INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

PRÁCTICA 3: DETERMINACIÓN DE
ACETAMINOFÉN EN TABLETAS POR HPLC
Químico Farmacéutico Industrial
Métodos de Separación e Instrumentación Analítica
Equipo 2
6FV2

-Flores Avilés Jorge Heriberto

-Rueda Serrano Luis Angel
-Trejo González Fernanda Yareth
 Objetivo

➢ Describir el funcionamiento y uso adecuado del cromatógrafo HPLC

➢ Llevar a cabo la identificación del principio activo Paracetamol en una forma
farmacéutica comercial sólida, mediante el tiempo de retención obtenido en
HPLC.
➢ Determinar la concentración del principio activo presente en la forma
farmacéutica proporcionada, para lo cual se utilizarán las áreas bajo la curva
obtenidas con la sustancia de referencia y muestra.
 Fundamento
Para desarrollar esta práctica nos apoyaremos en la cromatografía de líquidos de alta
presión (HPLC). Dicha técnica se desarrolla a altas presiones y es utilizada para separar los
componentes de una mezcla; consiste en una fase estacionaria no polar y una fase móvil
líquida la cual va a actuar como portador de la muestra. La eficiencia de la separación en
HPLC para un compuesto depende de la combinación correcta de las condiciones de
operación.
Clasificación

Fase Normal:

Fase Inversa:
Proceso de separación
Mecanismos de separación cromatográfica
en HPLC
Fase Reversa: Disolventes
La fase reversa generalmente consiste en agua/ solución acuosa (comúnmente solución
buffer acuosa) y un modificador orgánico.

Cuando se analizan compuestos ionizables, pueden estar presentes tampones y otros

aditivos en la fase acuosa para controlar la retención y la forma de pico
 Columnas de HPLC
Columnas de Sílica.
La sílica se usa frecuentemente como un material de soporte para adsorción
(fase normal) y con modificación química para partición (fase reversa,
intercambio iónico y exclusión por tamaño
Factores importantes
- Pureza de la sílica (especialmente de iones metálicos)
- Forma
- Tamaño de partícula
- Distribución del tamaño de partícula
Los picos con cola pueden ser causados por la activación de especies de sinalol
con iones metálicos en la sílica
 Pureza de la sílica
Presencia de iones metálicos puede causar tailing de picos
Tipos de partícula
Forma de partícula

● Silica esférica
● Sílica irregular: Es menos costosa que la esférica y también tiene menos
eficiencia
Distribución y tamaño de partícula
● Las columnas analíticas tienen tamaño de partícula de 3 a 10 um de
diámetro. Partículas grandes dan una pobre resolución
● Tamaños pequeños de partícula pueden dar altas presiones. Lo más usado
es de 3.5 a 5 um
 Tamaño de partícula
Menores tamaños de partículas son más eficientes, aunque da lugar a mayores
presiones en la columna, ayuda a disminuir los tiempos de corrida en columnas
con longitud menor

*Llamadas columnas
fast
 End Capping
Cubre grupos sinalol expuestos con cadenas cortas
de hidrocarburos después del enlace primario

Este factor reduce tailin en los picos de solutos

polares que interaccionan excesivamente con los
grupos sinalol expuestos
Fase móvil: Miscibilidad de solventes
Conocer la miscibilidad de los disolventes es muy importante sobre todo cuando
trabajamos diferentes fases como: Normal, reversa, intercambio iónico etc.
Equipo HPLC
 Adecuabilidad del sistema
El buen funcionamiento de un sistema cromatográfico (líquidos o gases) se verá reflejado en la calidad del
análisis.

Componentes del sistema

● Columna
● Velocidad de flujo
● Flujo de la fase móvil
● Temperatura de operación

Para asegurar la efectividad del sistema, es necesario realizar una prueba antes de utilizarse. La evaluación se
recomienda con la inyección por sextuplicado la solución de aptitud del sistema. Calcular el Coeficiente de
Variación (CV) del analito y se procede reportar.

● Factor de capacidad (K’)

● Resolución (R)
● Platos teóricos (N)
● Factor de coleo
 Fase Móvil: Preparación
● Pureza: Es muy importante ya que puede afectar la
sensibilidad de los análisis. Impurezas puede dar lugar al
incremento del nivel de ruido y de línea base
● Viscosidad: Solventes con baja viscosidad darán lugar a
una baja presión

Preparación

● Medir el volumen apropiado para cada solvente

● Ajustar el pH de la fase móvil, (si lo requiere) usando
buffers
● Filtrar la fase móvil
● Desgasificar la fase móvil
Compatibilidad de la membrana de filtración
y el solvente
Fase Móvil: Desgasificación
● Al eliminar el oxígeno también ayuda a prevenir la posible degradación
oxidativa de la muestra y la fase móvil
● Una burbuja puede alterar los Tr y que no sean reproducibles
● Puede alterar la fase estacionaria
 Métodos de validación
Validar un método analítico consiste en verificar y documentar su validez, es decir,
su adecuación a unos determinados requisitos, previamente establecidos por el
usuario, para poder resolver un problema analítico particular.
Requisitos que debe poseer el método (estadísticamente):
● Linealidad
● Selectividad
● Precisión
● Repetibilidad
● Reproducibilidad
● Límite de Detección
● Límite de Cuantificación
● Robustez
Tipos de Validación

Existen tres tipos de validación:

● Validación Prospectiva
● Validación Simultánea
● Validación Retrospectiva
 Sistema de suministro y almacenamiento de fase móvil
● Garantiza la disponibilidad de fase móvil al sistema en condiciones apropiadas, de
modo que se evite la contaminación y la degradación de la misma.
● La fase móvil en HPLC está formada por un disolvente o por una mezcla de ellos.
● Para evitar flujos inestables, la formación de burbujas o la interferencia de partículas
extrañas los disolventes deben estar filtrados y desgasificados.
La elución se puede realizar de dos maneras:

● Elución isocrática: cuando se emplea un único disolvente o una mezcla de

disolventes de composición constante.
● Elución en gradiente: cuando se emplea una mezcla de disolventes cuya
concentración se hace variar a largo del proceso, con el fin de modificar la
polaridad de la fase móvil y disminuir el tiempo de separación.
 Sistemas de inyección de muestra
● La inyección de un volumen de muestra preciso, y muy pequeño (5-500 μL),
debe hacerse a la entrada de la columna en un breve periodo de tiempo.
● El sistema de inyección está formado por válvulas rotatorias de alta presión de
varias vías manuales o automatizadas.
 Sistema de bombeo
Todos los sistemas HPLC incorporan un sistema de bombeo, con las
siguientes características:

● Debe ser capaz de gestionar altas presiones, de hasta 400 atm.

● Mantener un flujo libre de pulsos.
● Proporcionar caudales constantes y reproducibles.
● Permitir cambios de disolvente de modo simple y rápido.
● Ser químicamente inerte y resistente a la corrosión.
 Columnas Analíticas en HPLC
Son columnas rectas, fabricadas habitualmente de acero, aunque también se emplean
columnas construidas de vidrio y materiales poliméricos. La mayoría de ellas tienen una
longitud entre 5 y 30 cm, y su diámetro interno varía entre 3 y 10 mm.

● Precolumnas:Las precolumnas eliminan los contaminantes, la materia en suspensión y

aquellos componentes que se unen de manera irreversible a la fase estacionaria.
● Columnas termostatizadas: Calentamiento de la columna.
 Detectores en HPLC
Los tipos de detectores que podemos encontrar acoplado a un HPLC se clasifican según
el fundamento en el que se basan.

● Los detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una

propiedad de la fase móvil.
● Los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las
propiedades del soluto.
 Detectores inespecíficos

● Conductividad

● Índice de Refracción

● Constante dieléctrica
 Detectores específicos

● Absorbancia UV
● Fluorescencia
● Electroquímico
● Acoplado a espectrómetro de
masas
● Longitud de onda
Parámetros cromatográficos
Tiempo de retención (TR) y Tiempo Muerto (T0,TM)
La relación entre el tiempo muerto y el tiempo de retención se expresa en el
tiempo de retención ajustado (TR’)
Factor de capacidad (k)
Es una manera de medir la retención de un analito

K<1 Elución demasiado rápida

K>10 Elución demasiado lenta
1<K<10 Elución ideal
 Factor de selectividad (Separación) ɑ
● Se mide como la relación de los factores de retención
(capacidad) K de los dos picos de estudio.
● Valores altos de ɑ indican una buena separación
● El valor de ɑ debe ser siempre mayor a 1, sino los
indica que tiene el mismo valor de K por lo que los
picos coluyen.
● La selectividad de una separación depende de la
química del analito, fase móvil y fase estacionaria.
 Resolución Rs
Es el valor que nos permite identificar el grado de separación de los componentes

Rs>1,5 Separación ideal

1,5>Rs>1 Separación aceptable

Rs<1 Separación inaceptable

 Ecuación de la resolución
La ecuación de la resolución fundamental se ve
afectada por tres parámetros importantes

- Selectividad (Factor de separación ɑ)

- Eficiencia
- Retención (Factor de capacidad k)
 Eficiencia (Platos Teóricos)
El rendimiento de la columna o eficiencia está dado por el número de platos teóricos N que es una
medida de dispersión del pico en la columna HPLC.

Cada plato es la distancia sobre la cual los componentes de la muestra alcanzan un equilibrio entre
la fase estacionaria y la fase móvil del equipo.

Al tener más platos teóricos en la columna es posible más equilibrios y mejor calidad de separación.
 Asimetría (As) y Factor de coleo (T)
El Factor de Coleo y la Asimetría son determinaciones equivalentes, aunque hay ciertas
diferencias en sus valores calculados, generalmente el factor de asimetría suele ser
ligeramente mayor que el factor de coleo.
 Aplicaciones
Plantas químicas Biociencia Productos de consumo

- Poliestireno - Proteínas - Grasas

- Colorantes - Péptidos - Antioxidantes
- Ftalatos - Nucleótidos - Azúcares

Farmaceúticos Medio ambiente Clínicos

- Tetraciclinas - Poliaromáticos - Aminoácidos

- Corticoesteroides - Hidrocarburos - Vitaminas
- Antidepresivos - Iones inorgánicos - Homocisteínas
- Barbitúricos - Pesticidas
Desarrollo experimental
Muestra problema: Forma farmacéutica sólida (Tylenol, Desenfriol,
Panadol, etc.), de 250 o 500 mg.

Sustancia de referencia: Paracetamol, secar sobre gel de sílice durante

18 horas.
Procedimiento
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:

Pesar 20 Triturar en mortero Pesar 25 mg y

tabletas de Agregar 40 ml
transferir a matraz
acetaminofén de fase móvil
volumétrico de 50 ml

Agitar durante Pasar 1 ml de la solución
10 min. y aforar
a otro matraz volumétrico
con fase móvil
de 50 ml y llevar al aforo
con fase móvil
Descartar los
primeros 10 ml del
filtrado
Filtrar una porción de esta
solución a través de un filtro
de porosidad de 0,45 µm
 Preparación de la fase móvil

Preparar una mezcla Filtrar a través de una

membrana de nylon con
de agua-metanol en
tamaño poro 0,45µm
proporción (3:1)
usando equipo de filtración

Someter a acción del

ultrasonido durante 20 min.
para desgasificar la fase móvil

Preparación de referencia
Disolver una cantidad exactamente pesada de la sustancia de referencia paracetamol USP en
fase móvil para obtener una solución que tenga una concentración conocida aproximadamente de
0.01 mg/ml
 Bibliografía
● https://www.quimicontrol.com.co/2020/11/12/fase-reversa-y-fase-normal/
● https://lidiaconlaquimica.wordpress.com/2015/08/10/instrumentacion-en-hplc/
● https://apuntesde.es/tipos-de-detectores-en-hplc/
● https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8248/4/T4cromatliquid.pdf
● https://lidiaconlaquimica.wordpress.com/2015/08/11/detectores-empleados-en-hplc/
● https://repositorioinstitucional.buap.mx/server/api/core/bitstreams/b83712c1-f34a-4bf1
-a92d-520c7d10e9e3/content
● https://www.zaragoza.unam.mx/wp-content/Portal2015/Licenciaturas/qfb/tesis/tesis_lo
pez_murillo.pdf