Curso Bsico de

Cromatografa de Lquidos
de Alta Resolucin
HPLC
(High Pressure Liquid Chromatography)
(High Performance Liquid Chromatography)
(High Priced Liquid Chromatography!!!!)


2
Definicin.


Cromatografa es una tcnica analtica basada en la
separacin parcial o total de los componentes de una
mezcla como consecuencia de su migracin
diferencial en un sistema dinmico formado por una
fase estacionaria y una fase mvil.
3
Inyeccin Migracin Elucin
Separacin de los componentes de
una muestra

Fase mvil
Proceso de separacin cromatogrfica
Fase
estacionaria
Mezcla
4
Clasificacin
De acuerdo a la naturaleza de la fase mvil, la
cromatografa se clasifica en :

CROMATOGRAFIA DE GASES (Gas)

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS (Lquido)

En ambos casos , la fase estacionaria se encuentra
contenida en una tubera llamada COLUMNA.
5
Aplicaciones Generales
Forense
Agropecuaria
Alimentos y
Bebidas
Ambiental y
Forestal
Farmacutica
Clnica
Bioquimica Polmeros
6
Aplicaciones Generales
Insecticidas: carbamatos, organofosforados
Fungicidas: benzimidazoles, carbamatos
Herbicidas y reguladores del crecimiento: ureas,
fenilureas, triazinas, glifosatos( diquat/paraquat)
Aflatoxinas: B
1
, B
2
, G
1
, G
2

Micotoxinas: deoxinivalenol (DNO)
Acidos Fenlicos, Carbohidratos
Protenas, Aminocidos
Antocianinas
Vitaminas Liposolubles e Hidrosolubles
Drogas de Abuso
Antibiticos,Esteroides,Analgsicos
7
8
9
10
11
Sistema Cromatogrfico,
FASE MVIL
BOMBA
INYECTOR
DETECTOR SISTEMA DE DATOS
12
Proceso de separacin cromatogrfica



13
Resolucin (R)
Resolucin vs
Concentra-
cin.

14
Definiciones en Resumen
Eficiencia
Cuan estrechos son los picos
Medida del desempeo de la columna/fase
estacionaria
Factor de Capacidad
Cuan bien es retenido un compuesto
Selectividad
La retencin relativa de 2 compuestos
Resolucin
La separacin relativa de 2 compuestos
Evalua la separacin en su totalidad
15
Optimizacin de una Separacin
Selectividad

Para optimizar la Selectividad (separacin):
Cambiar la composicin de la fase mvil
Usar aditivos en la fase mvil
Cambiar la fase estacionaria
Cambiar el pH y/o la temperatura
16
Optimizacin de una Separacin
Eficiencia

Para optimizar la eficiencia de la columna :
Disminuir el tamao de partcula
Emplear el flujo adecuado
Emplear un solvente menos viscoso
Incrementar la temperatura de la columna


17
II. Instrumentacin
2.1 Fase mvil
2.2 Sistema de bombeo
2.3 Inyectores
2.4 Columnas
2.5 Detectores
18
FASE MVIL
BOMBA
INYECTOR
DETECTOR SISTEMA DE DATOS
SISTEMA CROMATOGRAFICO
19
Preparacin de la Fase Mvil
Seleccionando la Fase mvil correcta
La consideracin principal al elegir un sistema de
solventes es seleccionar uno que separe
adecuadamente los analitos. Adems de la calidad en
la separacin, la fase mvil debe:
No alterar la columna ni sus caractersticas
Ser compatible con el detector
Disolver la muestra
Tener una viscosidad baja
Permitir la recuperacin fcil de la muestra, si es
necesario.
Ser de pureza elevada y no txico
Ser comercialmente disponible a un precio razonable



2.1 Fase Mvil - Caracteristicas
20
A) FILTRACIN
MEMBRANAS
Material
Tamao de Poro
2.1 Fase Mvil - Preparacin
21
B) DESGASIFICACIN
Gas Inerte
2.1 Fase Mvil - Preparacin
H
e
Ultrasonido
Agitacin y
vaco
22
C) PREMEZCLADO
2.1 Fase Mvil - Preparacin
Es recomendable medir los volumenes
individuales y mezclarlos en un reservorio comun.
Cuando se mezclan solventes orgnicos con
agua siempre se obtiene un DV de mezcla negativo.
Para preparar MeOH/Agua 50/50, no se debe
colocar 500 ml de metanol en el matraz aforado y
aadir 500 ml de agua porque no serian suficientes
para llevar al aforo.
23
D) BUFFERS
2.1 Fase Mvil - Preparacin
Los buffers seran necesarios cuando se analicen
muestras que contengan analitos cidos o bsicos.
Las concentraciones recomendadas son del orden
de 10 a 20 mM; de ser necesaria una mayor concentracin
asegurarse que no se presente precipitacin.
El pH debera ajustarse en el buffer acuoso
(teniendo considerado la modificacin del pH por el
solvente orgnico).
24
ACERO INOXIDABLE
PEEK
2.1 Fase Mvil Mantenimiento
Preventivo
P/N: 28-211524-00 SOLVENT BOTTLE FILTER 10 M, TITANIUM
P/N: 27-180387-00 SOLVENT RESERVOIR FILTER, 10 UM, SS
25
Pureza de disolventes
Verifique con los proveedores el rango apropiado de
trabajo en UV de los disolventes

El oxgeno disuelto incrementa la abs en la regin del
UV lejano.Esnecesario desgasificar para lograr alta
sensibilidad en esta regin.
La absorcin del oxgeno causar drift y ruido.
Depende de la temperatura

Las sales de par inico (TMA) pueden contener
impurezas que absorben en la regin UV. Usar de la
ms alta pureza
26
Preparacin de la Fase Mvil
Filtracin
Mantener los reservorios tapados.





Cuidados con disolventes
27
Preparacin de la Fase Mvil
Solventes para fase reversa
La mayora de la LC por fase reversa utiliza agua
como el componente principal de la fase mvil
El agua es el lquido polar ms comn
Casi todos todos los compuestos, excepto los ms
polares o ms inicos, experimentan una fuerza
hidrofbica fuerte que los conduce a la fase
estacionaria y causa su retencin
Se debe utilizar siempre agua grado hplc




Solventes
28
Preparacin de la Fase Mvil
Solventes para fase reversa
El ajuste de la concentracin orgnica del modificador
B es el medio primario de cambiar la retencin
Los tres ms comunes son acetonitrilo, metanol y
tetrahidrofurano



Solventes
29
Operar a presiones elevadas
Libre de pulsaciones
Inerte
Operar con gradiente de solventes
2.1 Bombas - Caracteristicas
30
Objetivo de la Bomba
En la cromatografa clsica, la separacin se realiza por
efecto de la gravedad (Tamao de partcula 50-100
micrometros, tiempo de separacin de una a varias
horas)

La disminucin de tamao de partcula como soporte
de la fase estacionaria (3, 5 o10 micras) exige forzar al
lquido a cruzar a travs de la columna por medio de
una bomba.

Las bombas comerciales basan su diseo en pistones
reciprocantes
31
FASE MVIL
FASE MVIL
Funcionamiento de la Bomba
32
El disolvente es entregado por la bomba con el pistn
reciprocante.(10 L/min -10 mL/min)

El diseo del pistn con un control electrnico de su movimiento
(stroke) proporciona un flujo ligeramente pulsante.

Un damper reduce la pulsacin del flujo.

Una cmara de mezclado proporciona una homogenizacin de los
disolventes atras del punto de inyeccion de la muestra.

Un transductor de presin convierte la presin del sistema en una
salida elctrica que se despliega en la pantalla
Funcionamiento de la Bomba
33
Funcionamiento de la Bomba
El movimiento del pistn es controlado por la rotacin de la leva
(cam).

Un ciclo completo en la bomba consiste del movimiento del pistn
para llenar el cabezal, en el cual el pistn viaja en reversa
(alejandose del cabezal de la bomba) y un movimiento de entrega ,
en la cual el pistn viaja en el sentido del cabezal de la bomba.

Durante el movimiento de entrega, el disolvente es descargado a
travs de la vvula check.

La rotacin de la leva (cam) es determinado por un software de
control del motor.
34
Mala repetibilidad de tiempos de reten-
cin:
- Fugas (visibles o no visibles)
SELLOS
PISTN
Mantenimiento Preventivo en Bomba
Vlvulas
check
Solucin:
Cambio de pieza daada
35
C
o
m
p
o
s
i
c
i

n

Tiempo
% B
Isocrtica
Gradiente
2.1 Bombas Tipos de Bombas
36
Estabilidad en la lnea base
Tiempo de anlisis largo
Presin Constante
Resolucin limitada
2.1 Bombas Anlisis Isocratico
37
Preparacin de la Fase Mvil
Separacin isocratica o por gradiente
La fase mvil iscratica no puede resolver todas las
separaciones
Algunas muestras son demasiado complejas
Resolucin pobre de picos tempranos
Ensanchamiento de picos y coleo de los picos finales
En la elucin por gradiente de solventes, la fuerza de la
fase mvil se incrementa por cambio de la composicin de
los solventes en un cierto tiempo
Elegido para una amplia gama de muestras o de
biopolmeros
Limpia la columna durante cada corrida
Empleada para estimar condiciones isocraticas ptimas



Solventes
38
Resolucin de Mezclas Complejas
Tiempo de Anlisis Corto
Variacin de la Presin
Inestabilidad de Lnea Base
Vida til de la Columna Limitada
2.1 Bombas Anlisis con Gradiente
39
2.1 Bombas Anlisis con Gradiente
Tiempo
% B
C
o
m
p
o
s
i
c
i

n

40
Cond. Inicial
2.1 Bombas Desarrollo de un Gradiente
Tiempo
(min)
%A
%B
0 100 0
20 80 20
30 80 20
35 100 0
40 100 0
Etapa
Prerun
Gradiente
Isocratico
Cond. Inicial
Equilibrio
Isocratico
41
2.3 Inyector Automatico
caractersticas
Vlvula de 6 puertos / 2 posiciones
Utiliza un loop / no requiere de
cambio de loop para volumenes menores
2 posiciones: carga e inyeccin
Aguja / Jeringa para introducir
muestra en forma programada
Limpieza automtica de la lnea de
inyeccin.
42

2.3 Inyector Automatico- Consideraciones
de
Operacin
Jeringa
El vlumen de muestra es medido
con una jeringa de 250 uL.
El interior de la jeringa debe estar
libre de burbujas.
De observarse burbujas:
Verificar la degasificacin del
solvente de enjuague.
Verificar el buen estado de la
punta del mbolo.
Verificar que la aguja no este
tapada.
Es necesario verificar que no se
presenten fugas provenientes del
mbolo de la jeringa.
43

2.3 Inyector Automatico- Consideraciones
de
Operacin
Vlvula de Inyeccin
La muestra es introducida por una
vlvula automtica de seis puertos.
Emplea tambien un sello/rotor que
puede rallarse. (mala repetibilidad
de reas)
La falla se evidencia cuando se
observan gotas de lquido en la
punta de la aguja, crecen y se
desprenden.
Y adems, un incremento en la
presin tambien incrementa la
intensidad del goteo.

44

2.3 Inyector Automatico- Resumen de

funcionamiento
Importante
Jeringa y tuberia libre de burbujas.
No fugas en jeringa.
Recomendado solo con septas
nuevas.
La aguja de aire es insertada hasta
la parte superior del vial, por lo que
los viales solo llenarlos hasta 2/3 de
alto (Contaminacin Cruzada).

2/3 mximo
45
Factores que afectan la Repetibilidad de
Areas
A. MUESTRA
B. MODOS DE INYECCIN
C. LOOP
D. EFECTO MEMORIA
(Contaminacin cruzada)
2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento
Preventivo
46
A) CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA
Compatible (soluble) con la fase
mvil.
Disuelta en un solvente de la misma
polaridad (o ms debil que la fase mvil).
Libre de partculas suspendidas
(Filtrada)
2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento
Preventivo
47
Modo Parcial
Hasta el 50 %
del volumen
del loop
Toma de 3 a 2
veces el volumen
del loop
B) MODOS DE INYECCIN
Modo Total
2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento
Preventivo
48
C) Material y tamao
del LOOP
Tamao:
5, 10, 20, 50, 100,200,
500 (l),1, 2,5 (ml)
Material:
Acero Inoxidable,
Titanio,PEEK
2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento
Preventivo
49
D) EFECTO MEMORIA
Contaminacin cruzada
2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento
Preventivo
Son residuos de
muestra (o estndar)
de la inyeccin
anterior.
Se evidencia en la
inyeccin de un
blanco inmediato
posterior.
50
Diagrama
2.4 Columnas para HPLC
51
Cmo funcionan?
2.4 Columnas para HPLC
La fase estacionaria esta
empacada dentro la
columna no se mueve.

La fase mvil esta
circulando dentro la
columna a una
velocidad regulada
(flujo constante)
arrastrando a la muestra.
52
Cmo funcionan?
2.4 Columnas para HPLC
Si el analito es ms
soluble en la fase mvil
que en la fase
estacionaria, el analito
migrar dentro de la
columna con poca
interaccin con la fase
estacionaria.
53
Cmo funcionan?
2.4 Columnas para HPLC
Si el analito es ms
soluble en la fase
estacionaria, migrar
ms lentamente dentro
de la columna, y
dependiendo de la
magnitud de la
interaccin, el tiempo
invertido ser ms o
menos grande.

54
Efecto del
cambio en la
longitud de
la columna
2.4 Columnas para HPLC
Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley Interscience, 2006
55
Longitud
3, 5, 10,
15, 25 cm)
Dimetro Interno (1, 2, 4, 4.6 mm)
Tipo de soporte
Silica, polimero.

Grupo qumico enlazado
C18, C8, C4, CN, NH2, Si

Tamao de partcula
2, 3, 5, 10 um

Tamao de poro y Area Superficial
(60 ~ 200 A) (100 ~ 500 m
2
/g)

Densidad de ligando
2 ~ 4 mol /m
2
Clasificacin por Caractersticas
2.4 Columnas para HPLC
56
Tipo de soporte
Silica (SiO
2)
es el material dominante. Posee una alta
resistencia mecnica y permite fabricar partculas
uniformes.

Clasificacin por Caractersticas
2.4 Columnas para HPLC
57
Tipo de soporte
Silica (SiO
2)
posee
una superficie polar
que permite ser
modificada para darle
propiedades no
polares por
tratamiento qumico.
Tiene como limitante
el que se degrada
fuera del intervalo de
pH de 2 a 8.

Clasificacin por Caractersticas
2.4 Columnas para HPLC
58
Tipo de soporte
La Silica (SiO
2)
tiene como limitante el degradarse
fuera del intervalo de pH de 2 a 8.

Clasificacin por Caractersticas
2.4 Columnas para HPLC
59
Tipo de soporte
Polmero.

Poliestireno divinil benceno
entrecruzado, polieteres y metacrilatos son los
ms comunes.
Tienen como desventaja que regularmente
poseen menos eficiencia comparadas con las
columnas de Si.
Tienen como ventaja la operacin en el intervalo
de pH de 1 a 14.
Existen nuevos materiales como son la Zirconia
que permiten operar a temperaturas elevadas.

Clasificacin por Caractersticas
2.4 Columnas para HPLC
60
Grupo qumico enlazado
C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si

Clasificacin por Caractersticas
2.4 Columnas para HPLC
No Polar Polar


Fase Reversa Fase Normal
61
Grupo qumico enlazado
C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si

Clasificacin por Caractersticas
2.4 Columnas para HPLC
C18: Muy hidrofobica, estable y primer eleccin.
C8: Menos hidrofobica, requiere menos solvente orgnico.
CN: La menos hidrofobica, no muy estable.
Ph: Para compuestos de mediana polaridad. Recomendada
para aromticos.
C4: Recomendadas para anlisis de proteinas.
NH2: Recomendada para carbohidratos.
Si: Adecuada para compuestos orgnicos de polaridad media
62
Clasificacin
por Tecnologa
(Resumen 1)
2.4 Columnas para HPLC
63
2.4 Columna Mecanismos de
Separacin Tipo de interacciones
No polares - fuerzas de van der Walls

covalentes Formacin de puentes moleculares

Polar - dipolares y puentes de hidrgeno

Ionicas - cationicas y anionicas
64
SELECCIONAR LA COLUMNA
ESPECIFICA
METODO EXISTENTE
SATISFACTORIO
SELECCIONAR
COLUMNA NUEVA
MUESTRA
PESO MOLECULAR >
2000
SOLUBLE EN
ORGNICO
SOLUBLE EN
AGUA
EXCLUSIN
PERMEACIN
EXCLUSIN
FILTRACIN
PESO MOLECULAR <
2000
SOLUBLE EN
ORGNICO
SOLUBLE EN

HEXANO
SOLUBLE EN
METANOL
ADSORCIN FASE ENLAZADA
NORMAL
FASE ENLAZADA
REVERSA
SOLUBLE EN
AGUA
INTERCAMBIO
INICO
2.4 Columna Seleccin de Columnas
65
Mercanismos de adsorcin
Dependiente de la concentracin de soluto y la
temperatura (Isotermas de adsorcin)

Retencin de Compuestos polares

Orden de elucin: menor polaridad ms rpido

Columnas: slica & alumina

66
2.4 Columna Adsorcin
67
K = Cs
Cm
S
m
Fase enlazada
Normal
Reversa
2.4 Columna Particin
68
2.4 Columna Fase Normal enlazada
69
Caractersticas del mecanismo
Interacciones:
Polares (puentes de H2, fuerzas de van Der Walls).

Retencin:
Favorecida por disolventes no polares.

Elucin:
Fuerza de disolvente aumenta con la polaridad
(hasta disolvente medianamente polares)

Columnas : Ciano y amino

70
2.4 Columna Fase Normal
71
2.4 Columna Fase Reversa
72
2.4 Columna Fase Reversa
Es la tcnica de HPLC ms popular:
Las columnas son estables y de rpido equilibrio.
El orden de elucin es predecible: Si ms
hidrofobico el soluto -> mayor retencin.
Agua es uno de los solventes ms importantes
Permite cambios en la selectividad por la adicin
de modificadores
Fase reversa incluye algunas variantes:
Regular, supresin de iones, ionizacin
controlada, par inico y formacin de quelatos
metlicos.

73
Mecanismos de fase reversa: Fase reversa
clsica
Los solutos no polares son retenidos por la fase
estacionaria .
La elucin se logra por cambio en la polaridad de la
fase mvil (disminucin de polaridad)
Fase reversa clsica
74
2.4 Columna Fase Reversa
Fase reversa clsica
75
Mecanismos de fase reversa:
Control de la ionizacin
Algunos solutos presentan ionizacin a un valor
determinado de pH.
Los solutos en forma no ionizable son retenidos por la
fase estacionaria. Al cambiar a su forma ionizable
eluyen de la columna.
Se emplean soluciones de fosfatos, boratos, citratos.
Concentracin mxima (recomendada) 0.01M
Compatibilidad de solubilidad con la fase orgnica
Compatibilidad con el detector
76
Fase mvil Bomba
Detector
Sistema de datos
Banco de
columnas
2.4 Columna Exclusin
77
Uso:
Almacenar la columna en un solvente
recomendado por el fabricante.
Colocar tapones durante no-uso.
Siempre lavar columna con un
solvente fuerte.
Siempre utilizar guardacolumna o
filtro en lnea
2.4 Columnas Uso,
Mantenimiento y Cuidados
78
Precauciones:
No exceder rango de pH de la
columna.
No exceder rango de temperatura de
la columna.
Nunca guardar la columna con sales o
buffer dentro de ella.
Permitir que la columna se enfrie
antes de detener el flujo.
2.4 Columnas Uso,
Mantenimiento y Cuidados
79
Mantenimiento y Regeneracin:
Tiempo de vida desde 3 hasta 24
meses o de 1000 a 3000 inyecciones.
El desempeo disminuye con el uso
(incremento en la presin y coleo de
picos).
Monitorear presin (bitacoras!!),
probar invertir columna.
Regenerar la columna con una serie
de solventes de dbil a fuerte y
viceversa en forma gradual.
2.4 Columnas Uso,
Mantenimiento y Cuidados
80
FASE REVERSA
50 ml agua caliente
( 55 C)
50 ml de metanol
50 ml de acetonitrilo
30 ml de THF
25 ml de metanol
25 ml de fase mvil
2.4 Columna Regeneracin
Consultar siempre folleto del fabricante
81
Fase mvil
Guarda
Columna
Detector
Sistema de datos
Bomba
Inyector
C
o
l
u
m
n
a

2.4 Columna Guardacolumna
82
2.4 Columna Horno
Temperatura en la columna

Aumentar la solubilidad de la
muestra
Disminuir la presin de la
columna
Disminuir la selectividad
83
2.5 Detectores
Uv-vis ( fija)
Uv-vis
(Arreglo de diodos)
Fluorescencia
Indice de Refraccin
ELSD
84
Indice de Refraccin
a) Universal
b) Mide el cambio de ndice de refraccin
entre la celda de muestra y la celda de
referencia.
c) No destructivo de la muestra
d) Baja sensibilidad : %w
e) No compatible con gradiente
f) Sensible a la temperatura ambiente
2.5 Detectores - ProStar 350
Caractersticas
85
No recomendados
Haluros , Formato de Amonio, CCl
4

Utilizables abajo del 10%
Acido Brico, Anhidro Acetico, KOH
Sales de Formato de Amonio, perclorato, HPO
4
2-

Sales de bicarbonato, clorato y nitrato
Utilizables abajo de 30%
Acido Citrico, NaOH, Sales de Citrato de Amonio, oxalato,
sulfato, H
2
PO
4
-

Utilizables abajo de 50%
Acido Acetico, Acido lactico, Hidrazina,
Nitrato de Amonio, K
2
CO
3
, Formato de Sodio
2.5 Detectores - Indice de Refraccin
ProStar 350 -Restricciones de Solventes
86
Ultravioleta Visible
a) Alta sensibilidad
b) Mide la absorcin de la luz UV o
Visible en el eluyente del HPLC.
c) No destructivo de la muestra
d) Selectivo
e) Rango 190-900 nm
f) Compatible con gradiente
2.5 Detectores- Ultravioleta Visible
PS-325 Caractersticas
87
2.5 Detectores-Ultravioleta Visible
PS-325 Recomendaciones de Operacin
Encender la lmpara por lo menos 15 minutos
antes del anlisis.
Configurar longitud de onda y tiempo de
respuesta.
La duracin de las lmparas es de aprox 2000
hrs, pero pueden fallar antes o despus.
88
2.5 Detectores- Arreglo de
Diodos PS-335 Caractersticas
Detector de arreglo de diodos
a) Sensibilidad similar a UV-VIS
b) Mide la absorcin de la luz UV o Visible en el
eluyente del HPLC.
c) No destructivo de la muestra
d) Selectivo
e) Rango 190-900 nm
f) Compatible con gradiente
89
2.5 Detectores - Arreglo de Diodos
PS-335 Recomendaciones de Operacin
Encender la lmpara por lo menos 15 minutos
antes del anlisis.
Configurar longitud de onda y tiempo de
respuesta.
Configurar rango de longitudes de onda para
desarrollo de mtodos, y porque sea necesario en
trabajo de rutina. Los archivos son muy grandes.
La duracin de las lmparas es de aprox 2000
hrs, pero pueden fallar antes o despus.
90
Alta sensibilidad (100 a 1000x)
Compatible con gradiente
Selectivo: excitacin, emisin
Rango de s: Ex: 200-850nm y Em:200-900 nm
Formacin de derivados: Precolumna y Post
columna
2.5 Detectores- Fluorescencia
Fluorescencia
91
2.5 Detectores- Fluorescencia
PS-363 Lmpara de Xe.
Duracin aprox de
500 hrs
Contiene gas Xe
presurizado. Manejese
con cuidado.
La radiacin emitida
es muy intensa.
92
2.5 Detectores- Fluorescencia
PS-363 - Areas de aplicacin
Mercado Farmaceutico / Bioquimico

Catecholes e Indoles
Vitaminas
Derivados OPA de amino cidos
Derivados FMOC de amino cidos
Marcadores Fluorescentes

Mercado Ambiental
Carbamatos, Glifosatos
93
Normalizacion interna
Estndar Externo
Estndar Interno
3.0 Analisis Cuantitativo
tr
1
tr
2
tr
3
A
1
A
2
tr
4
A
4
A
3
Area
94
1. Inyectar la Muestra Problema
Datos
A
2
A
1
A
3
A
4
tr
1
tr
2
tr
3
A
1
A
2
tr
4
A
4
A
3
3.0 Analisis Cuantitativo- Por ciento Area
2. Calcular el % A:
%A = Ai x 100
Ai
95
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo
1. Preparar una mezcla de estndares de
concentracin conocida con los componentes de
inters

2. Inyectar la mezcla de estndares

3. Obtener el cromatograma, as como sus
respectivas reas
tr
1
tr
2
tr
3
A
1
A
2
tr
4
A
4
A
3
Datos
A
2
A
1
A
3
A
4
C1
C2
C3
C4
96
Alta pureza
Estable qumicamente y trmicamente
Estructura qumica semejante a los
componentes de inters
Separado e identificado de los componentes
de la muestra
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno
Requisitos del Estndar Interno
97
1. Preparar una mezcla de calibracin que
contenga los componentes de inters, asi como
el componente que servir como estndar
interno
2. Inyectar la mezcla de calibracin, obtener el
cromatograma y las reas
tr
1
tr
2
tr
3
A
1
A
2
tr
4
A
4
A
3
Datos
A
2
A
1
A
3
A
4
C1
C2
C3
C4
Est. Interno
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno
98
4. Inyectar la muestra problema y obtener las
reas:
tr
1
tr
2
tr
3
A
1
A
2
tr
4
A
4
A
3
Datos
A
2
A
1
A
3
A
4
C2

5. Calcular la concentracin de cada uno
de los componentes tomando como
referencia el pico del estndar
interno
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno
99
Ci= Ai x C std int
A std int
Ci = Concentracin del pico de inters
Ai = rea del pico de inters
Cstd int = Concentracin del estndar interno
Astd int = rea del estndar interno
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno