LABORATORIO

TRABAJO PRACTICO n:1

Normas básicas de Bioseguridad:

➢ Antes de ingresar al laboratorio se deberá colocar bata blanca o guardapolvo.

➢ Utilizar lentes de seguridad, mascarilla y guantes cuando sea necesario.
➢ Evitar el uso de faldas, shorts o zapatos abiertos.
➢ Las personas de cabello largo deberán sujetarlos mientras estén en el laboratorio.
➢ No se debe fumar, guardar o consumir alimentos y bebidas en el laboratorio.
➢ Lávate bien las manos antes y después de concluir una práctica.
➢ Al ser designado para trabajar en un determinado laboratorio, es muy importante conocer
la localización de los accesorios de seguridad.
➢ Antes de usar reactivos que no conozcas, consulta la bibliografía adecuada e infórmate
sobre como manipularlos y descartarlos.
➢ No devuelvas los reactivos a los frascos originales, así no hayan sido usados. Evita circular
con ellos por el laboratorio.
➢ No uses ningún instrumento para el cual no hayas sido autorizado a utilizar.
➢ Nunca pipetees líquidos con la boca. En este caso usa peras de plástico o trompas de vacío.
Señales de medidas de seguridad y elementos de protección personal:
MICROSCOPIA:

El microscopio es un instrumento que permite observar objetos no perceptibles a

al ojo humano. Esto se logra mediante un sistema óptico compuesto por lentes, que forman y
amplifican la imagen del objeto que se está observando.

Microscopio simple: conocido comúnmente como lupa. Está constituido por una sola lente.

Microscopio compuesto: se constituye por la combinación de dos o más sistemas de lentes

convergentes: uno, próximo al ojo del observador, el ocular y el otro próximo al objeto, denominado
objetivo.

Partes:

Pie: soporta el resto del microscopio, está constituido por una estructura metálica pesada.

Platina: es la estructura que sostiene el preparado que se desea observar.

Objetivos: Se insertan en el revólver del microscopio y se distinguen dos tipos:

Objetivos en seco: En éstos, el aire se interpone entre la lente y el preparado. Los objetivos más
comúnmente utilizados son de 4, 10, y 40 x.
Objetivos de inmersión: Se distinguen de los anteriores porque entre la lente y el preparado se debe
interponer un medio transparente con un índice de refracción (n) superior al del aire (n = 1), y
semejante al del vidrio (n = 1,5). El medio utilizado es un aceite de inmersión, como por ejemplo el
aceite de cedro. Son aptos para la observación de bacterias, finas estructuras, etc.

Ocular: Permite observar la imagen actuando como una lupa. Está compuesta por dos lentes: la
inferior o colectora, y la superior, o lente ocular.

Macrométrico y micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia
abajo. El macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de forma lenta.

Sistema de iluminación: Situado debajo de la platina, está formado por:

Lámpara.

Condensador: Posee la función de concentrar sobre el preparado los rayos luminosos procedentes
de la fuente de luz.

Diafragma: Situado debajo del condensador, sirve para graduar la cantidad de luz que llega al
objeto.

Portaobjetos:

Lámina de vidrio rectangular de color transparente utilizada para almacenar muestras y objetos con
el fin de observarlas bajo el microscopio. Las dimensiones típicas de un portaobjeto son de 75mm x
25mm, sin embargo, estas pueden variar dependiendo del tipo de objeto o muestra.
Observación microscópica de microorganismos:

El examen microscópico se realiza mediante preparaciones que deberán ser fijadas y teñidas en un
portaobjeto, esto nos brinda información sobre la célula bacteriana y su medio, su morfología,
agrupación y estructura.

Procedimientos:

Extensión: depositar en el centro de un portaobjeto con el asa de siembra 1 a 2 gotitas de

suspensión (que contiene microorganismos), luego expandimos la gota quedando ésta distribuida
de manera uniforme.

Fijación: una vez extendidos los microorganismos deberán ser fijados, mediante un método físico
como el calor. El calor mata a las bacterias y las adhiere al portaobjeto. Algunas técnicas tintoriales
como Gram o Ziehl -Neelsen requieren antes de su proceso la fijación de las muestras, con la
finalidad de preservar la arquitectura estructural y química de las células. Existen dos tipos de
fijadores: físicos y químicos. Entre los procesos de fijación físicos se tienen los siguientes:
desecación, calor seco, calor húmedo, ultrasonido y microondas, mientras que los procesos de
fijación químicos se pueden clasificar como oxidantes y reductores, de acuerdo con sus propiedades
químicas, ofrecen mejores resultados para la fijación, el metanol es el reactivo que se encuentra al
alcance de todos los laboratorios; es un reactivo reductor, deshidratador, y es clasificado como
fijador coagulante, de tal manera, coagula proteínas y las hace insolubles, pero sin desnaturalizarlas.
Se preserva la arquitectura de la pared celular y evita la sobre coloración.

Tinción: luego de haber fijado la muestra, procederemos a su tinción mediante diversos colorantes.
 Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para
el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Hay una gran variedad de tinciones, que se han ido
desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen
bacterias, parásitos y hongos. La tinción de Gram se considera básica en la valoración inicial de
muestras para análisis bacteriológico, mientras que la tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico
de enfermedades muy particulares en el rubro de la parasitología. Hay técnicas tintoriales
específicas de gran utilidad, como la tinción de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de
enfermedades crónicas como la tuberculosis o la actinomicosis, o la tinción de azul de lactofenol,
que preserva e identifica a los componentes estructurales de los hongos. Las diferentes tinciones en
el laboratorio microbiológico tienen una utilidad fundamental para el diagnóstico y tratamiento
oportuno de múltiples patologías de etiología infecciosa.

Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera. De
acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extraídos de plantas
o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y manipulados en el
laboratorio. Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al
microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que, por medio del uso de
colorantes, sea mucho más fácil su identificación; además, la presencia de ciertas estructuras, así
como su reacción a determinadas técnicas, nos permite clasificar a las bacterias.

Los colorantes tienen las siguientes funciones:

✓ Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.

✓ Revelan su forma y tamaño.
✓ Muestran la presencia de estructuras internas y externas.

Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se
utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial, cuando se visualiza
más de un color porque se utiliza más de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica,
cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para identificar una
estructura celular en particular (inmunocitoquímico).
 Tinción de Gram

Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en
dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. Es una de las tinciones
más utilizadas universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta.

Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las
bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La pared celular
de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano y una
membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular
gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la
composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram
negativas y Gram positivas explica y determina las características tintoriales.
Técnica:

1. La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta durante 1
minuto, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Eliminar el colorante y lavar suavemente con agua.
2. Posteriormente, se coloca Lugol durante 1 minuto, el cual sirve como mordiente e impide
la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violeta-yodo que satura
los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana.
Eliminar el Lugol y lavar con agua.
3. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona durante 15 – 30 segundos, la cual
deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma (decolora), también destruye
la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble a la
acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol acetona. Las bacterias Gram
positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este
complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad
de peptidoglicano.
Eliminar al alcohol acetona y lavar con agua.
4. Por último, se coloca safranina (contraste) durante 1 minuto, la cual funciona como un
colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las bacterias que no pudieron
retener el complejo cristal violeta-yodo.
Eliminar el colorante de contraste y lavar con agua.
5. Secar el portaobjeto con papel absorbente y/o exponerlo de forma suave a la llama del
mechero.
6. Observar la preparación en microscopio.
Las muestras útiles para su uso son líquidos estériles, biopsias para cultivo, abscesos, hisopados,
crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo. Las bacterias Gram positivas se observan de
color azul obscuro a morado, mientras que las Gram negativas se observan de color rosa a rojo.

Observación en microscopio:
 Tinción de Ziehl-Neelsen

Es una técnica rápida, fácil y de bajo costo, lo que permite que se pueda realizar en casi cualquier
laboratorio. Es comúnmente utilizada en el diagnóstico rutinario de tuberculosis.

Las bacterias a las que comúnmente se las denomina ácido-alcohol resistentes (género
Mycobacterium) tienen la característica fundamental de ligar a su pared celular, la fucsina y resistir
la decoloración posterior, con ácidos fuertes (ácido clorhídrico, ácido nítrico, etc.). Esta propiedad
es debida al alto contenido lipídico de las paredes celulares de las micobacterias. La tinción de Ziehl-
Neelsen es una coloración diferencial útil para detectar bacterias acido-alcohol resistentes, aunque
no permite la diferenciación de distintas especies. La pared celular de las micobacterias es
extremadamente compleja en cuanto a su composición bioquímica; la pared celular está compuesta
por ácido mesodiaminopimélico, alanina, ácido glutámico, glucosamina, ácido murámico, arabinosa
y galactosa. Los ácidos micólicos junto con lípidos libres proveen a la célula de una barrera
hidrofóbica. Otros ácidos grasos importantes son: ceras, fosfolípidos, ácidos micoséricos y
phtienoico.
Técnica:

La tinción se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparación ligeramente para solubilizar

las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular para que permita el paso libre del
colorante, el cual tiene una enorme afinidad por los ácidos micólicos presentes en la pared. Al enfriar
con agua, los componentes de la pared vuelven a solidificar, resistiendo la acción abrasiva del
alcohol-ácido, y el azul de metileno se utiliza como contratinción.

1. Realizar un extendido sobre un portaobjeto limpio y desengrasado.

2. Fijación: se realizará pasando sobre la llama, 3 a 4 veces, la superficie opuesta al extendido,
evitando el sobrecalentamiento (60°C).
3. Colocar el portaobjeto sobre dos varillas de vidrio.
4. Cubrir el preparado durante 1 minuto, con solución de Fucsina.
5. Embeber un hisopo con alcohol, encender y pasarlo por debajo del preparado hasta
desprendimiento de vapores blancos (evitar la ebullición). Dejar actuar la Fucsina durante 5
minutos. Mientras actúa la Fucsina, repetir el procedimiento con el hisopo, cada 90
segundos.
6. Lavar con agua.
7. Lavar con la solución decolorante hasta que no se observe desprendimiento de Fucsina.
Lavar con agua.
8. Cubrir con la Solución Azul de Metileno durante 1 minuto.
9. Lavar con agua y secar.
10. Observar en microscopio. Resultado: Los bacilos ácido-alcohol resistentes aparecerán de
color rojo, sobre fondo azul.
Las muestras clínicas útiles para su uso son múltiples, como el líquido cefalorraquídeo, líquido
pleural, líquido sinovial, líquido pericárdico, biopsias para cultivo, abscesos, aspirados, crecimiento
de colonias aisladas en medios de cultivo, expectoraciones, aspirados endotraqueales y lavados
bronquio alveolares. Una tinción positiva es aquélla en la que se observan bacilos ácido-alcohol
resistentes, los cuales son de color rojo fucsia.

Observación en microscopio:
Morfología bacteriana:

Refiere al tamaño de las bacterias, están en el rango de los 0,5 hasta los 10 micrómetros, por esta
razón es necesario utilizar el microscopio para observarlas. Su forma se relaciona con la rigidez de
su pared celular, las bacterias se diferencian según su forma en:

Cocos: Son bacterias con forma esférica, su tamaño va de 0,6 a 1 micrómetro. Los subtipos de cocos
se relacionan con el modo en que se dividen y la forma en que se agrupan, así los que permanecen
separados y unitarios se denominan cocos, si permanecen en pares diplococos, los que forman
cadenas estreptococos y los que forman racimos estafilococos. El modo en que se agrupan suele ser
usada como característica morfológica para su clasificación e identificación.

Bacilos: Son bacterias alargadas y rectas en forma de bastón, difieren entre especies por su anchura,
longitud y la forma de sus extremos. En los bacilos el modo en que se agrupan no suele tener
relevancia para su clasificación e identificación.

Espirilos y espiroquetas: Son bacterias en forma de espiral, se agrupan en los de espira rígida
llamados espirilos y los de espira flexible denominados espiroquetas. Para efectos de su clasificación
se tienen en cuenta la longitud de la vuelta, la presencia o ausencia de envoltura externa, el ángulo
formado por los extremos de la célula y la composición del filamento axial.
Observación microscópica de morfología bacteriana con tinción de Gram:
Observación en microscopio electrónico de barrido: