Se combina con aire y se quema justo sobre la punta del ”jet”.

 Se aplica un voltaje de polarización negativo entre la punta del

“jet” y el electrodo colector, por lo tanto los electrones formados
son acelerados a través de la punta del “jet” y el colector por un
campo eléctrico.
Detector de ionización de llama (FID)
Detector de captura de electrones (ECD)
 Su funcionamiento se basa en la emisión de una partícula b
(electrón) por parte de átomos como el Níquel 63 o el trítio ( 3H).

 El ECD es un detector muy selectivo y sensible a la presencia de

moléculas con grupos electronegativos como halógenos y grupo
nitro.

 Su principal aplicación es para el análisis de algunos insecticidas

o bifenilos policlorados (PCBs) en muestras medioambientales,
los cuales están en concentraciones muy bajas (ppm y ppb).
Detector de captura de electrones (ECD)
 El gas acarreador que sale de la columna del GC pasa a través
de dos electrodos.
 Uno de los electrodos (cámara catódica) tiene en su superficie un
radioisótopo emisor de partículas b, electrones de alta energía.
 Los electrones bombardean al gas acarreador resultando en la
formación de un plasma de iones positivos, radicales y electrones
térmicos (< 0.1 ms).
 La aplicación de voltaje negativo la cámara catódica permite
”colectar” los electrones térmicos en el colector de electrones
situado más adelante en la corriente de gas.
Detector de captura de electrones (ECD)
 Cuando solo hay gas acarreador presente, se mide una corriente
de línea base.
 Al tener compuestos que pueden absorber electrones, éstos
reaccionaran con los electrones térmicos y formarán iones
negativos pesados.
 Los iones negativos pesados tienen mayor inercia que los
electrones, por lo que serán neutralizados rápidamente por los
iones positivos presentes en el plasma, lo que disminuirá la
corriente eléctrica.
Detector de captura de electrones (ECD)
 El ECD es de respuesta selectiva, siendo muy sensible a las
moléculas que contienen grupos funcionales tales como
halógenos, peróxidos, quinonas y grupos nitro; en cambio, no es
sensible a grupos funcionales como aminas, alcoholes e
hidrocarburos.
 Su intervalo de respuesta lineal se limita a uno o dos órdenes de
magnitud
Sistema cromatográfico
Módulos

Bomba cuaternaria

Inyección

Columna

Detectores

Fotodiodos
Dispersión de luz
Espectrómetro de
masas
Sistema de separación UPLC

Ventajas
• ↑Velocidad
• ↑Resolución
• ↑Sensibilidad

 Baja dispersión: Columnas de

pequeño diámetro empaquetadas
con partículas < 2 μm y distribución
de fase móvil a ∼15 000 psi
Bomba cuaternaria
Fase móvil – Selección de disolventes
Fase móvil – Selección de disolventes
Fase móvil – Variación de pH del disolvente

 Amortigua el pH de la columna → Interacciones más fuertes con los compuestos → Menor coleo
Columna
Tipo Grupo ligado Aplicaiones, comentarios
C1 -CH3, metil Para compuestos muy retenidos en C18.
C2 -CH2-CH3, etil Análisis más rápidos que con C18. Análisis de
C4 -(CH2)-CH3, butil péptidos y proteinas.
C6 -(CH2)-CH3, hexil
C8 -(CH2)7-CH3, octil Empleo general.
C18 -(CH2)17-CH3, Empleo general. Es la fase más empleada.
octadecil (ODS)
FENIL -(CH2)3-Phe, Compuestos moderadamente polares.
fenilpropil Retención similar a C8, pero más selectiva
para compuestos aromáticos
CIANO -(CH2)3-CN, Solventes polares y no polares. Selectividad
cianopropil hacia dobles y triples enlaces.
NITRO -(CH2)3-Phe-NO2, Separación de compuestos con dobles
nitrofenilpropil enlaces y aromáticos.
Columna
Tipo Grupo ligado Aplicaiones, comentarios
AMINO -(CH2)3-NH2, Selectividad a CN, NO2 y silicagel. Análisis
aminopropil de carbohidratos. Intercambio aniónico débil.
DIOL -(CH2)3-O- Menos polar que silicagel, pero más que CN.
CH(OH)- Menos estable
CH2(OH)
N(CH3)2 -(CH2)3-N(CH3)2 Intercambiador aniónico débil (WAX)
-SO3Na -(CH2)3-Phe-SO3- Intercambiador catiónico fuerte (SCX)
-N(CH3)3+ -(CH2)3-Phe- Intercambiador aniónico fuerte (SAX)
+
NMe3
-COONa -COO- Intercambiador catiónico débil (WCX)
Detector de matriz de fotodiodos (PDA)
 Fotodiodos

 Se hacen incidir haces de luz en una columna de boro, los

cuales son reflejados por el recubrimiento de teflónAF
Detector de matriz de fotodiodos (PDA)

 La red está formada de 512

fotodiodos, los cuales actúan como
condensadores para el
almacenamiento de una cantidad fija
de carga
 El detector mide la cantidad de luz
que incide sobre la red de fotodiodos
y determina la absorbancia de la
muestra en la cubeta de flujo
Detector de dispersión de luz evaporativa
(ELS)
 El efluente es mezclado con gas acarreador
(nitrógeno), y es nebulizado a baja temperatura
para la formación de pequeñas gotas

 En la región de desolvatación, la fase móvil es

evaporada, dejando las partículas del analito
‘secas’ (en dado caso de que sean menos
volátiles que la fase móvil)

 Un haz de luz incide sobre el analito, lo que

hace que la luz se disperse y se concentre en el
tubo fotomultiplicador, el cual mide su
intensidad (voltaje) que es proporcional a la
masa del analito
Identificación de metabolitos
 Preparación e inyección de muestras

 Selección y optimización del método cromatográfico

 Interpretación de datos
Preparación de muestras
 Extracción de analitos de interés
 Con disolventes (metanol, cloroformo, acetona, acetonitrilo, hexano…)

 Derivatización de analitos
 Sililación

 Acilación

 Alquilación
Extracción de analitos de interés

Adicionar 1 Sonicar Filtrar

20 mg
mL de
muestra (30 min) (45 m)
disolvente

 Disolventes (metanol, cloroformo, acetona, acetonitrilo, hexano…)

Derivatización de analitos de interés
 Derivatización
 Proceso que consiste en modificar químicamente un compuesto para
producir un derivado con nuevas propiedades que faciliten o permitan su
análisis.
 Características del proceso
 Procesamiento mínimo
 Rendimiento máximo de la reacción y alta reproducibilidad
 Correspondencia entre el número inicial de analitos y derivados
 El origen químico de los productos es predecible
Derivatización de analitos de interés
 Acilación
 Conversión de compuestos con hidrógenos activos en ésteres, tioesteroles y aminas

 Aquilación
 Reemplazo de un hidrógeno activo con un grupo alquilo o arilo

 Sililación
 Reemplazo de un hidrógeno activo con un grupo alquilsililo
Derivatización de analitos de interés
 Sililación: BSTFA-TMCS, bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida con
trimetilclorosilano (1%)
 El BSTFA produce compuestos con grupos trimetilsilil, formando derivados
volátiles y térmicamente estables para su análisis por GC-MSD.
 El TMCS incrementa la capacidad de donación de sililos del BSTFA
Derivatización de analitos de interés
 Ventajas
 Transformación de compuestos no volátiles en derivados volátiles.
 Conversión de compuestos no detectables en productos apropiados por minimización
del límite de detección.
 Análisis de compuestos reactivos que presentan interacción con la fase estacionaria de
la columna.
 Incremento de la especificidad de la fragmentación del ion molecular para la estimación
de estructuras.

 Desventajas
 Incremento del peso molecular de los compuestos
Derivatización de analitos de interés
 Sililación: BSTFA-TMCS, bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida con
trimetilclorosilano (1%)
 El BSTFA es susceptible a hidrólisis, por lo que se recomienda la eliminación
de agua de las muestras previo a la derivatización.
 Debido a la reactividad del BSTFA con hidrógenos activos, se debe evitar el
uso de disolventes con hidrógenos lábiles en el proceso de derivatización.
Derivatización de analitos de interés

Evaporar Adicionar 50
muestra con Re suspender
μL de BSTFA- Inyectar
muestra
N2 gaseoso TMCS

BSTFA-TMCS: Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida con trimetilclorosilano (1%)

Selección y optimización del método
 Selección de un método base

 Selección de columnas
 Polaridad de los analitos de interés

 Optimización del método cromatográfico

 Restricción de compuestos de interés

 Eficiencia y mejora del perfil cromatográfico

Método base

Inyector Temperatura de inyección: 250 °C

Modo de inyección: Splitless

Volumen de inyección: 2 μL
Método base
Columna Columna: HP-5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm)

Flujo del gas acarreador: Helio, 1 mL/min (isocrático)

Programa de temperatura (gradiente):

Temperatura Velocidad Stand-by
100 °C --- 1 min
220 °C 6 °C/min 1.23 min
290 °C 10 °C/min ---
310 °C 40 °C/min 7.5 min
Método base

Detector Temperatura del detector: 230 °C (fuente de iones) y

150 °C (quadrupolo)

Energía de fuente de iones: 70 eV

Rango de masas: 50-700 m/z

Selección y optimización del método
 Optimización del método cromatográfico
 Defectos en los cromatogramas y/o espectros de masas

 Mejora de la separación cromatográfica

Interpretación de datos
 Identificación de compuestos de interés
 Estándares externos o interpretación de espectros de masas

 Extracción de resultados
 Identificación de compuestos por tiempo de retención
 Extracción de espectros de masas, ion base, ion molecular, fragmentos de iones

 Cuantificación por porcentaje de área relativa

 Extracción de áreas de los compuestos de interés
Identificación y cuantificación de capsaicinoides
 Preparación e inyección de muestras

 Optimización del método cromatográfico

 Interpretación de datos
Síntomas en los cromatogramas
 No se observan picos:
 La concentración o el volumen de la muestra es insuficiente.
 No hay analitos en la muestra.
 La jeringa no está correctamente instalada.
 La entrada del GC está sucia.
 La rosca de la entrada de la columna está suelta.

 Los picos presentan mesetas:

 Escala incorrecta en el cromatograma (TIC).
 El volumen de inyección es muy grande.
 El voltaje del EM es muy alto.
Síntomas en los cromatogramas
 Los picos presentan coleo (al final):
 El volumen de inyección es muy grande.
 La temperatura inicial del horno es muy alta.
 El flujo de gas es insuficiente.
 La temperatura de la interfase o de la fuente de iones es muy baja.

 Los picos están coleo (al inicio):

 El volumen de inyección es muy grande.
 La temperatura inicial del horno es muy baja.
 El flujo de gas es insuficiente.
 La presión del inyector es muy alta.
Síntomas en los cromatogramas
 Los picos presentan divisiones:
 La técnica de inyección es inadecuada.
 El volumen de inyección es muy grande.

 La línea base se está elevando:

 Sangrado o contaminación de la columna.

 La línea base está elevada:

 Sangrado o contaminación de la columna
 El voltaje del EM es muy alto.
Síntomas en los cromatogramas
 La línea base se está cayendo:
 Hay agua o aire residual debido a un venteo reciente.
 Sangrado de la columna o de la septa.
 El tiempo de inyección es muy prolongado.

 La línea base se está ondeando:

 El flujo de gas es insuficiente.
 Hay fugas de gas intermitente en la entrada del GC.
 El regulador del flujo o de la presión no está funcionando

adecuadamente
Síntomas en los cromatogramas
 Los tiempos de retención se están acortando:
 Se ha cortado la columna.
 La temperatura inicial del horno se ha incrementado.
 La columna se está deteriorando.

 Los tiempos de retención se están alargando:

 El flujo de la columna se ha disminuido.
 La temperatura inicial del horno se ha disminuido.
 Hay fugas de gas intermitentes en la entrada del GC.
Síntomas en los cromatogramas
 Baja sensibilidad:
 Las condiciones del tuning son incorrectas.
 Las temperaturas (horno, interfase, fuente de iones) son inadecuadas.
 La concentración de la muestra o la relación del split es muy baja.
 La entrada del GC está sucia.
 Presión excesiva en el MSD.
 La fuente de iones está sucia.
 Hay fuga de gas en el GC.
 El EM está funcionando incorrectamente.
 La polaridad del filtro de masas es incorrecta.
Síntomas en los cromatogramas
 Baja repetibilidad:
 La jeringa de inyección está sucia.
 La entrada del GC está sucia.
 Hay fuga de gas en la entrada del GC.
 El volumen de inyección es muy alto.
 Las conexiones de la columna están sueltas.
 Hay variaciones en la presión, temperatura y flujo de gas.
 La fuente de iones está sucia.
Síntomas en los espectros de masas
 No hay picos:
 Los cables de la fuente de iones no están conectados.
 Las conexiones del detector son inadecuadas.
 Hay fallas en las conexiones electrónicas..

 Elevadas abundancias a 18, 28, 32 y 44 o 14 y 16 (m/z):

 Hay aire o agua residual debido a un venteo reciente.
 Hay fuga de aire.
Ganancia
Control de la ganancia

 Esun potenciómetro que determina el nivel en

voltaje de entrada de la señal

 Le
dice al amplificador el rango de voltaje con en el
que va a trabajar
Control de la ganancia
 Lo que hace una ganancia es establecer un parámetro para
que la unidad principal esté sincronizado con la potencia
que puede desarrollar el amplificador

 Ajustar correctamente la ganancia= poner al amplificador a

trabajar en su máxima potencia
Control de la ganancia

 Una ganancia bien ajustada implicará un sistema

con un nivel de ruido bajo, y una lógica visual detrás
de la lectura de volumen de tu unidad principal
La ganancia es un parámetro del instrumento,
no del aparato
Entre más ganancia
se tenga, mayor será
el ruido
Regulador de ganancia en un GC-MS
Regulador de ganancia en un GC-MS
Regulador de ganancia en un GC-MS
Ganancia fija en nuevos equipos – Máxima
eficiencia
Terminología
Absorción:
 La retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que
tiene ésta a formar mezcla o a reaccionar químicamente con la misma.

Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorción y de reparto.

Adsorción:
 Es la retención de una especie química en los sitios activos de la superficie de un sólido,
quedando limitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial, esta
retención superficial puede ser física o química.

C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar.

C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar.

71
Terminología
Disolvente : Cualquier fase móvil.

Elución: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.

Eluyente: La fase móvil una vez que se extrae de la columna.

Fase estacionaria:
 Material que permanece dentro de la columna cromatográfica
durante la cromatografía y que retiene algún componente de la
muestra, posee una gran área superficial y puede ser un sólido o
un líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte.

72
Terminología
Fase móvil:
 Es un fluido que puede ser líquido, gas o fluido supercrítico que se usa como
portador de la mezcla y que se hace pasar a través de la columna cromatográfica y
la fase estacionaria.

Origen: Lugar físico donde se coloca la muestra al principio.

Soporte:
 El material sólido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la fase
estacionaria líquida en su sitio.

Sorbente: Cualquier fase estacionaria.

73
Parámetros cromatograficos

 Pico de aire

 Línea base

 Altura de pico (h)

 Anchura del pico w (4)

 Área del pico

74
Terminología
Cromatograma:
 Si colocamos un detector al final de la columna que responde a la
concentración del soluto y se registra su señal en función del tiempo (o del
volumen de fase móvil añadido) se obtiene una serie de picos que representan
un grafico denominado cromatograma.

 Grafico útil para el análisis cualitativo y/o cuantitativo.

 La posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los
componentes de la muestra
 Las áreas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada 75

componente.
Terminología
Tiempo de retención:
 Es el tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra hasta que el pico de
concentración del analito alcanza el detector;
 Es el tiempo que tarda un compuesto en salir de la columna;
 Es el tiempo que tarda en aparecer el máximo de un pico,

 Se representa con el símbolo tR.

76
Volumen y tiempo de retención

 Volumen de retención, VR: Volumen de fase móvil

requerida para eluir un soluto de la columna

 Tiempo de retención, tR: Tiempo requerido para cada

componente para recorrer toda la columna.

77
Volumen y tiempo de retención
VR = tR · flujo

tRb
tRa
señal

A B

78

tiempo
Terminología
Tiempo muerto tM:

 Es el tiempo necesario para que la especie no retenida alcance

el detector;

 Es el tiempo de migración de la especie no retenida;

 Es el tiempo necesario para que, por termino medio, una

molécula de la fase móvil pase a través de la columna

79
Terminología

80
Terminología
 La velocidad lineal promedio de migración del soluto es:

81
Terminología
Velocidad lineal promedio u del movimiento de las moléculas de la fase móvil
es:

82
Plato teórico
 Sistema “ESTATICO” en equilibrio

 Cada especie presenta un equilibrio entre la fase móvil y la fase

estacionaria

A fase movil  A fase estacionaria

Terminología
Constante de distribución:
 Los equilibrios de distribución suponen la transferencia de una analito entre las fases.

A móvil ⇔ A estacionaria
 La constante de equilibrio para este proceso se denomina:
 Constante de distribución
 Razón de distribución o
 Coeficiente de distribución
 Mide la distribución del analito entre la fase estacionaria y la fase móvil.

 CS es la concentración molar del soluto en la fase estacionaria (mol/L)

 CM es la concentración molar en la fase móvil (mol/L)

84
Coeficiente de reparto

Concentrac ion del soluto en la fase estacionar ia

K
Concentrac ion del soluto en la fase movil

 K es independiente de la concentración. Puede

afectarse por factores como la temperatura.

Cuando K se incrementa el soluto tarda más tiempo

en pasar a través del sistema

85
Factores que influyen en la separación
 Valores de K suficientemente diferentes.

 Tener el suficiente # de equilibrios

 Eficiencia en la columna:
 tR mas cortos
 Picos mas angostos

86
Coeficiente de reparto
L
v tR t0 nsolutoM
  f
u L tR nsolutoT
t0

 f es la fracción de tiempo que el soluto pasa en la fase

móvil.
Puesto que las fases estacionaria y móvil, tienen
volúmenes conocidos; Ve, Vm. A partir de esto, se puede
calcular el coeficiente de partición.
Coeficiente de reparto
 C M VM 
v  u 
 C M VM  C E VE 
 Dividiendo entre: CMVM

 

 1 

v  u 
1  C E VE 

 C M VM 
 88
Coeficiente de reparto
 Como:
 
K
C solutoE 
 1 

C solutoM v  u 
V
1  K E 

 VM 


VM u 
K   1
VE v 
Coeficiente de reparto
VM  u 
K    1
VE  v 

 Cuando se incrementa:
VE: Se incrementa la retención.
VM: Disminuye la retención.
Coeficiente de reparto
VM  u 
K   1
VE  v 
 VE y VM, pueden alterarse cambiando el diámetro y la
longitud de la columna
 u y v, puede modificarse al variar el flujo.
Factor de capacidad
 La razón de la cantidad de soluto en la fase estacionaria y la
cantidad en la fase móvil.

 Es característico de un compuesto especifico en una composición

de fase móvil a una temperatura y en un tipo de columna

92
Factor de capacidad

nE
k 
nM

93
Terminología
Factor de retención o factor de capacidad:
 Describe la velocidad de migración de los solutos en la columna. Para una especie A,
el factor de capacidad k’A se define como:

 k’A es el coeficiente de distribución de la especie A,

 VS es el volumen de la fase estacionaria y
 VM es el volumen de la fase móvil.

94
Terminología
Factor de retención o factor de capacidad:
 Medida de tiempo transcurrido en la f. estacionaria en relación con el tiempo
transcurrido en f. móvil.

 Es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir, dividido entre el
tiempo de elución de una banda no retenida (k’=0)

 La relación establece cuantos volúmenes muertos (o tm) se necesitan para alcanzar a

Vol. de retención (o tr)

 Cuando el factor de capacidad es menor que la unidad, la elución es tan rápida que es
difícil determinar con exactitud los tiempos de retención.
 Cuando el factor es del orden de 10 o mayor, los tiempos de retención son
excesivamente largos.

95
Factor de capacidad
VE  1 
k  K
VM v  u 
1  k  
 

 1 

v  u 
1  K VE 

 VM 

L L
u v
t0 tR
Factor de capacidad
L L  1 
  
tR t 0 1  k  

tR  t0
k 
t0
Magnitudes corregidas
 Tiempo de retención ajustado
t B

señal
t A
tB 
t
R
tA k 
t0

t0

0.0
tiempo
1  k' 3 98
Factor de selectividad
 Medida de separación relativa entre dos picos

 Medida de la interacción relativa de los solutos

con la fase estacionaria

99
Terminología
Factor de selectividad:
 El factor de selectividad α de una columna para dos especies:

 KB es el coef. de distribución para la especie mas retenida

 KA es el coeficiente para la menos retenida

 Depende de la naturaleza de la fase estacionaria y móvil, y

 La temperatura de operación de la columna

100
Factor de selectividad
 Se puede evaluar la selectividad en base a los
tiempos de retención para cada soluto.

t RA  t 0

k 
A t0 t RA  t 0 t RA
   
K t RB  t 0

B t RB  t 0 t 
RB

t0

1  2
Terminología
Resolución cromatográfica:
 La resolución cromatográfica RS de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para separar
dos analitos.

 WA y WB son la anchura de los picos A y B.

 Si R > 1.5 la separación de los componentes es completa
 La resolución puede mejorarse alargando la columna, aumentando así el número de platos. Una
consecuencia negativa es el incremento del tiempo requerido para la separación.

102
Resolución
104
Terminología
Eficiencia en cromatografía
 La eficiencia se define en base a dos términos
 1º La altura del plato H
 2º El número de platos N.

 La eficacia de la columna a mayor número de platos, y

 A menor altura de plato.
 Las eficacias en términos de número de platos varían de cientos a miles, y
 Las alturas de plato de unas pocas décimas a milésima de centímetro.

105
Número de plato teórico
 En extracción con disolvente, un plato es representado por
cada equilibrio (extracción).
 En una destilación fraccionada, un plato es representado por
cada destilación.
 En una columna cromatografíca se puede aplicar el concepto
de plato teórico (cada evento de separación realizado).
 Se puede estimar el número de platos teóricos en la columna
basado en los tiempos de retención y ancho de las señales
de cada compuesto.

106
Altura equivalente a un plato teórico
 Longitud de columna en que se lleva a cabo una separación.

L
H
N

107
Equilibrios

108
Terminología
Número de platos N:

109
Terminología
 Las bandas cromatográficas tienen una forma gaussiana,
 Definir eficacia de una columna en términos de varianza por unidad de longitud.

 La curva es gaussiana, y la ubicación de L -1σ y L +1σ se indica mediante líneas

verticales discontinuas.

110
Número de plato teórico
 Método de las tangentes.

2
 tR 
N  16 
 W tan 

111
Número de plato teórico

112
Resolución

114
115
Teoría de la separación

 Como se lleva a cabo la separación.

 Como son las señales analíticas.

116
 Factor de Asimetría
AF = 1 Pico simétrico
AF = b / a AF > 1 Pico coleado
AF < 1 Pico cabeceado

a b
10% 117
Factor de asimetría

Cs

CM
118
Asimetría de la banda
 Si k’ es mayor a concentraciones mas bajas de soluto
 La zona de baja concentración del pico eluye mas lentamente.
 Por lo tanto la señal del pico será “coleada”
 Combinación equivocada de muestra y empaque de columna

 El tipo inverso de asimetría se conoce como “cabeceado”

 k` es mayor a concentraciones mas altas de soluto.
 Solución :
 Disminuir el tamaño de la muestra hasta que las bandas sean simétricas y tR
constantes.

119
Resolución
 Ecuación fundamental de la resolución
1
1    1  k    L  2

R    
4     1 k   H

1    1  k  
 N
1
R   2

4     1 k 

Donde k’ es un promedio entre k’ 2 y k’ 1

si k’ 2  k’ 1, entonces k’ = k’2 120
Eficiencia de la columna
 Empleo de columnas mas largas incrementamos N

 Trabajar con condiciones optimas de flujo y temp.

 k incrementa disminuyendo la temperatura

 Alfa se aumenta:
 Sustituyendo la fase estacionaria.

121
Variables cinéticas
Variable Símbol Unidade

o s

Vel. Lineal de la fase móvil u cm/s

Coeficiente de difusión en la fase móvil Dm cm2/s

Coeficiente de difusión en la fase estacionaria Ds cm2/s

Factor de retención k’ -

Diámetro de la partícula de relleno dp cm

122

Espesor del recubrimiento liquido en la fase df cm

Variables cinéticas
 Efecto del caudal de la fase móvil sobre la altura de plato. Gas/Liq (-1)

H = mm

123

v = cm/s
Variables cinéticas
 Efecto del caudal de la fase móvil sobre la altura de plato. Gas/Liq (-1)

 Velocidades lineales menores en líquidos.

 Las separaciones cromatograficas en gases son en menor tiempo

 Las alturas de plato son por lo menos un orden de magnitud menor en

líquidos.

 Columnas
 En líquidos 25 a 50 cm (caída de presión)
 En gases 50 m o más

124
Teoría Cinética
J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y Sjenitzer:
Dinámica de la separación.

Ecuación de van Deemter

B B
H  A   Cu  A   CS  CM u
u u
125
Difusión de Eddy
•Termino del camino libre

•Difusión en remolino

•Difusión parasita

B
H  A   Cu
u 126
Difusión parásita
H = cm
N
A  2 d p
l: Constante del empaque dada por la calidad del relleno
dp: diametro de la partícula

127
Difusión longitudinal

B
H  A  Cu
u 128
Difusión longitudinal
H =N
cm g: Cte. del empaque, factor de obstrucción.
Columnas rellenas = 0.6
Columnas capilares = 1

DM: Difusión de soluto en la f. móvil

Velocidad de migración por gradiente

B/v
v

B  2DM 129
Resistencia a la transferencia de masa

B
H  A   Cu
u

130
Transferencia de masa
HN
= cm df: Grosor de la fase estacionaria.

DE: Coef. de difusión del soluto en la fase estacionaria

Cv

A
B/v
v
 8k d 2f 
C 
  1  k  DE
2

131
Efecto global
B
N
H = cm

H  A   Cu
u
Global

H óptimo Cu

A
B/u

v
v = cm/s
Vel. lineal
óptima
132
Teoría Cinética
J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y
Sjenitzer: Dinámica de la separación

2DM  8k d  2
f
H  2d p   u
  1  k  DE 
2
u

133
Análisis cualitativo y cuantitativo
 Cualitativo
 Parámetros de retención
 Detectores selectivos
 EM, FTIR, RMN, UV

 Cuantitativo
 Altura de pico
 Área de pico

Buena resolución
Respuesta en el rango de linealidad del detector 134
Análisis cualitativo y cuantitativo
 Análisis cuantitativo

 ¿ Altura de pico o área de pico?

 El área debe utilizarse para picos con colas pronunciadas

 Ambos son imprecisos, con un volumen de inyección
irreproducible.
 La altura de pico puede usarse si el ancho del pico de los
compuestos es el mismo para estándares y muestra.

135
Análisis cuantitativo
 Normalización de áreas

 Normalización de áreas con factores de respuesta

 Estándar externo

 Estándar interno

136
Análisis cuantitativo
 Normalización de área o altura de pico
 Limitación: todos los componentes deben eluir.

A1
x%   100
A1  A2  A3  An

137
Análisis cuantitativo
 Normalización de área con factor de respuesta

conc
F
area

F1 A1
x%   100
F1 A1  F2 A2  F3 A3  Fn An
138