Trypanosoma cruzi Differentiates and Multiplies

within Chimeric Parasitophorous Vacuoles in

Macrophages Coinfected with Leishmania
amazonensis

CARINA CARRARO PESSOA, ÉDEN RAMALHO FERREIRA,

ETHEL BAYER-SANTOS, MICHEL RABINOVITCH, RENATO ARRUDA MORTARA,
AND FERNANDO REAL

DEPARTMENT OF MICROBIOLOGY, IMMUNOLOGY AND PARASITOLOGY, ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA, UNIFESP,

SÃO PAULO, BRAZIL
 Trypanosoma cruzi Leishmania sp.

Causante de enfermedad de Chagas Causante de Leishmaniasis cutánea o visceral

 COMO INFECTAN LA CÉLULA HUMANA?

• La invasión de células fagocitarias y en especial de los

macrófagos por Trypanosoma cruzi y Leishmania sp,
depende más de la habilidad del parásito de reconocer
receptores moleculares tipo lectinas y receptores de la
familia de las integrinas de la membrana celular6,7,8.

• Las formas metacíclicas dentro de la célula dan origen a la

formación de una vacuola parasitófora debido
probablemente a la unión estrecha de las membranas
celular y lisosomal en el mismo lugar donde la membrana
parasitaria se une. En cuanto a la evasión por parte del
parásito a los mecanismos de defensa intracelular; el
escape es facilitado por la acción lítica de una toxina TC-
TOX formadora de poros, la cual es secretada por el
parásito.
RESUMEN

• Los tripanosomátidos Leishmania amazonensis y Trypanosoma cruzi son excelentes modelos

para el estudio de la biología celular de Infecciones por protozoos intracelulares.
• Para investigar si se requieren vacuolas específicas del parásito para la supervivencia y
diferenciación de T. cruzi, se construyeron vacuolas quiméricas mediante la infección de
macrófagos infectados con amastigotes de L. amazonensis con epimastigotes (EPI) o
tripomastigotes metacíclicos (MT) de T. cruzi. Estas vacuolas quiméricas, fácilmente
observables al microscopio, permitieron la entrada y el destino de T. cruzi en L. amazonensis PV
para ser registrado dinámicamente mediante imágenes multidimensionales de células
coinfectadas.
Trypanosoma cruzi
Leishmania sp
MATERIALES Y MÉTODOS Células huésped. La
línea celular tipo
macrófago RAW 264.7
(ATCC, Manassas, VA,
EE. UU.) se mantuvo
mediante pases
sucesivos en medio
RPMI 1640.

Las células se separaron

La línea celular HeLa se
de matraces de cultivo
transfectó con un
de 25 cm2 con solución
plásmido con contenía
salina tamponada con
fluorescente rojo Rab7
fosfato (PBS) 0,01 M,
GTPasa marcada con
pH 7,2, complementada
proteína utilizando el
con HEPES 20 mM y
reactivo de transfección
EDTA al 1% durante 20
FuGene HD.
min.

Después del
Las células RAW 264.7 desprendimiento y
marcadas con GFP se centrifugación a 300 g
seleccionaron utilizando durante 10 min, las
8 g/ml de puromicina. células se sembraron en
Los macrófagos placas de 24 pocillos
derivados de la médula para la epifluorescencia.
ósea se obtuvieron de la
misma manera. Platos de microscopía o
MatTek
Los cultivos de parásitos empleados
en este estudio eran de tipo salvaje
(WT) Leishmania amazonensis
M2269 (MHOM/BR/1973/M2269) y
Discosoma sp. cepa de Trypanosoma
cruzi CL transfectada con proteína
roja fluorescente (DsRed) o
transfectada con GFP

T. cruzi se obtuvieron mediante el

cultivo de epimastigotes en medio
Grace (Gibco) a 26 °C durante 7 a 8
días y se aislaron utilizando una
columna de DEAE-celulosa usando la
transfección y selección de T. cruzi
etiquetados con DsRed o etiquetados
con GFP.
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN Y DE
BARRIDO
• Este tipo de microscopio electrónico
hace pasar el rayo de electrones a
través de la muestra, dando lugar a
una imagen en dos dimensiones.
El microscopio confocal tiene la obtención
de imágenes confocales y multifotónicas y
hace gala de un rendimiento general
excelente. El sistema abarca todo el rango
de velocidades de escaneado con la máxima
resolución; su detección con
espectrofotómetro de alta eficiencia(cinco
canales simultáneos) y AOBS (Divisor de haz
acústico óptico) opcional, el sistema Leica
TCS SP5 consigue imágenes brillantes,
desprovistas de ruido, con mínima
fototoxicidad y a alta velocidad.
Las células RAW 264.7
Suspensiones con:
infectadas durante 24 h se
fijaron con Karnovsky
modificado solución (1% de
paraformaldehído, 3% de
glutaraldehído en sodio 0,07
M a temperatura ambiente
durante 30 min, fijado
posteriormente con
tetróxido de osmio al 1%
Las células se observaron en
Microscopía electrónica de
transmisión
un microscopio electrónico
JEOL 1200 EXII
Las células RAW 264.7 en
Para microscopía electrónica de
barrido
cubreobjetos se fijaron con
glutaraldehído al 2,5 %,
tratado con ácido tánico,
deshidratado con etanol y
luego secado en un secador
de punto crítico CPD 030.
Para exponer el contenido
de PV quiméricos, las
muestras se fracturaron
pelándolas con la ayuda de
cinta adhesiva y luego se
recubrieron con una capa de
oro utilizando un método de
pulverización catódica.
 Para imágenes multidimensionales, se
empleo un sistema confocal Leica TCS
SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar,
Alemania) acoplado a
microincubadoras y una etapa
motorizada, lo que permitió la
adquisición de 20 a 30 imágenes z-stack
de muestras vivas de cinco campos
microscópicos diferentes a intervalos de
5 a 15 minutos entre cada adquisición.
El sistema se configuró en una
modalidad de escáner resonante.

Se obtuvieron micrografías de macrófagos infectados con amastigotes derivados de

lesiones de L. amazonensis durante 48 h y luego se sobreinfectaron con epimastigote (A a
C) o formas metacíclicas (D) de T. cruzi. (A a C) Micrografías electrónicas de transmisión
que muestran formas redondas de amastigotes (flechas) que cohabitan PV espaciosas con
formas flageladas (puntas de flecha) después de 24 h de la infección. (D) Las mismas
formas redondas y flageladas que habitan en PV espaciosas también se observaron al
escanear electrones.
microscopía. Las formas flageladas se colorearon digitalmente en azul; el color verde se
atribuyó a las formas redondas. Barra, 5m.
RESULTADOS

• La microscopía electrónica de
transmisión y de barrido de las
células huésped superinfectadas
muestra la coexistencia de formas
flageladas redondas y alargadas
dentro del mismo espacioso PV a
las 24 h de la segunda infección
(fig. 1).
• La presencia de formas móviles, DsRed-T. cruzi
EPI o MT dentro de L. amazonensis PV también se
observó en macrófagos vivos infectados bajo
epifluorescencia microscopía, permitiéndonos
cuantificar el porcentaje de quiméricos vacuolas
entre L. amazonensis PV en macrófagos con doble
infección. Independientemente de la forma de T.
cruzi (EPI o MT) o tiempo después doble infección
(2, 24 y 72 h), alrededor del 15% de L.
amazonensis. Los PV también albergaban al menos
un parásito T. cruzi (Fig. 2A).
• Las formas móviles de T. cruzi se
diferencian en amastigotes Se forma
dentro de las vacuolas fagolisosomales.
Para investigar si Los PV de L.
amazonensis apoyarían la diferenciación
de T. cruzi formas intermedias en
amastigotes, rastreamos formas
intermedias de T. cruzi, que se encuentran
dentro de PV quiméricas, mediante
imágenes multidimensionales.
• Los amastigotes de T. cruzi dentro de los PV quiméricos aumentan
en número durante la coinfección con L. amazonensis. Para
cuantificar el número de formas de amastigote de T. cruzi presentes
dentro de las vacuolas quiméricas en períodos de tiempo más
largos después de la coinfección, empleamos el mismo protocolo
de coinfección usando BMDM que se puede cultivar para varios
días in vitro. Teniendo en cuenta solo los macrófagos coinfectados,
cuantificamos el número de metacíclicos, intermediarios, formas de
amastigote y tripomastigote dentro y fuera de las PV de L.
amazonensis hasta 7 días después de la coinfección con formas
metacíclicas marcadas con T. cruzi GFP (Fig. 5A)
DISCUSIÓN

• La coinfección con patógenos no virales proporciona una herramienta adicional para

investigar los paradigmas de monoinfección.
• Utilizando imágenes multidimensionales y parásitos que expresan constitutivamente
proteínas fluorescentes, se registro no solo el paso de formas metacíclicas de T. cruzi a L.
amazonensis sino también su diferenciación en formas redondas sugestivas de
amastigotes. Durante la adquisición de imágenes, se evidencio la multiplicación de estas
formas similares a amastigotes en algunos casos y no registramos su escape de las PV
de L. amazonensis al citosol de los macrófagos, lo que sugiere que esta característica particular
de la infección intracelular por T. cruzi depende de un PV específico del parásito.
• Otro hallazgo interesante del presente modelo de coinfección fue la demostración de que un compartimento
intracelular de tipo fagolisosomal que es donde se produce la diferenciación de formas metacíclicas en
formas amastigotas de T. cruzi . Sin embargo, la forma exacta de desarrollo de T. cruzi que escapa de la
vacuola y si la diferenciación tiene lugar en la vacuola transitoria o en el citosol sigue siendo controvertida.
• Las imágenes obtenidas se pudieron reflejar en la el manejo de las técnicas de microscopia que a diferencia
de proceso in vitro el microscopio es el que nos permite observar todo aquello que con el estudio queremos
comprobar. Las tres técnicas usadas son complemento una de la otra es decir; la técnica confocal permite la
obtención de imágenes con alta resolución tanto de muestras fijadas como vivas con la posibilidad de
realizar reconstrucciones 3D; la técnica de barrido permite diferentes modos de operación (alto y bajo
vacío; ambiental, STEM) y la realización de espectroscopia de Rayos X (EDS); y la técnica de transmisión,
que permite la observación de muestras en preparados ultrafinos y en suspensión. Cada la técnica permitió
detallar de cada parte de la célula en este caso la vacuola y dentro de esta las formas parasitarias de interés
para la investigación.
REFERENCIAS:

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• Gracias.