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El café es uno de los productos alimenticios más importantes del mundo, el intercambio comercial
que consisten casi en su totalidad de las variedades Arábica y Robusta. El primero se considera de
ser de calidad superior y por lo tanto provoca un precio superior. Métodos para diferenciar estas
especies de café podrían llegar a ser beneficioso para la detección de la adulteración ya sea
deliberada o accidental. Este estudio describe un enfoque de la genética molecular para
diferenciar granos de café de procedencia Arábica y Robusta. Este emplea un polimorfismo de
longitud del fragmento de restricción de la reacción en cadena de polimerasa para supervisar un
solo nucleótido poli-morfismo dentro del genoma cloroplástico. Muestras fueron analizadas con
un sistema de electroforesis capilar de lab on a chip. . Este emplea una cadena de la polimerasa
Fragmento de Reacción-polimorfismo de longitud de restricción para supervisar un polimorfismo
de nucleótido único en el genoma cloroplástico. Las muestras fueron analizadas con un sistema de
electroforesis capilar lab-on-a-chip. Mezclas de polvo de café se analizaron con esta técnica,
mostrando un 5% límite de detección. El número de copias de plástidos se encontró a ser
relativamente constante a través de una amplia gama de muestras de granos, lo que sugiere que
esta metodología se puede emplear también para la cuantificación de cualquier adulteración de
Arabica con granos de Robusta.
INTRODUCCION
La tergiversación deliberada de los ingredientes de los alimentos en las etiquetas del paquete del
producto es un problema potencial en la industria alimentaria. Como resultado, los forenses de
alimentos es una disciplina emergente que tiene como objetivo garantizar la autenticidad de los
productos alimenticios al mando de un precio superior (1). Uno de ellos es el café, que es uno de
los alimentos básicos más importantes en el comercio mundial. Esto es principalmente debido a su
consumo mundial y la producción masiva mundial total, que ascendió a un promedio de
producción anual de aproximadamente 106 millones de bolsas para la campaña agrícola de
2005/2006 (2). El café también hace una contribución significativa a la economía de muchos países
en desarrollo. La auto polinización, alotetraploide Coffea arabica y Coffea diploide canephora
Pierre (Coffea robusta) representan las dos especies más importantes comercialmente. El primero
es considerado por proveer café de calidad superior y contribuir a > 70% de la producción mundial
de café (3, 4). Por lo tanto, cafés Arábica se venden en ~2-3 veces el precio de los Robustas, debido
a su sabor más fino y mejor calidad (5). Por lo tanto, hay razones económicas serias para exigir
garantizarse que la autenticidad de café. La adulteración de café puede ocurrir en varios pasos en
la cadena de producción del-campo-a-la-taza, y como resultado ambos granos verdes y tostados
además de café molido, necesitan ser autenticado. Empresas que asan requieren genuinos granos
verdes, mientras que los minoristas deben autenticar productos finales como los granos intactos o
granos molidos.
La mayoría de los enfoques analíticos actuales para la discriminación de los cafés Arábica y
Robusta surgen desde el área de la química analítica / instrumentales. En particular, algunos
Materiales y Método
Material de Café: Material de café. El material de café utilizado en este estudio fue judías verdes
Arábica y Robusta de diversos orígenes geográfico (Tabla 1), amablemente proporcionados por
Mercanta Ltd. "Los cazadores de café" (Londres, Reino Unido). Las muestras 1 y 2 se utilizaron
para la mezcla de Arábica y Robusta.
Extracción de ADN y Cuantificación. Se molieron habas verdes (Fruto y semilla comestible de esta
planta) (20 g) en una máquina de fresado (Glen Creston Ltd., Stanmore, Reino Unido) utilizando
una malla de 2,0 mm. Para el análisis de las mezclas, los polvos de grano de café verde que
contiene 1, 5, 10, 30, y 50% de Robusta fueron preparados en un fondo Arábica (CALIDAD). Se
extrajo el ADN de una muestra de 150 mg de polvo utilizando el kit de extracción de ADN
GENESpin (GeneScan Analytics GmbH, Freiburg, Alemania) según las instrucciones del fabricante.
Muestras de ADN extraído, 5µL de cada ADN, se mezclaron inicialmente con SYBR Green I
(Molecular Sondas-Invitrogen Corp., Paisley, Reino Unido), y después de una electroforesis en gel
de agarosa al 1,0%, que se analizaron con un fluoro-S Multi-Imager (Bio-Rad Laboratories,
Hertfordshire, Reino Unido). Lambda sin cortar de ADN (Promega Corp., Southampton, Reino
Unido) en varias concentraciones conocidas también se utilizó para la cuantificación de las
muestras de ADN.
PCR-RFLP Metodología: PCR se realizó en 5.0 µL de 10 x tampón AmpliTaqGold, 5.0 µL( Microlitro)
de 25 mM MgCl2, 1,0µL (Microlitro) de mezcla de dNTPs (10 mM cada uno), 1,0 µL (Microlitro) de
AmpliTaqGold polimerasa (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido), 1,5 µL (Microlitro) (10
pmol) de cada cebador coffea1 (MWG-Biotech GmbH, Ebersberg, Alemania) (Tabla 2), y ~ 40 ng de
ADN genómico total y se hizo hasta 50 µL (Microlitro) volumen final con agua libre de nucleasa
(Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido) .
PCR en tiempo real: A-PCR en tiempo real se realizó en un ABI Prism 7700 detector de secuencia
(Applied Biosystems, Warrington, UK). Las muestras de ADN fueron amplificadas utilizando ambos
cebadores de PCR específicos nucleares y cloroplásticos en reacciones separadas por duplicado.
Cada reacción contenía 12.5µL de 10 mezclas de corriente × SYBR Green maestro (Applied
Biosystems, Warrington, Reino Unido), 24:03(0.3 pM) de cada cebador (Tabla 2), y ~ 5 ng de ADN
genómico total y se corrió bajo predeterminados estándar condiciones de PCR, que fueron 50 ° C
durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, y luego 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1
min. Muestras de ADN genómico agrupados se realizaron por triplicado para generar una curva
estándar para cada par de cebadores PCR. Los datos se analizaron a continuación con detector de
secuencia v. 1.7 software (Applied Biosystems), y las concentraciones relativas se calcularon de
acuerdo con las instrucciones del usuario. El análisis estadístico entre muestras Arábica y Robusta
se realizó con la prueba de t (dos muestras suponiendo varianzas iguales) en Microsoft Excel.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis del Objetivo cloroplásticos: Una sección de 251 pb de cloroplástico trnL (UAA) -trnF
(GAA) intraspacer región, que contiene el sitio de endonucleasa de restricción PsuI, se amplificó
usando cebadores coffea1 (Tabla 2) y las plantillas de ADN extraído de muestras de granos de café
verde que se enumeran en la Tabla 1. Estos cebadores fueron diseñados de tal manera que el sitio
de restricción PsuI estaba situado asimétricamente dentro del amplicón de manera que, en
presencia de un sitio de restricción intacto, digestión con PsuI daría lugar a dos fragmentos de 92 y
159 pb, respectivamente. Los amplicones se purificaron y se sometieron a digestión con PsuI, y los
fragmentos resultantes se analizaron por electroforesis en gel de agarosa estándar. Los resultados
se muestran en la Figura 1. Todos los cafés Arabica probados dieron un solo producto de ~251 pb,
lo que indica que, como se esperaba, el sitio de restricción PsuI ha sido interrumpido por el SNP.
FIGURE 1 :electroforesis en gel de agarosa de PCR-RFLP de trnL cloroplástico (UAA) -trnF (GAA)
intraspacer región desde varias C. arabica y C. cultivares canephora. Cada número corresponde al
cultivar enumerados en la Tabla 1: Las muestras de Robusta (carriles 1 y 7); Muestras de Arábica
(carriles 2-6, 8 y 9); (carril L) 100 escalera pb.
Sin embargo, se debe tener cuidado para aplicaciones futuras porque C. canephora cultivares
pueden haber contribuido en el pasado a la producción de algunas variedades Arábica de
importancia comercial (23). Si el donante femenina era una C. canephora durante la última retro
cruzamiento, entonces el chlorotype es probable que difiera de la de Arábicas tradicionales. Por lo
tanto, una confirmación adicional del chlorotype en cultivos de Arabica individuales es necesario
antes de que éstos podrían ser incluidos en cualquier análisis discriminatorio. Arábica y Robustas
las muestras 2 y 1, respectivamente, se seleccionaron para su posterior análisis (Tabla 1). Los
perfiles de PCR-RFLP de estas dos variedades puras también se analizaron mediante la
electroforesis capilar tecnología lab-on-chip (Figura 2). En este caso, el Arabica genera una única
banda de alta intensidad que corresponde a una longitud de 251 pb, mientras que el Robusta
mostró dos picos correspondientes a los 92 y 159 pb RFLP de PCR de producto. A 50:50 mezcla de
Arábica y Robusta amplicones también fue sometido a la digestión de restricción y el
electroferograma resultante mostró tres picos claros. Estos, cuando se analizaron utilizando el
software experto 2.100, esta mezcla dio una proporción de 50:50 para Arábica / Robusta,
indicando así la aplicación potencial de esta tecnología para discriminar y cuantificar mezclas de
café.
Para tener en cuenta la diferencia en el estado de ploidía de las muestras Arábica y Robusta,
número de copias de ADN de plastidios por la célula entonces se calculó multiplicando los valores
de la relación por un factor de 2 o 4 dependiendo de si la muestra de ADN se originó a partir
Robusta (2N) o Arabica (4N) de café, respectivamente (Figura 3) .Los resultados muestran que el
número de copias plastidio nucleares para las tres muestras Robusta 1, 7, y 10 eran todos ~ 2
veces mayor que la de las muestras de Arábica. Mediante la conversión de este a las copias de
ADN de plástidos por célula, como se describe anteriormente, se encontró que ambas especies
tienen el mismo número de copias de ADN de plástidos por célula (p) 0,9997), siendo 502 ( 91 y
502(40 copias para Robusta y Arábica, respectivamente . Este valor para el número de copias de
ADN de plástidos está en el extremo inferior del rango reportado para otros tejidos de la planta
(24, 25). Sin embargo, se debe aún tomar cuidado cuando se usan objetivos de cloroplastos para la
autenticación porque mientras que el número de copias que se encontró era relativamente
constante entre variedades Arábica y Robusta, había cierta variabilidad, y esto tiene que ser tenido
en cuenta cuando se requiere la cuantificación exacta de la adulteración.
Amplicones de PCR generados a partir de, ya sea puro Arábica o Robusta de ADN, se mezclaron a
varias ratios que oscilan de 50:50 a 99: 1 (Arabica / robusta) y se sometieron a restricción PsuI, y
los resultantes productos de PCR-RFLP se analizaron por electroforesis capilar lab-on-a-chip. Se
Tabla 3. Porcentaje teórico de Robusta Incluido en las mezclas Modelo frente a la experimental
como se analiza a través de la Descrito Enfoque PCR-RFLP y cuantificación de la Electroferograma
Como generada por el 2100 Bioanalyzer
Las muestras de Arábica puro y granos de café Robusta verde se utiliza para generar un polvo. A
continuación, se prepararon mezclas de Arabica / Robusta en las proporciones 50:50, 70:30,
90:10, 95: 5, y 99. A continuación, se extrajo ADN a partir de estas mezclas y se sometió a análisis
de PCR-RFLP. Perfiles Fragmento fueron detectados inicialmente a través de electroforesis en gel
de agarosa estándar (Figura 4).
Además de los dos fragmentos de corte de 159 y 92 pb y el amplicón de 251 pb sin cortar, el perfil
de PCR-RFLP también mostró picos con tiempos de retención cercano al del amplicón sin cortar.
Estos no estaban presentes cuando el amplicón originó a partir de una especie, que conduce a la
sugerencia de que es probable que sean heterodúplex, que se producen comúnmente durante las
etapas de desnaturalización y rehibridación de una amplificación por PCR de una plantilla que
consta de dos haplotipos diferentes (26) . Picos similares han demostrado que se genere en el
análisis de heteroplasmia mitocondrial (27). El tratamiento de la relación mezcla con CEL1, una
enzima que escinde dichos heterodúplex, ha confirmado esta sugerencia (datos no mostrados).
Por lo tanto, estos picos adicionales fueron excluidos de los cálculos de contenido de aditivo.
Esta metodología, como con estudio similar anterior en especies de peces (29, 30), es muy fácil de
usar, y el análisis utilizando el LabChip es sencillo y relativamente rápido de aproximadamente 60
min por 12 muestras después de la digestión de restricción paso. Esto significaría que esta
1. PCR-RFLP Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción 2.Lab-on-a-chip-Un "lab
on a chip" (LOC) es un dispositivo que integra una o varias funciones propias de un laboratorio en
un único chip cuyas dimensiones van desde solo unos milímetros hasta unos pocos centímetros
cuadrados. 3.SNP Polimorfismo de nucleótido simple
metodología puede ser adecuado para el análisis de rutina de muestras de café. Un enfoque
similar podría ser empleado para el análisis de granos tostados e incluso café molido
proporcionando que el ADN adecuado para PCR-RFLP se puede extraer de estos productos. Hay
una fuerte posibilidad de que el procesamiento del grano, ya sea a través de calcinación o otra
tratamientos como descafeinado, darán lugar a la degradación del ADN. Un estudio previo (31) ha
demostrado que el ADN adecuado para el análisis de PCR puede ser extraído de los granos
sometidos a diferentes niveles de tostado y de café en polvo comercial.
RECONOCIMIENTO