Cromatografía Líquida de

Alta Resolución

HPLC

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Qué es Cromatografía Líquida
de Alta Eficiencia?

• La cromatografía es un método, usado

primariamente para la separación de los
componentes de una muestra, en la cual los
componentes se distribuyen en dos fases.

• La cromatografía de líquidos de alta resolución, es

un modo de cromatografía en la cual el proceso
de separación y transferencia de masa es entre la
fase estacionaria y la fase móvil y a una
temperatura dada.

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HPLC (high performance liquid chromatography)

Se basa en los mismos principios que la cromatografía a baja presión

Tiene mejor resolución, tiempos menores, mejor reproducibilidad

El material empacado en las columnas está formado por pequeñas

partículas de tamaño muy uniforme y gran rigidez

Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presión

Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable

o vidrio grueso
Equipamiento

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Clasificación de Equipos
• Integrados: Cada una de sus partes están
reunidas en un gabinete y su intercambio o
conexión con otros componentes es difícil.

• Modulares: Los módulos son instrumentos

individuales que permiten no solo armar el
equipo según las necesidades, sino aumentar
su complejidad según esa necesidad varíe.

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Componentes principales

• Solvente
• Bomba de alta presión
• Inyector
• Columna
• Detector
• Graficador

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Partes del cromatógrafo
En el caso más simple, el cromatógrafo líquido está
constituido por:

Un reservorio de solvente que alimenta al sistema con la
fase móvil.

Un sistema para forzar el pasaje de la muestra por la
columna: Bomba.

Un sistema que permite la introducción de la muestra:
Inyector.

Un sistema de monitoreo de la solución que emerge de
la columna: Detector.

Un sistema de registro de los datos proveniente del
detector.

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Diagrama Básico de un
sistema de HPLC

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Esquema

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Instrumentation
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12
13
Principios de la separación
• Cuando la fase móvil y la muestra son forzadas
a atravesar la fase estacionaria, se presentan
diferentes tipos de interacciones: hidrofóbicas,
puentes de Hidrógeno, interacciones dipolares
y electrostáticas, éstas son responsables de la
mayor o menor afinidad de cada uno de los
componentes de la muestra por alguna de las
fases.

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Separación

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• La eficiencia de una columna cromatográfica y, por
lo tanto, su poder separativo se mide en función de
su número de platos teóricos.

• Para lograr la separación de dos componentes

dados, no sólo deben eluir a distintos tiempos de
retención, sino que el ancho de los picos debe ser
tan bajo como sea posible.

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Qué es Cromatografía
Líquida de Alta Eficiencia?
• HPLC utiliza una fase móvil líquida para
separar los componentes de la mezcla.
• Los componentes o analitos deben ser
disueltos en un solvente y se pasan por la
columna cromatográfica a altas presiones.
• La resolución depende de la interacción
entre el soluto , los componentes y la fase
estacionaria.

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Elección del Solvente – FASE
MOVIL
Características:

• Disponible comercialmente
• Precio
• Pureza y Estabilidad. En la actualidad
contamos con productos de calidad de
pureza cromatográfica. Bajo contenido de
impurezas.
• Disolver la muestra
• Miscible con otros solventes para formar
mezclas útiles

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Elección del Solvente
Características:

• No degradar o disolver la fase estacionaria

• Tener baja viscosidad para reducir las
caídas de presión
• Ser compatible con el detector utilizado.
Transparencia óptica (cuando se usan
detectores UV)
• Se prefieren solventes de punto de
ebullición intermedio.

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Tipos de solvente

MW BP I.R. UV Viscosidad µ
Name
[Debye
    [°C]   [nm] [cP]
]
Acetonitrile 41 82 1.341 195 .358 3.37
Dioxane 88 101 1.421 215 1.26 0.45
Ethanol 46 78 1.359 205 1.19 1.68
Methanol 32 65 1.326 205 .584 1.66
Isopropanol 60 82 1.375 205 2.39 1.68
Tetrahydrofuran 72 66 1.404 215 2.20 1.70
Water 18 100 1.333 185 1.00 1.84

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21
Filtración y Desgasificación de
solventes

• Las partículas pueden ocasionar costosos

daños a la bomba HPLC, al guarda
columnas, y en general causar desgaste
del sistema de HPLC. Los fabricantes de
los instrumentos tienen en cuenta este
problema y recomiendan que se filtre
( 0.45 o 0.22 micras) y desgasifique los
solventes HPLC antes de usarlos.

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Filtración y Desgasificación de
solventes
• El Oxígeno Disuelto puede producir
mayor interferencia en los detectores de
fluorescencia y electroquímicos.
• El Nitrógeno Disuelto es el otro
componente de la atmósfera que puede
producir burbujas en la columna de HPLC
y cuando el solvente entra al detector
produce picos falsos y desviaciones de la
línea base.
• El Dióxido de Carbono disuelto algunas
veces puede ser la causa de los cambios de
pH en el sistema de solvente

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Preparación de fase móvil

• Ajuste de pH, parámetro critico en la retención de

solutos ionizables ( medir antes de dosificar
modificador orgánico)
• El pH de la solución aumenta con la incorporación
de un modificador orgánico.
• A valores pH mayores de 7.5 disolución de sílice
• A pH menor a 2 se hidroliza la unión entre la sílice y
la fase enlazada.

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Bombas
Requisitos o aspectos más importantes que
debe reunir una bomba o sistema de
bombeo:
• Debe producir presiones estables hasta 6000
psi.
• Mantener el flujo libre de pulsaciones
• Generar intervalos de caudales de flujo (0,1
a 10 ml/min).

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Programación del Solvente

• Existen dos métodos de programación de Solvente

en HPLC:
•Isocrático
• Gradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso
mediante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Pueden
efectuarse de dos maneras:
• A baja presión
• A alta presión

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27
28
29
Sistemas de Inyección de
muestra
• Estos sistemas han variados durante
la historia del sistema de HPLC, en
un principio de utilizaba la inyección
de la muestra con jeringas de alta
presión cuales ya están de desuso.
Hoy se utiliza el sistema de Válvulas
inyectoras

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Sistemas de Inyección de
muestra
• Generalmente se usa una válvula muestreadora con jeringa.

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Válvula muestreadora

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 Columna
• Actualmente todas las columnas son de acero inoxidable
316 con diámetro interno de 2.6 a 3 mm o 4.6 a 5 mm ,
casi todas con un diámetro externo de ¼ de pulgada

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Fase estacionaria

• Principales parámetros de la fase estacionaria

• Tamaño de partícula: 3 a 10 µm
• Distribución de partícula : con una
desviación máxima del 10 %
• Tamaño de poro : 70 a 300 Å;
• Área superficial : 50 a 250 m2/g
• Densidad de la fase (numero de sitios
activos por unidad de área): 1 a 5 por 1
nm2

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35
La tabla que se muestra presenta los parámetros principales de algunos
adsorbentes comerciales

Área Distribución de densidad

Vporo Dporo
Nombre Sup. partícula de la fase
  ml/g Å m2/g % µM/m2
IB-Sil Phen. 0.75 125 165 5.5 2.74
Hypersil C4 (3) 0.6 300 50 2.0 4.80
Supelcosil C8 (3) 0.6 100 170 8.5 -
Spherisorb C8 0.5 80 220 6.0 2.51
Novapak C18 0.3 60 120 7.0 3.0
IB-Sil C18 0.75 125 165 11.0 3.27
Spherisorb C18 0.5 80 220 12.0 2.72
Prodigy C18 1.17 150 310 18.7 3.30
Inertsil C18 1.1 150 320 18.5 3.23
Hypersil C8 0.7 120 170 7.0 3.85
Hypersil C18 (3) 0.7 120 170 10.0 2.84
Selectosil C18 0.9 300 110 7.0 2.93
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Detección
• La eficiencia de un detector cromatográfico depende de
la relación entre la cantidad física medida y la
composición del efluente, así como también de las
características de las señal de transferida.

Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:

• Detectores basados en una propiedad de la fase móvil .
Ejemplo: Detector de Indice de Refracción
• Detectores basados en una propiedad de la sustancia a
separar.
Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector
Ultravioleta

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Detección

• Detector UV. Hay básicamente tres tipos:

• Detector de Longitud de Onda Fija

• Detector de Longitud de Onda Variable
• Detector de Arreglo de Diodos

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 Detección

• Detector de Fluorescencia.
• Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan
fluorescencia nativa o inducida por derivatización .

• Detector de Fluorescencia Inducida por Laser

• Según la Fuente de Excitación
• Según el sistema óptico

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Chromatogram
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