MEJORAMIENTO GENTICO DE LA CARAOTA Subproyecto Estudio y aplicacin de microorganismos tipo biofertilizante: Micorrizas Arbusculares y Rhizobium como una estrategia

para incrementar la productividad de Phaseolus vulgaris en suelos cidos

Marcia Toro y Edith Mora Facultad de Ciencias Universidad Central de Venezuela

La caraota (Phaseolus vulgaris) es una leguminosa alto inters comestible en los pases tropicales. Las plantas de la familia Leguminosae poseen la particularidad de asociarse con bacterias gram negativas de los gneros Rhizobium y Bradyrhzobium en estructuras denominadas ndulos ubicadas en la raz.

Ello permite captar el N2 atmosfrico y transformarlo en formas asimilables para la planta, constituyendo un importante mecanismo para la nutricin del N

Tambin se asocian con Micorrizas Arbusculares (MA), simbiosis conformada por hongos Zigomicetes que habitan en el suelo y que suministran a la planta P gracias a la ex tensa red de micelio del hongo que se extiende fuera de la raz

Cortesa Prof. Jos Miguel Barea Estacin Experimental del Zaidn

Las leguminosas conforman un interesante grupo de plantas con la particularidad de poseer una simbiosis tripartita: la planta, Rhizobium y MA, que le garantiza la nutricin de dos macronutrientes escenciales: N y P; de all que estos micoroorganismos se conozcan como biofertilizantes.

El inters sobre sta simbiosis y su interaccin con Micorrizas Arbusculares se acenta en suelos poco frtiles como los mencionados, pues la captacin del N a travs de la bacteria Rhizobium constituye un proceso altamente costoso para la planta desde el punto de vista metablico (una molcula de N2 fijada requiere de unas 20 molculas de ATP).

Este costo se vera compensado con la asociacin con MA, especializadas en captar P en suelos poco frtiles.

Rhizobium y MA para mejorarn el estado nutricional de la planta en suelos cidos

de baja fertilidad como los predominantes en Venezuela, de acuerdo a su habilidad competitiva para colonizar la raz de la planta ms eficientemente que otros componentes de la microbiota del suelo.

Por lo tanto es importante la caracterizacin y la colonizacin rizosfrica por los microorganismos seleccionados para determinar el destino de stos cuando son introducidos en el suelo.

En los estudios con Rhizobium:

El uso de metodologas alternativas como las basadas en la aplicacin de isoenzimas: -esterasa malato deshidrogenasa Sorbitol deshidrogenasa para la determinacin de relaciones genticas Arabinosa deshidrogenasa entre los distintos Rhizobium, o en el desarrollo Glucosa 6-P deshidrogenasa de metodologas bioqumicas y Fosfoglucomutasa moleculares para detectar diferencias Superxido dismutasa genmicas intrnsecas entre las cepas Leucina aminopeptidasa estudiadas. Prolina aminopeptidasa

El anlisis de las isoenzimas a travs de la electroforesis herramienta valiosa en estudios de gentica de poblaciones de bacterias, plantas y hongos

En micorrizas ha permitido:
* La separacin de proteinas fungicas de la Ectomicorriza Pisolitus-Eucalipto * Deteccin de isoenzimas especficas de plantas: fosfatasa cida y alcalina en races micorrizadas * Estudios de gentica de poblaciones en ecto y endomicorrizas * Identificacin de diferentes simbiontes en endo y ectomicorrizas

Metodologa con potencialidades para el estudio de la relacin planta-hospedero a niveles bioqumicos y ecolgicos

Para la identificacin de la colonizacin por micorrizas el anlisis por isoenzimas permite identificar la presencia de uno ms hongos en conjunto. El anlisis de las enzimas Peptidasa (PEP), Glutamato oxaloacetato

transaminasa (GOT) y Esterasa (EST) en el hongo y la planta se identificaron diferencialmente en races colonizadas no (Rosendahl & Hepper,
1987). En estudios de microcosmos el anlisis isoenzimtico permiti verificar que hongos MA ya inoculados prevenan de forma efectiva la colonizacin de otro hongo introducido. Rosendahl (1992) logr separar los componentes proteicos del hongo y de la planta y estudiarlos por separado por la posterior aplicacin de la electroforsis.

En este proyecto nuestro inters se centra en los siguientes aspectos:

1) Aislar y caracterizar cepas de Rhizobium afines a Phaseolus vulgaris nativas de suelos cidos 2) Aislar y caracterizar especies de hongos de MA afines a Phaseolus vulgaris y nativos de suelos cidos 3) Establecer combinaciones de ambos simbiontes: Rhizobium y MA y evaluar la mejor combinacin en parmetros fisiolgicos como: altura, produccin de materia seca, contenido de N y P y la produccin de uredos y alfamidas. 4) Detectar isoenzimas especie-especficas inducidas por Rhizobium y/o MA para utilizar como marcadores bioqumicos. 5) Estudiar los patrones isoenzimticos de las plantas de P. vulgaris que puedan ser utilizados para el seguimiento del estado y actividad de los biofertilizantes seleccionados.

RESULTADOS

Resultados: Caracterizacin de las cepas de

Rhizobium
Cepa
CENIAP 002 CENIAP 005 CENIAP 008 CENIAP 018 UCV 001 UCV 002 UCV 003 CIAT 899

Cantidad de goma
Intermedia Intermedia Escasa Abundante Abundante Abundante Abundante Abundante

Textura
Elstica Cremosa Seca Cremosa Cremosa Cremosa Cremosa Cremosa

Forma
Redondeada Redondeada Plana Redondeada Redondeada Redondeada Redondeada Redondeada

Apariencia
Brillante Brillante Opaca BrillanteTranslucida BrillanteTranslucida BrillanteTranslucida BrillanteTranslucida BrillanteTranslucida

Observacin de las cepas en el medio de crecimiento ELMARC Todas las cepas viraron el medio al color amarillo indicando capacidad de acidificar el medio. La prueba de la leche tornasolada confirm su pureza.

Resultados: Caracterizacin de las cepas de

Rhizobium

Debido a que varias de las cepas de Rhizobium provienen de zonas con caractersticas edficas similares y la caracterizacin morfolgica no es suficiente para diferenciarlas a nivel de especie se procedi a realizar la determinacin de la variabilidad gentica de las cepas con tcnicas moleculares. Se aplic la metodologa de Polimorfismos de ADN amplificados aleatoriamente (RAPDs), utilizando los siguientes primers: OPA, PB, PC, OPE, OPF, OPJ, OPM, OPP y PJ

A = Amplific el primer --- = No Amplific el primer

Resultados: Caracterizacin de las cepas de

Rhizobium
Cep / Prim e CE N2 CE N5 CE N8 CE N18 UCV 001 UCV 002 UCV 003
CIA T 899

OPA
2

PB 9 17 06 ----A --------A ------A ----07

P C

OP E

OPF 12 1 4

OPJ 01 02 4

OPM 05 06 20

OPP 0 1 07

PJ 03

4 A ----A

13

02

A A A

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Resultados: Seleccin de cepas de Rhizobium

Slo algunas de las cepas ecotipos amplificaron con algunos primers: OPA, PB y PC

Los resultados no son concluyentes pues habra que probar con otros primers que permitan una mejor amplificacin y as tener ms herramientas para la separacin de los ecotipos. Se continu el trabajo con las cepas de Rhizobium ya sealadas

Resultados: Seleccin de variedades de

Phaseolus vulgaris
Espectro de Luz Visible
1,6

1,4

1,2

1 Cep M2 0,8 Cep M5 Cep M8 0,6 Cep M18 Cep M45 Cep UCV 1 0,2 Cep UCV 2 Cep UCV 3 0 400 420 440 460 480 500 L on g i t u d de On da ( n m ) 520 540 560 580 600

0,4

El promedio de longitud de onda en el que presentaron la mayor absorbancia la mayora de las cepas es 420 nm en el barrido espectral

Resultados: Seleccin de variedades de

Phaseolus vulgaris
450000
Cp 1 Cp 3

400000
y = 2E+06x + 5349,7 R2 = 1 Cp 1 0 Cp 1 7

350000
Cp 1 9 Cp 21

300000 UFC ml-1 250000 200000 150000

y = 322532x + 22005 R 2 = 0,9992

y = 225273x + 1 9228 R 2 = 0,9997

100000 50000
y = 361 23x + 1 6,6 01 R 2 = 0,9927 y = 491 86x + 7097,8 R 2 = 0,9992

-0,1000

0 0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0,8000

Para los organismos unicelulares es proporcional la relacin entre el nmero de colonias y las unidades fotomtricas, por lo cual la turbidez puede utilizarse como un sustituto para otros mtodos de contajes.

Absorbancia

Curvas estndar de las cepas

Resultados: Seleccin de variedades de

Phaseolus vulgaris
Se seleccionaron las siguientes variedades de Phaseolus vulgaris: Selec. 13 Selec. 07 MGM 08-02-044 Lnea 140 Salih Tacarigua MGM 01-98-016 DOR 500 Colombia

Siete variedades en total a las que se realizar inoculacin cruzada con todas las cepas de Rhizobium sealadas

Resultados: Seleccin de cepas de Rhizobium

Cepa\ Variedad CENIAP 002 CENIAP 005 CENIAP 008 CENIAP 018 UCV 001 UCV 002 UCV 003 CIAT 899 Sin Rh Sin N Sin Rh + N Sele. 13 Sele. 7 MGM 0802-044 DOR 500 Colombia Lnea 140 Salih Tenerife MGM 01-98016

Resultados: Seleccin de cepas de

Rhizobium

Ensayo de variedades de Caraota en la cmara de crecimiento

Una vez desarrolladas las plantas por un lapso de 6 semanas, se cortar el vstago y se determinar el contenido de Nitrgeno total, N y peso de ndulos, y contenido de ureidos para cuantificar la eficiencia de las cepas en la fijacin biolgicas del N2

FASE EN EJECUCIN

Se seleccionaron las especies de hongo de micorriza arbuscular a inocular en la fase siguiente a la caracterizacin con Rhizobium

Acaulospora mellea Scutellospora heterogama

Tpicas de suelos cidos de sabana