Química Analítica

e Instrumental
Mg. Gerardo De Lama Carrillo
Farmacia y Bioquímica
Sesión N° 15 – Semana 15
Unidad IV
Tema: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

Contenido
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
- Fase estacionaria
- Fase móvil
- Tipos de columnas
- Tipos de detectores.
Tipos de trabajo en HPLC:
- Fase normal
- Fase reversa
Ejemplos de aplicaciones.
 Logro de la unidad
Al finalizar la Unidad IV los estudiantes realizan el análisis de
los resultados obtenidos por medio de la aplicación de los
Métodos Cromatográficos de análisis químico considerando
metodologías, características de la muestra y propiedades del
analito.

Logro de la sesión

Al finalizar la sesión, el estudiante comprende y aplica la

cromatografía liquida de alta resolución al análisis químico
instrumental..
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

➢ Cromatografía de líquidos de alta eficacia

➢ Fase móvil, líquido a alta presión

➢ Fase estacionaria sólido en columnas de un

diámetro de 3 a 10 micras.

➢ Analito: líquido.

➢ Utiliza instrumentación especializada.

INSTRUMENTACIÓN
 INSTRUMENTACIÓN

RESERVORIO DE LA FASE MOVIL

▪ El reservorio es el recipiente que contiene la fase

móvil.

▪ Puede emplearse como reservorio de fase móvil,

cualquier frasco de laboratorio de buena calidad (de
vidrio, o polímero resistente), con una tapa
adecuada para prevenir el ingreso de partículas
ambientales al sistema.

▪ La capacidad del frasco depende, lógicamente, del

consumo esperado.
 INSTRUMENTACIÓN

BOMBA
▪ Las bombas de HPLC impulsan la fase móvil proveniente del reservorio de solvente hacia el
inyector y desde allí hacia la columna.

▪ Su caudal de trabajo puede ser muy variable, según la escala de trabajo escogida

CARACTERISTICAS DE LAS BOMBAS

• Caudal.- los equipos convencionales trabajan con caudales de 0.1 y 10 ml/min. y con presiones
hasta 6200 psi.

• Ruido.- se refiere a las pulsaciones que presenta las bombas de tipo reciprocante. (menor de 0.5
%).

• Deriva.- es un cambio continuo en la entrega de solvente que se produce en intervalos de

tiempos muy largo. Esto es una consecuencia de la precisión y exactitud del flujo del solvente.

• Sistemas de corte.- para cuando la presión supere los valores límites de presión tanto superior
como inferior preestablecidos.
 INSTRUMENTACIÓN

INYECTORES
▪ Es el dispositivo que permite introducir la muestra en solución, sin interrumpir el caudal de
solvente a través del sistema.

▪ CARACTERISTICAS :

o Debe ser fácil de operar.

o Debe ser inerte al ataque químico y

soportar altas presiones.

o Debe ser preciso en cuanto a la

cantidad introducida en el sistema.

o No debe provocar diluciones

importantes de la solución inyectada.
 INSTRUMENTACIÓN

Columnas HPLC

▪ Dimensión -Longitud (L) y diámetro interno (dc)

▪ Características del empaquetamiento
• Tipo - sílica o polímero
• Tamaño de la partícula (dp)
• Tamaño de poro(dpore)
• Grupo enlazado (determina el modo
cromatográfico)
▪ Materiales preferidos en la construcción del cuerpo
de la columna: Acero Inoxidable, PEEK, Vidrio
rayado
 INSTRUMENTACIÓN

Columnas HPLC

Tipo de Columna i.d. Capacidad de Velocidad

(mm) la muestra de Fluljo
(mg) (mL/min)
Semipreparativa 8-20 10-50 5-30

Analítica Estándar 4.6 1 1

Narrowbore 2.0 0.2 0.2

Microbore 1.0 0.05 0.05

 INSTRUMENTACIÓN

Columnas HPLC
 INSTRUMENTACIÓN

Columnas HPLC
Tipos de Soporte
• Silica (o alumina)
– Es el soporte predominante de LC con un excelente rendimiento.
– Los grupos silanol (Si-OH, siempre presentes en las superficies de sílica) se encuentran
típicamente enlazados con grupos silanos para modificar la superficie.
– Sus límites de pH se encuentran entre 2.5 - 8
• Soportes de materiales poliméricos (poliestireno, poliéteres, polimetacrilatos)
– Se han introducido rápidamente con una alta eficiencia
– Muy utilizada en bioseparaciones
– Amplio ámbito de pH (1-14), buena reproducibilidad y ausencia de grupos silanol.
 INSTRUMENTACIÓN
Columnas HPLC
Guía para la selección de una fase enlazada
• C18
– Fase enlazada más utilizada, retiene muy bien y es muy estable
– Las columnas C18 de diferentes vendedores tienen diferentes características de selectividad.
• C8
– Se prefiere para fases móviles con bajo contenido de fase orgánica
• C4
– Se utiliza con frecuencia para separaciones de proteínas (C18 se prefiere para péptidos)
• CN
– Tanto para NP o RP; Utilizada para algunas aplicaciones específicas (ejm. antidepresantes)
• Fenil
– Para separaciones en RP de compuestos medianamente polares y básicos, selectividad única para
aromáticos
• Amino
– Se utiliza para reemplazar la silica en separaciones por NP, análisis de azúcares.
 INSTRUMENTACIÓN

DETECTORES

El detector es la parte del equipo cromatográfico que permite “ver” y ubicar en tiempo y espacio la
posición de cada componente de una muestra a la salida de la columna cromatográfica.

CARACTERISTICAS :

• Tener un amplio rango dinámico de respuesta.

• Poseer una respuesta lineal.
• No contribuir al ensanchamiento de banda extracolumnar.
• Responder a todos los solutos.
• Tener la sensibilidad apropiada.
• Poseer una buena relación señal/ruido.
• No destruir la muestra.
• Tener una constante de tiempo baja.
 INSTRUMENTACIÓN

DETECTORES

Detector UV/Vis
• Un detector UV/Vis consiste típicamente de:
– Una fuente de deuterio (190 - 600 nm)
– Un monocromador que incluye una rejilla de difracción movible controlado por un motor paso a
paso, para seleccionar cierta longitud de onda atravez de una abertura (slit ) de salida hacia
una celda de flujo ( de 8 a 12 uL)
– Dos fotodiodos miden las intensidades de los haces de luz de muestra y referencia
• El principio del detector de absorvancia es la Ley de Beer
Absorvancia = absorvitibidad molar x paso de luz x concentración
A = e b c = - Log I / I0 ,, I0 = Intensidad de luz inicial
• Es el detector más común usado en HPLC – detección en el orden de ng
– Son importantes el ruido(noise)/deriva (drift) para la sensibilidad.
 INSTRUMENTACIÓN

DETECTORES

Detector de Fluorescencia
• Un compuesto fluorescente absorve un fotón (ej., p - p * transición electrónica) y emite un foton a
otra longitud de onda más larga.
• Fluorecencia is 100-1000 veces más sensible que un detector de absorvancia (pg de detección).

• Ambiental
PAHs: fluorescencia natural, se requiere un detector de longitud de onda programable
Carbamatos: derivatizacion post columna (OPA)
• Biopharmaceutical, Clinical
Aminas, amino ácidos: OPA, FMOC, Dansyl catecolaminas
Prostaglandinas, ácidos grasos: N-ADM
• Farmacéutica: muchos compuestos tienen fluorescencia natural y otros son “etiquetados”
• Alimentos y vitaminas
– Vitaminas A, D, E
– Compuestos “etiquetados”, drogas y residuos de pesticidas.
 INSTRUMENTACIÓN

DETECTORES

DETECTOR DE INDICE DE REFRACCION

• MIDE LA DIFERENCIA DE INDICE DE REFRACCIÓN ENTRE EL SOLVENTE PURO Y EL SOLVENTE QUE CONTIENE
LA MUESTRA .
• El IR es universal, pero tienen una baja sensibilidad (0.01 -0.1 mg) en comparación a un detector de
absorvancia.
• La detección IR es mayormente usada para componentes que tienen baja actividad cromosférica tal como
azúcares, trigliceridos, ácidos orgánicos, y polímeros.
• Require una bomba isocrática libre de pulsaciones, solventes desgasificados y horno para la columna.
 INSTRUMENTACIÓN

DETECTORES

DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS

• Este tipo de detectores permiten hacer barridos a distintas longitudes de onda de cada uno de los
componentes separados. De esta manera, se generan una colección de
cromatogramas a diferentes longitudes de onda de cada pico.

• Mediante los arreglos de diodos se puede determinar la mejor longitud de onda a la que
debe monitorearse el compuesto de interés.
 INSTRUMENTACIÓN

DETECTORES

DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS

 INSTRUMENTACIÓN

DETECTORES
DETECTOR DE
ARREGLO DE DIODOS
 INSTRUMENTACIÓN
CARACTERISTICAS DE LOS DETECTORES CROMATOGRAFICOS
 FORMAS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA
FASE NORMAL O LÍQUIDO-SÓLIDO (NP, LSC)
Separación basada en adsorción / desorción del analito en una superficie polar (sílica).

FASE REVERSA (RPC)

La separación de los analitos está basada en el coeficiente de partición entre la fase móvil y la fase
estacionaria químicamente enlazada.
 FORMAS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA

FASE NORMAL O LÍQUIDO-

SÓLIDO

• Utiliza fases estacionarias como

sílica, alumina, amino-, ciano o
grupos fenilo químicamente
enlazados.

• Fase móvil no-polar como hexano,

CH2Cl2 con propano.

• Los analitos polares presentan

tiempos de retención largos.

• Excelente técnica para analitos no-

polares, isómeros, separaciones de
grupos y procedimientos de limpieza
de muestras.
 FORMAS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA

FASE REVERSA
• Separación basada en la partición de
un analito dentro de una fase
estacionaria hidrofóbica químicamente
enlazada sobre un soporte de sílica
(ejm, c18, c8).
• Usa una fase móvil polar como por
ejemplo un mezcla metanol /
acetonitrilo. Los analitos polares
eluyen primero mientras los no-polares
son más retenidos por la fase
estacionaria.
• Modo cromatográfico más
ampliamente utilizado (>60% de las
aplicaciones).
• Para analitos polares (solubles en
agua), medianamente polares y
algunos cuantos no-polares.
 APLICACIONES

SISTEMAS DE GRADIENTES
 APLICACIONES
Problema
Para determinar el contenido de serotonina (5-OH triptamina) en una muestra se realiza el
correspondiente análisis de la siguiente manera: se toma 1 mL de la de la muestra y se le añade 1
mL de una disolución que contiene 30 ng de N-metil serotonina. La disolución obtenida se trata para
eliminar las interferencias, se extraen el analito y el patrón interno mediante extracción en fase
sólida y se inyectan 20 µL en un cromatógrafo líquido. a) ¿Por qué se añade patrón interno en la
etapa previa a la extracción? b) Sabiendo que al inyectar patrones puros (5 ng) de serotonina y N-
metil serotonina se obtuvieron, respectivamente áreas de 30885982 y 30956727, ¿cuál será la
concentración de serotonina en la muestra sabiendo que las áreas correspondientes a los picos de
serotonina y N-metil serotonina en el cromatograma de la muestra fueron 2573832 y 1719818,
respectivamente.
Solución
 Referencias

1. Skoog D, Holler F, Nieman T. Principios de Análisis Instrumental. 6ta ed. EEUU: Cengage
Learning, 2008.

2. Gary C. Química Analítica. 6ª ed., México; Limusa; 2009.

3. Skoog D, West DM, Holl J. Fundamentos de Química Analítica. EEUU: Cengage Learning; 2015.