UNIVERSIDAD NACIONAL DE

MOQUEGUA
TITULO: “AISLAMIENTO DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS A PARTIR DEL
TRACTO DIGESTIVO DEL LECHÓN”

AUTORES :Héctor Sánchez Suarez , Fredy Fabián Domínguez , Gloria Ochoa Mogollón , Rubén
Alfaro Aguilera

CURSO:
Biotecnología
DOCENTE:
Dr. Hebert Hernan Soto Gonzales
ESTUDIANTES:
Noemi Esther Escobar Ferro
Jhoselin Shantal Alarcon Mamani
Maria Fernanda Anayhuaman
Rosalinda Apaza Apaza
Ruth Mayra Apaza Foraquita
CICLO:
VII Ciclo
FECHA Y LUGAR:
19-10-2021, Ilo
 METODOS

SEMBRADO Y PURIFICADO

PURIFICADO EN AGAR MAN

,ROGOSAY SHARPE (MRS)

IDENTIFICACION MOLECULAR DE
LAS BACTERIAS

METODO. SECUENCIA GEN 16S

ARNr
LACTOBACILLUS JOHNSONII,
IDENTIFICACION 4 ESPECIES LACTOBACILLUS BREVIS,
ENTEROCOCCUS HIRAE Y
PEDIOCOCCUS
PENTOSACEUS.
 AISLAMIENTO DE IDENTIFICACIÓN MOLECULAR MEDIANTE SECUENCIACIÓN DEL GEN
BCATERIAS NATIVAS 16S ARNR
Se seleccionó un lechón de 28 días de
edad (destetado a los 21 días). Extracción de ADN Análisis por PCR
Se utilizó el método rápido de ebullición
Anestesiado vía endovenosa, con dosis de
para plásmidos pequeños de Escherichia El perfil de
3 mg/k pv de ketamina para realizar una La técnica de PCR
coli. la PCR
laparotomía.
Las cepas seleccionadas fueron sembradas
Se tomaron muestras con hisopos estériles a partir en tubos de vidrio con 10 ml de caldo MRS Las
de la mucosa epitelial del estómago, intestino e incubadas a 37 ºC por 24 h. para se
reacciones de PCR
delgado, intestino grueso y ciego. Se tomó 1.2 ml de la suspensión
bacteriana en un microtubo de 1.5 ml y se
Conservados en tubos cónicos conteniendo caldo de centrifugó a 6160 g durante 2 min,
Man, Rogosa y Sharpe (MRS) pH 6.5, y fueron
se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet Amplificar la Realizó en un
trasladas en cadena de frío al laboratorio.
de células con 500 µl de solución PBS 1X estéril y, región 16S ARNr termociclador
Se realizaron diluciones seriadas hasta 20-2 y fueron luego, centrifugado a 6160 g por 1 min.
sembradas por superficie en placas Petri con agar
Se eliminó el sobrenadante y se agregó 200 µl de se
MRS pH 6.5 e incubadas a 37 °C por 48 h.
solución STET y 10 µl de lisozima. Se incubó en
baño de agua térmico a 100 °C por 45 a 55 s y se
Se aisló un total de 19 cepas bacterianas. La evaluación de
colocó sobre hielo. Realizaron en
las características fenotípicas permitió seleccionar cuatro
cepas para su identificación molecular fueron conservadas Finalmente, el pellet de ADN fue disuelto con 200 µl de mezclas
en tubos con agar MRS inclinado a 4 °C y congeladas a -20 °C solución TEa 65 °C. Las muestras fueron conservadas a de 25 µl
en caldo MRS suplementado con 30% de glicerol. -20 °C hasta su utilización.
 Secuenciación de los productos

Se utilizo 10µl (microlitros) de los productos obtenidos por

amplificación en la PCR que fueron coloca (Reacción en
Cadena de la Polimerasa) dos en microtubos de 0.2 ml.

Se preparo microtubos de 0.2 ml con porciones de 5 µl de

cada cebador universal para el gen 16S ARNr.

Continuamente se empacaron y la secuenciación de las dos

cadenas de cada producto amplificado fue hecha por
Macrogen, EEUU.

Las secuencias de ADN fueron alineadas con el software

libre MEGA 5 y comparadas con las secuencias de 16S ARNr

Las secuencias de ADN fueron alineadas con el software

libre MEGA 5 y comparadas con las secuencias de 16S ARNr
con la base de datos GenBank mediante el software libre
BLAST.