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13 DE ABRIL DE 2018

OBSERVACIONES MACROSCÓPICAS
OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

DOCENTES:
STELLA, LAURA INES
GARCIA, ROCIO

ALUMNO: NOLTE RAFAEL


COMISIÓN 5
UTN FRRe
1 Biotecnología Observaciones Macroscópicas– Cultivo de Microorganismos UTN FRRe

Objetivos
 Asimilar las técnicas necesarias para el estudio de la morfología microbiana a partir del uso
del microscopio óptico.
 Introducir a la aplicación de normas de bioseguridad y técnicas asépticas.

Introducción
Los microorganismos pueden definirse como un conjunto de formas de vida agrupados por
conveniencia del hombre para su estudio, y que constituyen organismos no observables a simple
vista. Para lograr apreciar su existencia es necesaria la ayuda de microscopios, conformando su uso
una de las técnicas principales de observaciones microscópicas para el estudio de la morfología de
dichos organismos. La observación microscópica permite ejemplificar la gran diversidad del mundo
microbiano, además de ser útil junto a pruebas bioquímicas y fisiológicas para la identificación de
microorganismos y determinación de su ubicación taxonómica. Una de estas técnicas que se
complementan con el uso del microscopio para el reconocimiento de microorganismos es la tinción
diferencial de Gram. La tinción de Gram es una técnica que se basa en la medida en que las células
de los microorganismos retienen o no un colorante determinado, distinguiendo entre dos grandes
grupos de bacterias: las que retienen un primer colorante o Gram positivas; y aquellas que no
retienen el primer colorante pero si retienen un colorante de contraste, es decir, Gram negativas.
El factor determinante de que el resultado de la tinción sea una coloración u otra depende
estrictamente de la estructura de las paredes celulares de los microorganismos, y no de su
composición química.

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Materiales
 Paño o trapo
 Vaso de precipitado
 Pisetas
 Portaobjetos
 Varas de vidrio
 Ansa
 Cajas de Petri (con cultivo desarrollado)

Instrumentos
 Mechero
 Microscopio óptico

Reactivos y/o sustancias


 Agua destilada
 Detergente
 Lavandina
 Alcohol
 Colorante 1: violeta cristal
 Mordiente: solución Lugol (I2-IK)
 Decolorante: mezcla etanol-acetona 70:30
 Colorante 2 (de contraste): safranina

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Desarrollo
La puesta en marcha de esta experiencia comenzó con el acondicionamiento, en términos de
asepsia, de los materiales y del ambiente donde se iba a trabajar. De este modo se aseguraba
trabajar en condiciones de esterilidad y seguridad. Hecho esto se procedió a realizar las tareas
principales que hacen al práctico, como ser la preparación de un frotis de una muestra de una
colonia desarrollada a partir del práctico anterior, sobre un portaobjetos, con su posterior tinción y
observación bajo microscopio. En esta ocasión se desarrolló la técnica de tinción diferencial de Gram
con el propósito de reconocer la presencia de microorganismos pertenecientes al grupo G(+) y/o
también G(-).

La preparación del frotis tiene como tarea primaria su correcta limpieza y desengrasado, utilizando
agua corriente en primera instancia, luego enjuagues con agua destilada y por ultimo alcohol para
retirar grasas que pudieran contaminarlo durante su manipulación. A este portaobjetos se lo
sometió a las cercanías de la llama de un mechero para secarlo rápidamente. Una vez finalizada esta
tarea se procedió a fijar las células en el portaobjetos, lo cual requirió una gota de agua sobre el
mismo y una pequeña porción de microorganismos tomados de la colonia seleccionada, por medio
de un ansa de ojal. Con ayuda del ansa se integró el cultivo en la misma gota, y luego fue llevada a
columna de aire caliente sobre la llama para fijar las células y evitar pérdidas de material.

La última etapa mencionada da por finalizada la realización del frotis lo cual dio lugar a proceder
con la tinción de Gram, con los portaobjetos dispuestos sobre dos varas de vidrio ubicadas sobre las
piletas de lavado. Para la tinción de Gram se requirió de 4 soluciones: un primer colorante de violeta
cristal, una solución mordiente de yodo-yoduro de potasio, una mezcla 70:30 de etanol-acetona
usada como decolorante, y por ultimo un colorante de contraste (safranina o fucsina). En primer
lugar se usó el primer colorante a modo de dejarlo durante un minuto sobre el portaobjetos con el
fin de que penetre en las células. Pasado el tiempo mencionado el portaobjetos se enjuago y se le
agrego la solución mordiente durante un minuto. Luego de esto se enjuago y se utilizó la solución
decolorante durante unos pocos segundos para evitar decoloraciones excesivas y se volvió a lavar
el portaobjetos, siempre con agua corriente. Al final se utilizó el segundo colorante, tratando al
portaobjetos durante unos quince o treinta segundos, con su posterior enjuague con agua corriente
y secado sobre columna de aire caliente. Finalizados estos pasos se concluyó con la tinción de Gram
propiamente dicha.

Con el portaobjetos ya preparados se dispuso del microscopio óptico para llevar a cabo las
observaciones microscópicas. Dicha etapa requería de realizar en primera medida el enfoque del
microscopio utilizando los tornillos de enfoque: el macrométrico para aproximarse y el
micrométrico para dar el enfoque adecuado ajustando la nitidez con que se apreciaba la imagen.
Cabe destacar que para el enfoque fue imperativo trabajar a partir del lente objetivo de menor
aumento, es decir el 10x, lo cual daba un aumento de 100 veces considerando el aumento de los
oculares. Una vez ajustado el enfoque se procedió a rotar el revolver a modo de pasar al lente
objetivo de 40x, obteniendo una imagen 400 veces aumentada, y por último se ajustó al objetivo de
100x. Es válido aclarar que a este aumento de imagen la sección observada iba siendo cada vez más
restringida, y que a este nivel de aumento solamente se lograba la observación de los
microorganismos tomados

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Las observaciones microscópicas fueron reforzadas debido a que previamente se realizaron


observaciones de placas realizadas y proporcionadas a la práctica, para adquirir mayor destreza en
la visualización de los microorganismos. Para ello, la catedra dispuso de un portaobjetos en el cual
se observaban cocos G (+), y otra placa con Bacilos G (-).

Observaciones y Resultados:
Portaobjetos preparados, aportados por la Catedra.

En esta placa pueden


identificarse, a partir de
su forma, varios
microorganismos del tipo
Bacilos. La coloración
fucsia rosada adquirida
por los mismos se debe a
la tinción de Gram,
develando que se
trataban de
microorganismos Gram
Negativo.
Para esta placa, según la
forma que se ve puede
inferirse que se tratan de
organismos con forma de
Cocos. En cuanto al color
adoptado por la tinción
de Gram, se aprecia una
coloración violácea
azulada, lo cual da lugar a
establecer que se trataba
de microorganismos
Gram Positivos.

Portaobjetos preparados por la comisión de alumnos

Si bien se empleó el lente objetivo de


100x dando un aumento de imagen
de 1000 veces, con lo cual deberían
visualizarse los microorganismos, en
esta placa preparada por la comisión
de alumnos no se lograron distinguir
bacterias de ninguna clase. Solo se
lograron visualizar manchas debidas
al colorante y formas irregulares.

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Conclusión/es
A lo que respecta los objetivos propuestos para esta experiencia lograron alcanzarse en forma
parcial. Si bien lo que hace a la tinción fue interpretado de manera correcta, pudo no haberse
desarrollado de manera correcta, puesto que no se pudo reconocer ningún microorganismo en los
portaobjetos preparados. A lo que refiere las observaciones microscópicas, si lograron alcanzarse
los objetivos establecidos ya que, gracias al aporte de la catedra se pudo observar dos clases de
bacterias diferentes en cuanto a su forma, además de pertenecer un grupo a las G(+) y las otras a
las G(-). Esto último permitió que se reforzaran los conocimientos ya estudiados desde el punto de
vista teórico acerca de la técnica de tinción de Gram.

Bibliografía
 http://www.fmed.uba.ar/depto/microbiologia/catedra2/sem101.pdf
 Aquiahuatl Ramos, María de los Ángeles. Manual de prácticas de laboratorio de
microbiología general. Primera edición. Año 2004.