Seminario Nº3
INTRODUCCIÓN
Papilación: capacidad de formar microcolonias
en al superficie de una colonia parental
Ensayo de papilación → método
poderoso
Se puede combinar con Tn o
screning de una biblioteca de
genes.
Ensayo de papilación basado en utilización de lac →
no es aplicable para organismos que no la utilizan
como sustrato de crecimiento.
Desarrollo de un ensayo de papilación
combinado con la mutagénesis de
transposones en Pseudomonas putida
que permite identificar genes que
influyen en la tasa de mutación.
Entre ellos:
● truA → homólogo de ARNt
pseudouridina sintasa
● mpl →
UDP-Nacetilmuramato-alanina
ligasa
● gacS → híbrido multisensor
histidina quinasa
 RESULTADOS
Construcción y optimización del ensayo de papilación para la detección
de mutaciones en colonias simples de P. putida

Cassette.
Gen lsc-3. Pseudomonas syringae pv tomato
Genes lacI y lacZ (β-galactosidasa) de E.coli

Inserción en P. putida PaWa85

por mini-Tn5 o mini-Tn7
PaWlac-lsc5 / PaWlac-lsc7

Inactivación del represor LacI, para activar Lsc3. Medio sacarosa y X-gal.
Levansucrasa (Lsc3): ↑ afinidad por la sacarosa. Hidroliza Activados Lsc3 y LacZ
en glc y fru y polimeriza fructanos: levanos. Detección 👀en la superficie de
las colonias
 👀 Cada papila corresponde a un evento mutacional independiente en una colonia y puede
ser útil en la identificación de genes involucrados en la frecuencia de mutaciones

PaWlac-lsc5 - ↓ tasas espontáneas de mutación

wt PaWlac-lsc5
P. putida PaW85 azuladas
claras

PaWlac-lsc5 PaWlac-lsc5 defectivas en

MMC (mitomicina) mutS.
↓nº de colonias Colonias irregulares y
Permite el monitoreo varias papilas en la
de daños exógenos del superficie
DNA
 RESULTADOS
Construcción y optimización del ensayo de papilación para la detección
de mutaciones en colonias simples de P. putida

Visibles el 3er día ↓ de papilas

Dependencia Rango: 10 papilas/1000 Leaky transcripción
Nº papilas / Nº colonias colonias del casette
↑/ ↓
 RESULTADOS
Identificación de los genes que afectan la frecuencia de
mutación en P. putida

Cepa PaWlac-lsc5. 27.000 mutantes de transposones

918 colonias que formaron una o más papilas al día 6. Estudio secundario para observar apariencia de Rif r y mutantes Suc+
351 pasaron el estudio secundario
327 lograron identificar la localización del Tn5

VER TABLA 2, PAG 47

34 genes diferentes fueron el objetivo del mini Tn5

 RESULTADOS
Identificación de los genes que afectan la frecuencia de
mutación en P. putida

Destacables. Confirma que

el diseño del test es capaz
de encontrar los genes que
afecta la frecuencia de
mutación
Validación del aumento de la mutagénesis
en el transposón de P. putida mutantes

La frecuencia del mutante Rifr

reveló un aumento
estadísticamente significativo
en 10 mutantes derivados de
transposones estudiados:
hemY, mpl, speA, ttg2B,
PP1261, gacS, prc, PP1780,
truA y motB2
Validación del aumento de la mutagénesis
en el transposón de P. putida mutantes

Si bien Mpl afecta los procesos

mutagénicos tanto en crecimiento como en
fase estacionaria en P. putida, GacS influye
en la mutagénesis, particularmente en
poblaciones en fase estacionaria.
 Resultados
La mutación de truA aumenta en gran medida la
frecuencia de mutación en fase de crecimiento;
mientras que la deficiencia de gacS también lo hace,
pero de manera menos significativa.

La mutación de truA disminuye ligeramente la

acumulacion de revertantes Phe+ en celulas en
estado estacionario; mientras que la deficiencia de
gacS aumenta (10 veces más) la acumulacion de
revertantes Phe+.

Confirmación de los genes que afectan la

frecuencia de mutación
 Se observó la formación de papilas en las cepas
ambientales analizadas, lo que indica que el
ensayo de papilación en estudio puede ser
aplicado a otros tipos de Pseudomonas.

Aplicación del ensayo de papilación en otras Pseudomonas

 P. aeruginosa P. aeruginosa
PAO1lac-lsc7 PAO1lac-lsc7 ΔuvrD

Se observa la
formacion de papilas

Este resultado confirma que el ensayo de papilacion en estudio puede aplicarse

para monitorear la frecuencia de mutaciones en distintas cepas de Pseudomonas.

Aplicación del ensayo de papilación en otras Pseudomonas

● Ventajas de las Levansucrasas presentes en varias especies de Pseudomonas. Aplicable a aquellas que no.
● Combinación de lsc-3 y lacZ como reporteros bajo el control del represor lacI y Ptac
● Detección de 76 sitios diferentes dentro del gen lacI y la secuencia del operador lac, utilizando el cassette
cromosómico lacI-Ptac.
● Fácil 👀. Cada papila refleja una mutación independiente.
● Detección de colonias en las cuales la frecuencia de mutación ha aumentado y puede ser utilizada para nuevos
mutadores.
● El nº papilas resultantes de mutaciones en lacI son influenciadas por la posición cromosómica del cassette → La
frecuencia de las mutaciones son afectadas por la posición de los genes diana.
● Día 6 en adelante, el nivel basal de mutaciones ha alcanzado un punto que distorsiona la detección y selección de los
mutantes por transposones. Hasta 800 UFC - 6 días.
● ↑ tasa de mutación se correlaciona ↑ nº de papilas. Mutagénesis exógena (MMC - mutS) y las cepas mutadoras
deberían dar como resultado ↑ papilas.
● No todas las las mutS- formaron papilas. El screening de transposones mutantes puede perderse potenciales
mutadores

DISCUSIÓN
Ensayo de papilación en Pseudomonas putida
● Identificar la inserción de Tn en 327 genes.
● ⅓ de los genes fueron repetidamente atacados, pueden influir en la frecuencia de mutación.
● La pérdida de actividad de RpoS afecta la tasa de mutación. Trabajos anteriores, RpoS- de P. putida
exhiben elevados niveles de sustituciones de base durante la inanición debido a la sensibilidad al
daño oxidativo.
● La inactivación de truA y mpl, durante la fase de crecimiento exponencial, aumentó notablemente
la frecuencia de mutación.
● La inactivación de gacS y mpl, durante la fase estacionaria de crecimiento, aumentó notablemente
la frecuencia de mutación.
● La deleción de truA afecta la mutagénesis solo en crecimiento exponencial, pero la inactivación de
gacS tiene un mayor efecto en células hambreadas.

DISCUSIÓN
Análisis de los genes candidatos y su posible desempeño en la mutagénesis
● Debe optimizarse una apropiada concentración de sacarosa y un tiempo de incubación.

P. aeruginosa P. aeruginosa
PAO1lac-lsc7 PAO1lac-lsc7 ΔuvrD

● Sólo después de la deleción de los genes uvrD comenzaron a aparecer colonias.

● La diferencia entre las tasas de mutación naturales y artificiales pueden ser el resultado del
estrés ambiental.

DISCUSIÓN
Aplicación del ensayo de papilación en otras Pseudomonas
 Conclusión
● El nuevo ensayo de papilación en Pseudomonas permite monitorear la
frecuencia de mutación en todas las etapas de crecimiento bacteriano.

● Revelar genes que afectan la mutación en P. putida, como así también

en otras Pseudomonas.

● Estudios posteriores de moduladores de la mutagénesis ayudarán a

revelar las adaptaciones genéticas de las bacterias, así como también
comprender a la mutación como una fuerza importante de la evolución