ORAC AND TEAC ASSAYS COMPARISON TO

MEASURE THE ANTIOXIDANT CAPACITY

OF FOOD PRODUCTS
 ABSTRACT
Se compararon los ensayos de capacidad antioxidante de radicales de
oxígeno (ORAC) y capacidad antioxidante equivalente de trolox (TEAC)
para estimar la capacidad antioxidante total (TAC) del jugo de naranja, la
leche y una bebida de jugo de naranja y leche.
 ABSTRACT

También se evaluó la influencia de ciertos compuestos (ácido

ascórbico, ácido gálico, β-caroteno, luteína, zeaxantina y
albúmina) con capacidad antioxidante que estaban presentes en
las muestras estudiadas.
 ABSTRACT
Cuando se utilizó el método TEAC con un aumento en la concentración de
jugo de naranja correspondió a un aumento en el TAC, pero al aumentar el
porcentaje de leche no aumentó el valor del TAC.
 ABSTRACT
Cuando se aplicó el método ORAC, se observó que mayores
concentraciones de jugo o leche correspondían a una mayor capacidad
antioxidante.
 ABSTRACT
Aunque el método TEAC es más simple y económico que el método
ORAC, subestima la capacidad antioxidante de alimentos o bebidas de
naturaleza más compleja.
 1. INTRODUCTION
“La medida de la capacidad antioxidante de los productos alimenticios es
un asunto de creciente interés porque puede proporcionar una variedad de
información, como la resistencia a la oxidación, aporte cuantitativo de
sustancias antioxidantes, o la actividad antioxidante que pueden
presentarse dentro del organismo cuando se ingieren”
(Huang, Ou, 2005; Serrano, Goñi, & Saura-Calixto, 2007).
Las mezclas de jugos de frutas y leche son un tipo de bebida presente en el
mercado que tiene la ventaja de ofrecer un solo producto que contiene
vitamina C, carotenoides y compuestos fenólicos(del fruto), junto con
proteínas y calcio ( de la leche).
 INVESTIGACIONES
“la fruta aporta los mayores aportes de antioxidantes en la dieta, principalmente por su
abundancia de vitaminas, compuestos fenólicos y carotenoides” Wu et al. (2004)
Pulido, Hernández-García y Saura-Calixto (2003) : calcularon
que Los zumos de frutas contribuyen (aproximadamente un 5-6%) a la capacidad antioxidante
total de la dieta española.
Por otro lado, diversos estudios han demostrado que la leche y algunas fracciones de la leche
(suero,caseínas, lactoferrina, albúmina) tienen actividad antioxidante (Chen, Lindmark-
Mansson, Gorton, & Akesson, 2003; Peña-Ramos & Xiong,2001; Rival, Boeriu y Wichers,
2001),
y recientemente un péptido de la leche ha sido identificado (Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ser-
Asp-Ile)con una capacidad antioxidante superior a la del butiladohidroxianisol (BHA)
(Hernández-Ledesma, Dávalos, Bartolomé,& Amigo, 2005).
Se han realizado numerosos estudios in vitro para evaluar la capacidad
antioxidante total (TAC) de los productos alimenticios, sin embargo,no
existe un método estandarizado oficial, por lo que se recomienda que cada
evaluación se haga con varias condiciones de oxidación y diferentes
métodos de medición (Frankel & Mayer, 2000).
Los métodos para medir la capacidad antioxidante básicamente se
clasifican en dos grupos, dependiendo de la reacción mecanismo:
métodos basados en la transferencia de átomos de hidrógeno (HAT)
métodos basados en la transferencia de electrones (ET)
(Huang et al., 2005).
La mayoría de los ensayos basados en HAT aplican un esquema
competitivo, en qué el antioxidante y el sustrato que compiten por los
radicales peroxilo son generados térmicamente a través de la
descomposición de azo-compuestos.
Los ensayos basados en ET miden la capacidad de un antioxidante en la
reducción de un oxidante, que cambia de color cuando se reduce. El grado
del cambio de color se correlaciona con el antioxidante de la muestra.
Los ensayos de capacidad antioxidante equivalente de Trolox (TEAC) y
capacidad antioxidante de radicales de oxígeno (ORAC) son los más
populares.utilizaron los métodos ET y HAT, respectivamente
El ensayo TEAC o 2,20-azinobis (ABTS)
se basa en la eliminación del catión radical ABTS+ por parte de los
antioxidantes presentes en una muestra,tiene un color verde azulado con
valores máximos de absorbancia a 645 nm, 734 nm y 815 nm (Re et
al., 1999).
Cuando hay compuestos antioxidantes en el medio de reacción,captan el
radical libre, lo que se traduce en una pérdida de color y por tanto una
reducción de la absorbancia, correspondiente cuantitativamente a la
concentración de antioxidantes presentes.
El método ORAC, desarrollado inicialmente por Cao, Alessio y Cutler (1993) consiste en
medir la disminución de la fluorescencia de una proteína como consecuencia de la pérdida de
su conformación cuando sufre daño oxidativo causado por una fuente de radicales
peroxilo(ROO).
El método mide la capacidad de los antioxidantes en la muestra para proteger la proteína del
daño oxidativo.
La proteína utilizada en el método original era b-ficoeritrina (b-PE), pero tenía una serie de
desventajas, como la inconsistencia entre lotes, fotosensibilidad e interacción con compuestos
fenólicos debido a la unión inespecífica a proteínas. Para resolver estoproblema, Ou,
Hampsch-Woodill y Prior (2001) propusieron utilizar fluoresceína como proteína diana.
La capacidad antioxidante de los alimentos depende de muchos
factores,incluyendo las propiedades coloidales de los sustratos, las
condiciones y etapas de oxidación, y la localización de antioxidantes en
diferentes fases (Frankel & Meyer, 2000).

tomado de https://www.intagri.com/articulos/nutricion-vegetal/antioxidantes-a-tendencia-en-el-consumo-de-alimentos
Además, la medida La capacidad antioxidante de una muestra depende de
qué tecnología y qué generador de radicales libres u oxidante se usa en la
medición. En consecuencia, la comparación de diferentes métodos
analíticos para determinar el TAC es un factor clave para ayudar a los
investigadores a elegir un método y comprender el resultado obtenido.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de la matriz (jugo de
naranja, leche y una bebida de jugo de naranja-lácteo) sobre la capacidad
antioxidante total, utilizando dos métodos de medición(ORAC y TEAC),
basados en diferentes mecanismos de reacción.
 2.3. ENSAYO TEAC
El método utilizado fue el descrito por Re et al. (1999)
basado en la capacidad de una muestra para inhibir el radical ABTS
(ABTS+) en comparación con un estándar antioxidante de referencia
(Trolox).
El radical fue generado por reacción química con persulfato de potasio
(K2S2O8).
Para ello, se enriquecieron 25 ml de ABTS (7 M) con 440 µl de K2S2O8
(140 M) y se dejó reposar en la oscuridad a temperatura ambiente durante
12–16 h (el tiempo requerido para la formacióndel radical).
La solución de trabajo se preparó tomando un volumen de la solución
anterior y diluyéndola en etanol hasta una absorbancia
ƛ = 734 nm fue de 0,70 ± 0,02.
La medición se hizo en un espectrofotómetro conectado a un baño
termostatizado a 30 °C.
La reacción tuvo lugar directamente en la cubeta de medición.
Para ello, se añadieron 2 ml del radical ABTS+; la absorbancia (A0)se
midió y se añadieron 100 µl de muestra, momento en el cual los
antioxidantes presentes en la muestra comenzaron a inhibir el radical,
produciendo una reducción en la absorbancia, con una relación
cuantitativa entre la reduccióny la concentración de antioxidantes
presentes en la muestra.
Para obtener una correcta medición, las muestras fueron previamente
diluidas con agua bidestilada hasta un porcentaje de inhibición de 20–
80%.
Al mismo tiempo, se realizó una curva de calibración de trolox, preparado
para un rango de concentración de 0–250 M,
El porcentaje de inhibición obtenido para la muestra fue interpolado para
calcular la concentración en equivalentes de trolox (1M TE).
 2.4. ENSAYO ORAC
El método ORAC utilizado, con fluoresceína (FL) como "sonda
fluorescente", fue el descrito por Ou et al. (2001)
El ensayo ORAC se llevó a cabo con filtros de fluorescencia para una
excitación de la longitud de onda de 485 nm y una longitud de onda de
emisión de 535 nm.
Las mediciones se realizaron en placas con 96 de fondo plano blanco
pozos.
la reacción se realizó a 37 °C ya que la reacción se inició por
descomposición térmica de AAPH en tampón de fosfato 75 mM (pH 7,0)
debido a la sensibilidad de FL al Ph.
Dado que el ensayo ORAC es extremadamente sensible, las muestras
deben ser diluido adecuadamente antes del análisis para evitar
interferencias.
Se preparó una solución madre de FL pesando 44 mg de FL,disolviéndola
en 100 ml de tampón fosfato (PBS) (75 mM, pH7.0),
se almaceno en completa oscuridad bajo refrigeración.
La solución de trabajo (78 nM) se preparó diariamente por dilución de
0,167 ml de la solución madre en 25 ml de fosfato buffer.
El radical AAPH (221 mM) se preparó diariamente tomando 600 mg de
AAPH y completando hasta 10 ml con PBS.
El estándar utilizado fue una solución de Trolox 20 lM que se preparó
diariamenteen PBS a partir de una solución estándar madre 1 mM
mantenida en el congelador a 20°C.
las muestras de leche tenían que ser diluidas 1:500
El jugo-leche y las muestras de jugo de naranja tuvieron que ser diluidas 1:250 para
que la solución resultante sea transparente.
En cada pozo, 50 µl de FL (78 nM) y 50 µl de muestra, en blanco (PBS), o estándar
(trolox, 20 lM), y luego 25 µl de Se añadieron AAPH (221 mM).
Las variaciones en la medida puede surgir entre un pozo y otro debido a la baja
conductividad de las placas de polipropileno. Para evitar este problema, la placa se
calentó a 37 °C durante 15 min antes de la adición de AAPH.
la fluorescenciarescencia se midió inmediatamente después de la adición y las
mediciones luego se tomaron cada 5 min hasta que el relativo intensidad de
fluorescencia (FI%) fue inferior al 5% del valor de la inicial.
 3.1. PARÁMETROS ANALÍTICOS DE
LOS MÉTODOS ORAC Y ABTS
Se obtuvo una curva de calibración trazando el área bajo la curva (AUC)
contra concentraciones de trolox en el rango de 0–100 µM.
La ecuación de la curva de calibración fue:
y = 31.983 x + 999.57con un buen coeficiente de correlación (r2 = 0,991)
la precisión del método se calculo mediante seis repeticiones consecutivas
de una sola muestra y por determinación de la capacidad antioxidante de 6
alícuotas independientes de la muestra,respectivamente.
La precisión instrumental expresada como coeficiente de variación fue de
5.2% y la precisión del método fue 6,7%.
El límite de detección (DL) se evaluó sobre la desviación estándar de la
respuesta del blanco y la pendiente usando la razón 3.3 r/S, donde r es la
desviación estándar de la respuesta de blanco y S es la pendiente de la c
obtenido al analizar n = 10 espacios en blanco, fue igual a 78,7.
El DL fue 8.1y el límite de cuantificación (QL) utilizando la relación 10
r/S fue de 24,6 µM TE
El DL y QL reportados en el trabajo original por Ou et al. (2001) fueron 5
µM TE y 12,5 µM TE, respectivamente.
La robustez del método se evaluó analizando una Solución de trolox 20 µM durante un
período de 7 semanas con una medición por semana.
La reproducibilidad así analizada y expresada como coeficiente de variación fue de
9.9%.
Durante el ensayo ABTS, se siguió la disminución de la absorbancia para monitorear
el consumo del radical ABTS + coloreado.
Él ecuación de la curva de calibración fue y = 0.2183x – 1.3133 con un
buen coeficiente de correlación (r2 = 0,997).
La precisión instrumental expresado como coeficiente de variación, fue de
5.1% y la precisióndel método fue del 5,7%. La detección y
cuantificaciónLos límites obtenidos fueron 10,5 µM TE y 31,9 µM TE,
respectivamente
Para el ensayo ABTS, se evaluó la solidez del método mediante el análisis
de una solución de trolox de 50 µM. La reproducibilidad, expresada como
coeficiente de variación, fue de 8.5%.
 3.2. VALORES ORAC Y TEAC
Para verificar la eficiencia de cada método en la medición de capacidad antioxidante,
evaluamos varios estándares de vitaminas y otros compuestos con capacidad antioxidante
presentes en las muestras que están disponibles comercialmente:
ácido ascórbico (AA), acido gálico, b-caroteno, luteína, zeaxantina y albúmina. algunos
autores atribuyen la principal capacidad antioxidante de la leche a la fracción de caseína,pero
los estándares de caseína aún no están disponibles comercialmente.
Se prepararon ácido ascórbico, ácido gálico y albúmina disolviendo en agua destilada,
mientras que los carotenoides se diluyeron en etanol debido a su naturaleza lipofílica.
Como se puede observar, la capacidad antioxidante obtenidapara AA por el ensayo TEAC es superior
al valor obtenidopor ORAC.
Los resultados obtenidos para el ácido gálico son similares para los dos métodos, y la capacidad
antioxidante de la albúmina fue mayor con el método ORAC que con TEAC.
Cao y Prior (1998) encontraron que la contribución de AA a TAC en suero humano fue dos veces
mayor en el método TEAC que con el método ORAC, mientras que la albúmina contribuyeron por
igual en los dos métodos. La capacidad antioxidante de los carotenoides medida por el método TEAC
seguido el orden: b-caroteno > luteína > zeaxantina.
Estos resultados coinciden con los obtenidos por Miller, Sampson,
Candeias,Bramley y Rice-Evans (1996).
Sin embargo, con el método ORAC,las xantofilas (luteína y zeaxantina)
tuvieron valores más altos que b-caroteno, lo que podría deberse a la
presencia de grupos OH en los anillos terminales.
También preparamos curvas de concentración para AA (20–40 mg/100
ml), ácido gálico (50–120 mg/ml) y albúmina (35–45 g/l) para verificar la
respuesta de los dos métodos a diferentes concentraciones de estos
compuestos.
Cuando la concentración de AA aumentó, la capacidad antioxidante
aumentó con los dos métodos (p < 0,01), TEAC (r2 = 0,968) y ORAC (r2
= 0,958). Lo mismoe observaron resultados para el ácido gálico (r2 =
0.931 y r2 = 0.981, paraTEAC y ORAC, respectivamente).
Sin embargo, la concentración de albúmina correlacionó con la capacidad
antioxidante total con el método ORAC (r2 = 0,946), pero esto no
sucedió con el método TEAC (r2 = 0,678).
La vitamina C reaccionó rápidamente con el radical
ABTS+, alcanzando inhibición máxima después de una
reacción de un minuto y constante en el tiempo,
resultados que concuerdan con los obtenidos por Reet al.
(1999).
Sin embargo, el ácido gálico, la albúmina y los carotenoides mantuvieron
su acción inhibidora durante más tiempo, por lo que sería necesario
optimizar el tiempo de inhibición en la medida de TAC para el método
TEAC. Re et al. (1999) estimado que el tiempo de medida de la inhibición
osciló entre 1 y 6 minutos.
3.3. COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS ORAC Y TEAC PARA
MEDIR EL ANTIOXIDANTE DE BEBIDAS A BASE DE JUGO Y
LECHE
Los valores de la capacidad antioxidante total del jugo de naranja y bebida láctea (50:20,
v/v) analizada con los métodos ORAC y TEAC(tiempo de inhibición = 3 min) fueron 9648
± 361 lM TE y3028 ± 146 µM TE, respectivamente.
La capacidad antioxidante obtenida para jugo de naranja fue 10897 ± 593 µM TE (ORAC) y
4875 ± 293 µM TE (TEAC) mientras que, para la leche desnatada (0,1% de materia
grasa),ellos valores de capacidad antioxidante fueron 20867±742 µMTE(ORAC) y 2649 ±
91 µM TE (TEAC).Las diferencia en las capacidades antioxidantes (µM TE) encontradas
con los dos métodos se debieron a los diferentes naturaleza de los dos ensayos.
 ESTUDIOS
Para el jugo de naranja se obtuvieron resultados similares con ensayos TEAC de:
Proteggente, Saija, De Pasquale y Rice-Evans (2003), quien encontró valores de 4790 ± 80
µM TE
para el Navel variedad, por Pellegrini et al., 2003), quienes obtuvieron un valor de 3020 µM
TE,
y por Arena, Fallico y Maccarone(2001), quienes calcularon un valor de 5090 µM TE para
jugo recién exprimido.
Usando el ensayo ORAC, Wang et al. (2004) obtuvo un menor capacidad antioxidante para el
jugo de naranja (6820 µM TE) que el valor obtenido en el presente estudio. Esto podría
explicarse por el uso de b-PE como sonda fluorescente en lugar de FL, ya que, como Ou et
al.2001), los resultados obtenidos con el uso de FL son doso tres veces mayores que las obtenidas
con b-PE.
Con respecto a la capacidad antioxidante en muestras de leche, Chen et al.(2003) obtuvo un valor
de 1246–4560 lM TE (dependiendo del pH del medio de reacción) para leche desnatada con el
TEAC y de manera similar a nuestros resultados, Wegrzyn et al. (2008) encontrópara leche
desnatada reconstituidacapacidad de alrededor de 20.000 lM TE.
Para determinar los aportes de la leche y el jugo de naranja en la bebida, preparamos tres
combinaciones independientemente:
(1) la bebida original, consistente en jugo, leche y agua (50:20:30, v/v)
(2) jugo y agua (50:50, v/v),
(3) leche y agua (20:80, v/v) respetando las proporciones de lamezcla original..Los resultados
obtenidos se muestran en la Tabla 3, en la que se muestra que lasuma de los valores ORAC
en la mezcla de jugo y agua (50:50) másla mezcla de leche y agua (20:80) daría un valor
cercano ala de la combinación de jugo y leche (50:20).
Sin embargo cuando hicimos la medición con el ensayo ABTS, la leche dio una menor valor
para la capacidad antioxidante que el jugo, y el jugo y la combinación de leche no
correspondía a la suma de los dos mezclas separadas pero fue similar al valor para el jugo y
combinación de agua (50:50, v/v).
Esta observación sugiere que la capacidad antioxidante encontrada con el ensayo ABTS se
debió a la fracción correspondiente al jugo. el porcentaje de leche en la bebida no se reflejó en
incrementosen la capacidad antioxidante
Los mismos resultados fueron observado por Chen et al. (2003) cuando
utilizaron el ensayo TEAC para determiner la capacidad antioxidante de la
leche, de modo que la gráfica de las concentraciones crecientes de leche
frente a la reducción de la absorbancia no fue lineal.Cuando se usó el
ensayo ORAC para realizar la misma prueba,concentraciones crecientes
de jugo o leche (Fig. 7) correspondieron a una mayor capacidad
antioxidante, y en ambos casos hubo un ajuste significativo a una recta
lineal
Estos resultados pueden deberse al hecho de que el jugo de naranja es
principalmente rico en ácido ascórbico (52 mg/100 ml), que, como se ha
visto en la anterior sección, reacciona rápidamente con el radical ABTS, y
su acción es favorecido por este método porque es una reacción redox.
pellegriniet al. (2007) encontraron que los antioxidantes solubles en agua
eran los principales contribuyentes al TAC en jugo de naranja, y el ácido
ascórbico demostró serel principal antioxidante en los jugos con leche que
hay en el mercado(Zulueta et al., 2007).
Sin embargo, la contribución de los antioxidantes hidrosolubles (ácido
úrico, vitamina C) en la leche, especialmente desnatada, es muy modesta;
Su principal capacidad antioxidante reside en la fracción liposoluble y en
la fracción proteica que tiene un potente efecto antioxidante porque está
compuesto de aminoácidos, como tirosina, triptófano, histidina, lisina y
metionina
(Chen et al., 2003; Rival et al., 2001).
Hernández-Ledesma et al. (2005) encontraron que los compuestos
fenólico e indólico grupos de Trp y Tyr en la leche tenían una habilidad
especial para actuar como hidrógeno donantes, siendo los responsables de
la capacidad antioxidante mostrada por estos aminoácidos. Por eso, como
el método ORAC es una reacción basado en la transferencia de átomos de
H, estos grupos presentes en la leche puede estar mejor representado por
este ensayo.
 3.4. CORRELACIÓN ENTRE LOS MÉTODOS TEAC Y ORAC PARA JUGO Y BEBIDAS LÁCTEAS

Al comparar los resultados de capacidad antioxidante obtenidos conel

método TEAC y el método ORAC encontramos buenas correlaciones
cuando cambia la concentración de jugo de naranja (r = 0.955, p <
0.05),ya que da un aumento del TAC con ambos métodos.
Sin embargo, hay no hay correlaciones estadísticamente significativas
entre los dos métodos cambios en la concentración de la leche, ya que los
cambios no dar un aumento de TAC con el método TEAC.
Diversos autores han obtenido correlaciones entre los resultados encontrado tras
analizar la capacidad antioxidante con el TEAC y Métodos ORAC.
Sin embargo, esto parece ser para alimentos en los que los principales antioxidantes
son hidrosolubles y, como se ha visto, la acción de estos antioxidantes se lleva a cabo
fácilmente con ambos métodos.
 ESTUDIOS
• protegidaet al. (2002) encontraron una buena correlación entre el
ORAC,Métodos FRAP (poder antioxidante reductor férrico) y TEAC
paravarias frutas y verduras.
• Taipong, Boonprakob, Crosby, Cisneros...Zevallos y Hawkins (2006)
obtuvieron propiedades antioxidantes comparables resultados de
capacidad para jugo de guayaba con el TEAC, DPPH, FRAP y métodos
ORAC, y Stintzing et al. (2005) encontraron correlaciones
significativas(r = 0.974) entre los métodos ORAC y TEAC para jugo de
pera.
 CONCLUISONES
Concluyeron que el método ORAC debe considerarse mejor porque mide la actividad
antioxidante de otros compuestos, así como compuestos fenólicos,lo cual no se observó con el
método TEAC.
Sobre el Por su parte, Pérez, Leighton, Aspee, Aliaga y Lissi (2000) compararon los métodos
ORAC, TEAC y TRAP en muestras de vino tinto y vino blanco y no encontró correlaciones
entre los 3 métodos.
Cao y Prior (1998) compararon ORAC, FRAP y TEAC métodos en muestras de suero
sanguíneo, encontrando una ligera correlación entre ORAC y FRAP y no encontrar
correlaciones entre ORAC y TEAC.
Señalaron que el método ORAC tenía mayor especificidad y fue capaz de responder a un
mayor número de antioxidantes compuestos que los otros dos métodos ensayados.
Ana Zulueta, Maria J. Esteve, Ana Frígola *
Área de Nutrición y Bromatología, Facultat de Farmàcia, Universitat de València, Avenida
Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, Valencia, Spain