Guía parcial II

Microbiología
Tinciones básicas en lab
• Poder de resolución del microscopio: capacidad
que posee un objetivo para distinguir la distancia
mínima entre dos puntos del objeto para que se
puedan visualizar como dos puntos separados.
• ¿De qué es responsable el poder de resolución? de la
calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen.
• ¿De qué depende? De la longitud de onda y del haz ce luz
utilizado y de la apertura numérica del objetivo empleado.
• Colorante: sustancia capaz de dar color a células,
tejidos, fibras etc.
• Colorantes naturales: son extraídos de plantas o animales.
• Colorantes artificiales: son aquellos de minerales
procesados y manipulados en el laboratorio.
• El colorante se constituye por componentes:
Cromóforos: es todo grupo aislado, covalente e insaturado,
que tienen una absorción característica en la región
ultravioleta o visible.
Auxocromos: grupos funcionales o radicales que constituyen
una molécula y poseen carga parcial positiva; tienen la función
de intensificar la formación de color mediante la acción de
grupos de átomos no saturados.
• Funciones de los colorantes: permiten hacer
visibles a los objetos microscópicos; revelan su
forma y tamaño; muestran la presencia de
estructuras internas; producen reacciones químicas
especificas.
• Tinciones simples: cuando toda la muestra se tiñe
del mismo color y se utiliza un solo colorante (azul
de lactofenol o tinta china).
• Tinción diferencial: cuando se visualiza más de un
color porque se utiliza más de un colorante (Gram
o Ziehl-Neelsen).
• Tinción especifica: cuando se utilizan anticuerpos
marcados con una molécula fluorescente para
identificar una estructura celular en particular
(inmunocitoquímico).
• Importancia del control de calidad de métodos • ¿Por qué los métodos químicos ofrecen mejores
tintoriales: asegura que la preparación de la resultados para la fijación? Son líquidos con
muestra haya sido adecuada, por lo que se potencial alto de difusión intracelular y detienen
recomienda realizar al mismo tiempo de la procesos enzimáticos que provocan autolisis.
evaluación de la muestra clínica, la tinción de un
• Tinción de Gram: tinción diferencial que utiliza dos
agente infeccioso ya identificado mediante esa
colorantes y clasifica a las bacterias en Gram
tinción, el cual funcionará como un control
negativas y Gram positivas. Esta se basa en las
positivo.
características de la pared celular de las bacterias,
• Proceso de fijación de las muestras: se usa con la la cual confiere propiedades determinantes a cada
finalidad de preservar la arquitectura estructural y microorganismo.
física de la célula, se usa en técnicas de Gram o • Bacterias Gram negativas: se constituye por una capa fina
Ziehl-Neelsen. de peptidoglicano y una membrana celular externa. Al
finalizar se observan rosas a rojas.
• Fijadores físicos: desecación, calor seco, calor • Bacterias Gram positivas: posee una pared celular gruesa
húmedo, ultrasonido y microondas. constituida por peptidoglicano y no cuenta con membrana
celular externa. Al finalizar se observan moradas a azul
• Fijadores químicos: se clasifican en oxidantes y obscuro.
reductores, de acuerdo a sus propiedades
químicas.
• Oxidantes: oxido crómico, acido acético, acido pícrico,
acetona, dicromato de potasio.
• Reductores: formaldehido, glutaraldehído, etanol, metanol,
paraldehído, etc.
• Tinción de Wright: técnica empleada generalmente
para la diferenciación de elementos celulares de la
sangre y es clasificada como una tinción
policromática, debido a que puede teñir compuestos
ácidos y básicos presentes en una célula.
• Usos en parasitología: se le emplea en la búsqueda de
hematozoarios como Plasmodium spp.
• Reactivo de Wright: esta compuesto por eosina y
azul de metileno, cuando este se oxida se conoce
como azur B a una concentración de 0.8 g/L
empleando como solvente alcohol
• Eosina: colorante acido que tiene afinidad por
componentes alcalinos.
• Eosina Y: tetrabromofluoresceina/ eosina amarilla.
• Eosina B: dibromodinitrofluoresceina/ eritrosina B azulada.
• Tinción de Ziehl-Neelsen: utilizada comúnmente
en diagnostico rutinario de tuberculosis; es rápida,
fácil y de bajo costo. Permite diferenciar a las
bacterias en dos grupos: los que son capaces de
resistir la decoloración con alcohol –ácido y
aquellos que no lo son.
• Tinción positiva: aquella en la que se observan bacilos
ácido-alcohol resistentes, los cuales son de color rojo
fucsia.
• Tinción negativa: desarrollada para microscopia de
luz para rodear y delinear las bacterias no teñidas u
otros materiales biológicos. Utilizamos diferentes
métodos de tinción negativa para evaluar
estructuras individuales, tan pequeñas como las
vesículas sinápticas e incluso de gran tamaño,
como los microorganismos unicelulares. Este
método es muy útil, aunque está limitado por la
presencia de un fondo oscuro que no permitirá la
correcta identificación de forma nítida y detallada
de los componentes de dichas estructuras.
• Principal dificultad: los microorganismos tienden a
contraerse durante el periodo de secado. Para evitarlo se
utiliza la tinción negativa húmeda.
• Tinción negativa húmeda: los organismos se suspenden en
una película de tinta china o mancha oscura y el contorno
de la capsula puede ser observado sin el peligro de
contracción.
• Tinción de azul de algodón de lactofenol: tinción • Impronta: proceso en el cual se coloca una
con características tintoriales que permiten observar
cada uno de los componentes fúngicos y apreciar
fácilmente las estructuras para una adecuada
identificación. Las estructuras se verán de color azul • Preparación de la impronta:
sobre un fondo claro.
• Fenol: inactiva las enzimas líticas de la célula e
impide que esta se rompa; de igual forma, destruye
la flora acompañante e inactiva a la célula,
quitándole el grado de patogenicidad; además actúa
como mordiente cuando se usa en combinación con
colorantes.
• Acido láctico: preserva las estructuras fúngicas al
provocar un cambio de gradiente osmótico con
relación al interior fúngico, lo que genera una
película protectora.
• Azul de algodón: colorante acido, que tiñe el
citoplasma y la quitina presente en las células
fúngicas.
• Glicerol: mantiene húmeda la preparación. Una vez
preparado el colorante, se debe colocar la muestra
microbiológica en un portaobjetos por medio de
una impronta.
impresión de la muestra sobre una estructura
utilizando una cinta adhesiva transparente.
• Colocar el material necesario en la campana de
bioseguridad 2 A.
• Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
• Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente
aproximadamente de 2cm^2.
• Pegar los segmentos de cinta en una asa micológica.
• Poner una gota de azul de algodón en el portaobjetos.
• Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior del
hongo.
• Colocar la cinta sobre la gota azul de algodón y poner otra
gota de azul de algodón.
• Poner un cubreobjetos sobre la preparación.
• Observar en 40x.
• Manipulación de los hongos filamentosos:
siempre debe llevarse acabo en una campana de
seguridad tipo 2 A, ya que la mayoría de estos son
patógenos, y realizar una técnica inadecuada
puede poner en riesgo al personal.
Movimiento microbiano
• Secretan materiales viscosos en su superficie que son
polisacáridos o proteínas: algunas células procariotas.
• ¿Por qué estos materiales no se consideran parte de la
pared celular? Porque no aportan ninguna resistencia
estructural significativa para la célula.
• ¿Cómo pueden ser las capsulas y las capas mucosas
dependiendo su composición y su grado de
hidratación? Gruesas o finas, y rígidas o flexibles.
• ¿A qué se le denomina capsula? A dicho material que
se organiza como una matriz gruesa que no deja
penetrar pequeñas partículas. Están unidas firmemente
a la pared celular.
• ¿A qué se le denomina capa mucosa? A aquel material
que es fácilmente deformable, por lo que no excluirá a
las pequeñas partículas y resultará más difícilmente
observable. Están menos fijadas a la pared celular y
pueden desprenderse de la superficie celular.
• En las bacterias están relacionadas con la fijación de los
microorganismos a superficies solidas: capas
polisacáridos.
• Biofilm: gruesa capa de células que se forma por
bacterias no patógenas cuando se unen en la naturaleza a
superficies solidas.
• Desempeñan un papel esencial en el establecimiento de
biofilms: polisacáridos extracelulares.
• Estructuras filamentosas formadas por proteínas que se
prolongan desde la superficie celular y poseen varias
funciones: fimbrias y pelos bacterianos (Pili).
• Fimbrias: ayudan a los microorganismos a fijarse sobre las
superficies , como las de los tejidos animales en el caso de
bacterias patógenas, y a formar películas (finas capas de
células sobre la superficie de un medio liquido) o biofilms.
• Pelos o pili: similares a las fimbrias, pero típicamente son
estructuras más largas, y se presentan sólo uno o unos
pocos sobre la superficie celular.
• Además de unirse a las superficies (como las • Esporulación: proceso donde algunas especies del
fimbrias), menciona otras funciones de los pelos: dominio Bacteria producen intracelularmente unas
facilitar el intercambio genético entre células estructuras especiales llamadas endosporas.
procarióicas en el proceso de conjugación.
• Endosporas: células diferenciales,
• Los pelos se clasifican según: su estructura y extraordinariamente resistentes al calor, a agentes
función. químicos agresivos y a la radiación, que funcionan
como estructuras de supervivencia, capacitando así
• Movilidad a tirones: es una variedad de movilidad
al organismo para resistir condiciones adversas
por deslizamiento sobre una superficie solida y
como temperaturas extremas, desecación,
consiste en que se logra el desplazamiento de la
limitación de nutrientes, etc.
célula mediante la extensión y retracción de los
pelos. La energía para esto se obtiene de la hidrolis • Las endosporas representan el estado durmiente
ATP. de un ciclo de vida bacteriano del tipo: célula
vegetativa  endospora  célula vegetativa.
• Gránulos y otras inclusiones: actúan como
reservas de energía o como depósitos de
precursores para los componentes
macromoleculares y estructurales.

Endosporas
• Durante la formación de la endospora, una célula
vegetativa se convierte en: una estructura inerte y
termorresistente.
• ¿Cuándo esporulan las células? Cuando cesa el
crecimiento, debido a la desaparición de un
nutriente esencial, no cuando están en crecimiento. •
• Proceso por el cual la bacteria puede producir una
célula vegetativa de un modo relativamente
rápido: activación, germinación y crecimiento. • ¿Cómo teñir las endosporas? Se deben usar
• Activación: se logra fácilmente por calentamiento
de las endosporas recién formadas, a una
temperatura subletal pero elevada. Aquellas
activadas quedan condicionadas a germinar a
germinar cuando se colocan en presencia de
nutrientes adecuados.
• Germinación: proceso rápido que ocurre en
cuestión de minutos y supone la perdida de
refringencia de la espora, un aumento en la
capacidad de tinción por colorantes, y la perdida de
resistencia al calor y compuestos químicos.
• Crecimiento: hinchamiento visible de la célula debido a
la acumulación de agua y a la síntesis de RNA, proteínas
y DNA. A continuación la célula emerge una vez rota la
endospora y comienza a crecer, manteniendo el estado
vegetativo hasta que nuevamente detecta señales
ambientales que ponen en marcha la esporulación.
Estructura de las endosporas: aparecen como muy
refráctiles e impermeables a la mayoría de los
colorantes.
procedimientos especiales utilizando un protocolo
clásico con el colorante verde malaquita suministrado en
caliente.
• Estructura de la endospora (compleja por microscopia
electrónica): esta es muy diferente a la célula vegetativa
(con más capas) y se comprende de las siguientes capas:
• Exosporio: es la capa más externa, s una fina cubierta compuesta
por proteína.
• Cutícula o cubierta de la espora: formada por proteínas
especificas.
• Córtex: capa de peptidoglucano con uniones laxas.
• Núcleo: es la parte más interna, contiene la pared, la membrana
citoplasmática, el citoplasma, el nucleoide, los ribosomas y otros
orgánulos celulares esenciales.
• En que se diferencia estructural de la endospora • Diferencias en el núcleo de endosporas de las
de la célula vegetal: en el tipo de estructuras células vegetativas: además de los elevados
situadas fuera de la pared del núcleo de la espora. niveles de dipicolinaco cálcico que ayudan a reducir
el contenido en agua del núcleo de la endospora,
• Acido dipicolínico: compuesto químico
este se deshidrata de modo notable durante el
característico de las endosporas y ausente en las
proceso de esporulación y presenta solo el 10-25%
células vegetativas, se localiza en el núcleo de la
del contenido del agua de una célula vegetativa,
espora.
haciendo que la consistencia del citoplasma sea de
• Complejos de dipicolinaco cálcico: unión de acido la de un gel denso.
dipicolínico con Ca^2, sus complejos corresponden • Incrementa la termorresistencia de las
alrededor del 10% del peso seco de la endospora,
macromoléculas dentro de la endospora: la
los cuales reducen la disponibilidad de agua dentro
deshidratación del núcleo.
de las endosporas, favoreciendo su deshidratación;
también se intercalan con el ADN, insertándose • Temperatura estándar para la esterilización en un
entre las bases, estabilizando de este modo el ADN autoclave: a 121°C mata a las endosporas de la
frente a la desnaturalización por calor. mayoría de las especies, pero algunas endosporas
bacterianas sobreviven a 150°C.
• Similitudes en el núcleo de endosporas y células
vegetativas: ambas tienen una copia del
cromosoma y otros componentes celulares
esenciales.
Flagelos y movilidad
• Natación: propiedad que le da movilidad a los
procariotas por una estructura llamada flagelo.
• ¿Cómo funciona el flagelo? Por rotación,
impulsando a las células a través de un medio
liquido.
• Flagelos bacterianos: apéndices largos y finos que
se encuentran libres por un extremo y unidos a la
célula por el otro (15-20 nm de grosor).

Cálculos UNIDADES
FORMADORAS
Nutrición, cultivo y metabolismo microbiano
• Metabolismo: reacciones químicas que ocurren en
la célula antes de que esta se divida.
• Reacción catabólica (catabolismo): reacción
metabólica que libera energía.
• Reacción anabólica (anabolismo): reacción
metabólica que consume energía.
• Microorganismos quimioorganotrofos
(heterótrofos): microorganismos que utilizan
compuestos orgánicos como fuentes de carbono y
energía.