HPLC

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el cual los componentes que

se van a separar se distribuyen en dos fases, una de estas fases constituye una capa
estacionaria de gran rea superficial y la otra es un fluido que eluye a travs o a lo
largo de la fase estacionaria.
La cromatografa liquida de alta eficiencia o High Performance Liquid
Chromatography(HPLC), es el mtodo de cromatografa liquida en columna ms
empleado para anlisis qumico y bioqumicos que nos identifica, separa y cuantifica
diversos compuestos qumicos. En el HPLC, el empleo de una bomba (en lugar de la
gravedad) ofrece una presin alta necesaria para que la fase mvil, junto con el
analito, se desplacen sobre la fase estacionaria a travs de una columna de gran
densidad (gran empaquetamiento).El aumento de la densidad se debe a tamaos de
partcula ms pequeos. Esto permite una mejor separacin en columnas de menor
longitud que en columnas cromatograficas ordinarias.
Antes de usar una columna nueva en un cromatografo es conveniente comprobar que
cumple con las especificaciones indicadas por el fabricante; para ello se lleva a cabo
un test de columna, en la que se inyecta una mezcla de sustancias con diferente valor
de factor de capacidad(K),una de ellas debe tener un factor de capacidad igual a cero,
lo que permite el clculo del tiempo muerto y a partir del cromatograma obtenido se
calculan los parmetros de factor de capacidad(K), numero de platos tericos(N),Altura
equivalente de platos tericos(H), factor de asimetra(As),Selectividad(a).
INSTRUMENTACION
Si bien es cierto que para realizar una cromatografa liquida tan solo es necesario
disponer de las dos fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna
cromatografa de lquidos de alta eficacia, debido al pequeo dimetro de las
partculas de fase estacionaria que se utilizan, requiere de la utilizacin de unos
dispositivos que constituyen el cromatografo.
Los componentes bsicos de un cromatografo de lquido son:

Dispositivos de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de

eluyentes).
Dispositivo de inyeccin
Conducciones y conexiones
Detecto y registrador
Columna

Los componentes bsicos de un cromatografo se muestran en la figura 1.

Adems de los dispositivos anteriormente mencionados se pueden incorporar en el

sistema otros que pueden simplificar el trabajo o bien mejorar algn aspecto concreto
de la tcnica cromatografica , como pueden ser:

Inyectores automticos.
Colectores de fracciones.
Hornos termostatizados para las columnas.
Sistemas de tratamiento de datos.

Sistema de suministro de fase mvil

La bomba
La misin de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de la
fase mvil a travs de la columna, sin que el flujo sea influido por la presin en cabeza
de columna, ya que esta puede variar por obstruccin de las lneas de conduccin, del
filtro de la cabeza de la columna, etc.

Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes caractersticas:

Estar constituido con materiales qumicamente inertes frente a la fase mvil.
Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un amortiguador de estas,
ya que las pulsaciones,aunque no afectan a la separacin en si,pueden contribuir al
ruido de fondo del detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad.
Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas.El rango de
caudales para las columnas que se utilizan habitualmente vara desde los 10 uL/min
hasta los 10 mL/min(columnas microbore, analticas y semipreparativas).
El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que de el
depende la reproducibilidad de los tiempos de retencin.
Sistemas de mezcla de fase mvil
En la cromatografa de lquidos, es posible trabajar en dos modalidades; isocratico,
cuando la fase mvil mantiene la misma composicin durante la elucin, y en
gradiente, cuando la composicin de la fase mvil cambia segn una funcin
dependiente del tiempo.
Para trabajar en la modalidad de gradiente, es necesario que el equipo cromatografico
tenga un dispositivo capaz de realizar mezclas de disolventes con un control de
preciso y reproducible.
Los dos principales mtodos de mezclado de los componentes de la fase mvil se
conocen como mezclado a alta presin y mezclado a baja presin.
Sistema de inyeccin
El mtodo de introduccin de la muestra en HPLC, es de importancia, pues un mal
sistema de inyeccin puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatografica
que deterioren la eficacia del sistema cromatografico.
Un inyector ideal debe tener las siguientes caractersticas:

Introducir la muestra en la columna como una banda lo ms estrecha posible.

Ser de fcil manejo
Dar lugar a resultados reproducibles,tanto en la cantidad de muestra inyectada
como en el ensanchamiento que origina en la banda cromatografica.
Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.

Conducciones y conexiones
Como ya es conocido,la presencia de volmenes muertos es uno de los grandes
problemas de los equipos de cromatografa de liquidos,ya que estos dan origen a
perdidas en la eficacia del sistema y,por lo tanto,en la capacidad de separacin.En
particular,todas las conducciones y conexiones entre inyector y columna,y entre
columna y detector son de la mxima importancia.

El tubo de conduccin puede considerarse como un volumen muerto del sistema y,por
lo tanto, es de vital importancia la utilizacin para esta finalidad de tubos capilares en
los que el dimetro interno sea pequeo y evitar al mximo posible la utilizacin de
grandes longitudes de tubo de conexin; de este modo,se consigue reducir en la
medido de lo posible el volumen muerto del sistema. Es posible calcular la prdida de
eficacia producida por el volumen muerto de la conduccin; a ttulo de ejemplo, en la
tabla I se muestran diferentes combinaciones de dimetros internos y longitudes de
tubo que pueden utilizarse para no dar lugar a una perdida superior al 10 % de la
eficacia del sistema.

LA COLUMNA
La columna es el elemento fundamental de un cromatografo de liquidos, puesto que es
en ella donde tiene lugar la separacin; por lo tanto, resulta fundamental una correcta
eleccin de la columna adecuada para cada separacin, ya que con una columna
inadecuada o de mala calidad se nunca se obtendrn buenos resultados aunque se
disponga del mejor instrumental.
Las partes de que se compone en la figura 2.Las columnas ms utilizadas en
cromatografa de lquidos son las de relleno; estas columnas consisten en un tubo,
generalmente de acero, relleno de una fase estacionaria adecuada al tipo separacin
que se pretende llevar a cabo. El dimetro interno vara entre 2 y 60 mm dependiendo
su utilizacin, a escala analtica o semipreparativa, y su longitud vara entre 5 y 30 cm.
Caractersticas:

Dimetro interno.
Longitud.
Conexiones.
Relleno.
Tamao de partcula del relleno.

PARTE EXPERIMENTAL
Primero realizamos la cromatografia en capa fina,raspando la silicagel conteniendo el
respectivo alcaloide(esparteina) mediante su Rf.

Despus filtramos la muestra utilizando metanol

Luego de conseguir el estandar(sulfato de esparteina) y la muestra conteniendo

nuestro alcaloide respectivo ,lo llevamos a CENPRO FARMA para realizar la
cromatografia liquida de alta eficiencia.

Antes de iniciar el HPLC debemos preparar la muestra:

Disolvemos el estndar (sulfato de espartena) en solucin de metanol.
La muestra es colocada en un vial color mbar 0,5 mL donde se prepara la muestra de
anlisis y el disolvente orgnico que generalmente es utilizado como eluyente
(metanol).

El equipo consta de unos reservorios para la fase mvil, bombas ,fase de inyeccin,
columna que est dentro de un horno y el registrador de los datos que es la
computadora.

En el sistema de inyeccin se utiliza una jeringa sin punta que almacena de 1 a 10

microlitros. La columna es de material de acero inoxidable o plstico que tiene una
medida de 25 cm, dentro de ella se encuentra la fase estacionaria que comnmente
est conformado por partculas de slice.

Cabe indicar que todo este sistema de cromatografa de lquidos de alta eficiencia
trabaja bajo dos modos (modo isocratico y el modo gradiente). Entendindose por
modo isocratico cuando la composicin de la fase mvil es constante y modo gradiente
es cuando los distintos analitos son eluidos con incremento de la composicin de la
fase mvil en la fase orgnica.
Los viales son colocados en un automuestreador conocido como carruceles
numerados para luego registrarlos.El sistema de inyeccin toma 10 microLITROS de
muestra y lo pone en la columna. En la columna se separan los compuestos y
posteriormente se cuantifica.
El programa especfico que se uso es el malick 1.4 que se encarga de registrar el
disolvente que estamos utilizando y tambin las condiciones como el tiempo y la
temperatura. Tambin el modo que estamos empleando(por gradiente) en el
cromatograma.

Cromatograma de la muestra de alcaloides

Cromatograma del estndar(espartena)