AGRONOMA MESOAMERICANA 19(2): 267-270.

2008
ISSN: 1021-7444
1
Recibido: 20 de setiembre, 2007. Aceptado: 25 de agosto, 2008.
2
Escuela de Tecnologa de Alimentos, Centro Nacional de Ciencia y Tecnologa de Alimentos, Universidad de Costa Rica, San Jos, Costa
Rica. eric.wong@ucr.ac.cr
ROBUSTEZ DEL RECUENTO TOTAL AEROBIO AL MODIFICAR LA
ETAPA DE DILUCIONES DECIMALES
1
Eric Wong-Gonzlez
2
RESUMEN
Robustez del recuento total aerobio al modifcar la
etapa de diluciones decimales. El objetivo de esta investi-
gacin fue determinar la robustez del recuento total aerobio
al modifcar la etapa de diluciones decimales y se realiz en
el 2006 en el Laboratorio de Microbiologa de Alimentos
del Centro Nacional de Ciencia y Tecnologa de Alimentos.
Para esto se prob el efecto de matriz (vegetales, salchichn
y leche), nivel de inculo (alto:10
6
/g o 10
6
/ml o bajo:10
3
/g o
10
3
/ml) y mtodo de dilucin (dilucin 10:90 o dilucin 1:9
ml de muestra en ml de diluyente respectivamente) sobre el
recuento total aerobio de muestras inoculadas. Ninguno de
los efectos y sus interacciones fue signifcativo, evidenciando
una alta robustez del mtodo al hacer la modifcacin en las
diluciones decimales. Esto implica que se puede sustituir al
dilucin 10:90 por una de 1:9 ahorrando recursos, favorecien-
do la homogenizacin de la dilucin por ser un volumen ms
pequeo y facilitando la manipulacin y el lavado de la crista-
lera correspondiente (tubos en lugar de botellas).
Palabras claves: Validacin, modifcacin, anlisis
microbiolgico, alternativa, ahorro.
ABSTRACT
Ruggedness of aerobic plate count when modifying
the serial dilutions step. The objective of this research pro-
ject was to determine the ruggedness of aerobic plate count
when modifying the serial dilution step. Experiments were
performed in 2006 at the Food Microbiology Laboratory at
the Food Science and Technology National Center. Effects
of matrix (vegetables, Italian sausage and milk), inoculation
level (high:10
6
/g or 10
6
/ml or low:10
3
/g or 10
3
/ml) and
dilution method (10 ml:90 ml or 1 ml:9 ml sample:diluent
ratio) on the aerobic plate count of inoculated samples were
evaluated. None of the effects and their interactions were
signifcant showing high ruggedness of the method when
the serial dilution step was modifed. Dilution 10:90 can
be substituted for a 1:9 dilution. In turn less resources are
needed, homogenization is easier for a lower volume and
manipulation and washing of tubes (9 ml) more convenient
than bottles (90 ml).
Key words: Validation, modifcation, microbiological
analysis, alternative, savings.
INTRODUCCIN
La estimacin del nmero de microorganismos en
un alimento es necesaria desde muchos puntos de vista.
Por ejemplo, la carga microbiana puede indicarnos
si un producto cumple con las recomendaciones,
especifcaciones o reglamentaciones microbiolgicas
que han sido establecidas. Tambin, los recuentos
NOTA TCNICA
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pueden indicar si un alimento est deteriorado, pueden
servir para predecir la vida til y evaluar la inocuidad
de un alimento y si las condiciones en que fue
producido fueron adecuadas (Banwart 1989).
De acuerdo con Downes e Ito (2001), el recuento
total aerobio es una tcnica general ampliamente uti-
lizada para estimar el nmero de microorganismos en
muestras de alimentos. El recuento total aerobio se
utiliza como un indicador de la poblacin bacteriana
en las muestras y resulta til para evaluar su calidad.
El procedimiento general para realizar un recuento
total aerobio incluye la preparacin de la muestra,
diluciones decimales, montaje de las diluciones en pla-
cas en un medio apropiado, incubacin de las placas y
recuento (Maturin y Peeler 1998).
Las diluciones decimales se realizan para poder
tener placas en las que se puede contar fcilmente y
con precisin el nmero de colonias (Banwart 1989).
Estas diluciones consisten en colocar un volumen de
la muestra en un volumen de diluyente en una relacin
1:10, como por ejemplo 11 ml de muestra en 99 ml de
diluyente (Downes e Ito 2001) o 10 ml de muestra en
90 ml de diluyente (Maturin y Peeler 1998, Banwart
1989). Estos dos ltimos ejemplos son los volmenes
aceptados en los mtodos ofciales y son los que tradi-
cionalmente se utilizan.
En ocasiones, los laboratorios de anlisis cuentan
con limitaciones presupuestarias que los obligan a bus-
car mtodos alternativos o variaciones en los mtodos
que les permita ahorrar recursos. Considerando que
las diluciones decimales se realizan en una relacin
1:10 de acuerdo con lo expuesto anteriormente, una
nueva alternativa sera reducir las diluciones ofciales
a un volumen de 1 ml de muestra en 9 ml de diluyen-
te, cumpliendo con la proporcin. Esto implicara un
ahorro del 90% de los recursos destinados a preparar el
diluyente. Sin embargo, realizar cambios de esta na-
turaleza implica la validacin del mtodo alternativo,
especfcamente estudiar su robustez.
De acuerdo con Peters et al. (2007) y AOAC
(2002) la determinacin de la robustez de un mtodo
consiste en tomar el mtodo ofcial y someterlo a un
pequeo cambio en el procedimiento y comprobar la
infuencia que dicho cambio tiene en los resultados
obtenidos, con respecto al mtodo sin modifcaciones.
El anlisis de la robustez de un mtodo sometido a un
cambio debe considerar el efecto de matriz (aplicarse
en alimentos de diferente naturaleza), el efecto del
nivel inicial de inculo (como mnimo debe probarse
un nivel bajo y uno alto) y la realizacin de al menos
cinco repeticiones para cada combinacin de esos
efectos (AOAC 2002).
Con base en lo anterior, el objetivo de esta inves-
tigacin consisti en evaluar la robustez del recuento
total aerobio sometido a un cambio en la etapa de
diluciones decimales. El cambio consisti en realizar
las diluciones con 1 ml de muestra en 9 ml de diluyen-
te en lugar de 10 ml en 90 ml respectivamente, como
indica el mtodo ofcial. De no encontrar diferencia
entre el mtodo ofcial y el modifcado (alta robustez),
podran ahorrarse recursos importantes al determinar
el recuento total aerobio.
MATERIALES Y MTODOS
El trabajo experimental se llev a cabo en el 2006
en el Laboratorio de Microbiologa del Centro Na-
cional de Ciencia y Tecnologa de Alimentos (CITA),
localizado en la Ciudad Universitaria Rodrigo Facio
de la Universidad de Costa Rica.
Recuento total aerobio y mtodo de dilucin
Para realizar el recuento total aerobio se sigui,
como mtodo ofcial, el procedimiento descrito por
Downes e Ito (2001). Como mtodo alternativo, se
vari la etapa de diluciones decimales utilizando 1 ml
de muestra en 9 ml de diluyente, en lugar de 10 ml en
90 ml respectivamente.
Matrices alimenticias
Se trabaj con tres matrices representativas de
los siguientes grupos alimenticios: vegetales, crnicos
y lcteos. En el grupo de vegetales se trabaj con
vegetales mixtos enlatados, en el grupo de crnicos
con salchichn criollo (embutido tipo bologna) y
en el grupo de lcteos con leche pasteurizada UHT
semidescremada (2 % grasa). Estos grupos son los
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ms analizados en el laboratorio, por lo que fueron
escogidos para determinar su efecto sobre el recuento
total aerobio realizado utilizando los dos mtodos de
dilucin.
Cultivo y nivel de inculo
Se utiliz la cepa de Bacillus subtilis ATCC
31785 (Manassas, VA, USA). Esta cepa se mantuvo
en agar estndar a 37 C. A partir de cultivo slido
fresco (18 horas de incubacin) se prepar el estndar
de Mc. Farland # 0,5 con una concentracin aproxima-
da de 1 x 10
8
UFC/ml. A partir de este estndar se rea-
lizaron las diluciones necesarias para obtener el nivel
de inculo bajo (aproximadamente 10
3
/g o 10
3
/ml en
la matriz) y el nivel de inculo alto (aproximadamente
10
6
/g o 10
6
/ml en la matriz). De acuerdo con AOAC
(2002), en estudios de tcnicas de anlisis como el
recuento total, las conclusiones obtenidas para este
microorganismo, que se utiliza como un indicador,
pueden generalizarse para todas las bacterias.
Diseo experimental y anlisis estadstico
Se determin el recuento total aerobio en las tres
matrices inoculadas, para los dos niveles de inocula-
cin con base en los dos mtodos de diluciones como
nica variacin del procedimiento ofcial. Para cada
combinacin de los efectos se realizaron 10 repeti-
ciones. Se trabaj a un nivel de signifcancia del 5 %
(=0,05).
Se utiliz un diseo irrestricto al azar en un arre-
glo factorial 3 X 2 X 2, en donde el efecto matriz se
estudi en tres niveles (vegetales, salchichn y leche),
el efecto nivel de inculo en dos niveles (alto y bajo) y
el efecto mtodo de dilucin en dos niveles (dilucin
1 ml de muestra en 9 ml de diluyente y dilucin 10
ml de muestra en 90 ml de diluyente). Este diseo
fue evaluado aplicando un anlisis de covariancia
para conocer la signifcancia de los efectos simples y
sus interacciones. La interaccin triple no se analiz
por considerarse sin sentido terico. Adicionalmente,
se incluy el recuento inicial como covariable para
eliminar su efecto por ser diferente en los diversos
experimentos realizados. Se trabaj a un nivel de
signifcancia del 5 % (=0,05). Todos los anlisis se
realizaron con el paquete estadstico JMP 5.0.1.2 (Sas
Institute Inc.).
RESULTADOS Y DISCUSIN
En el Cuadro 1 se observan las probabilidades y
potencias de prueba para los efectos estudiados y sus
interacciones. En el Cuadro 2, como referencia, se
presentan los recuentos totales aerobios determinados
para la combinacin de efectos estudiados. Como
puede observarse, los efectos son independientes, y no
se afectan entre s, ya que ninguna interaccin result
signifcativa (p=1,0000).
El efecto del mtodo de dilucin, razn de ser de
esta investigacin, result no signifcativo (p=1,0000,
1-=1,0000). Esto, aunado al hecho de que ninguna
interaccin fue signifcativa, implica que el cambio
realizado en el mtodo de dilucin no afect el resul-
tado obtenido en el recuento total aerobio, en ninguno
de los dos niveles de inculo (p=1,0000, 1-=1,0000)
estudiados ni para ninguna de las matrices evaluadas
(p=1,0000, 1-=1,0000).
El efecto de matriz alimenticia no result signif-
cativo (p=1,0000, 1-=1,0000) indicando que ninguno
Cuadro 1. Probabilidad asociada y potencia de prueba para
los efectos analizados en la prueba de robustez.
Laboratorio de Microbiologa de Alimentos, Cen-
tro Nacional de Ciencias y Tecnologa de Alimen-
tos, Universidad de Costa Rica, San Jos, Costa
Rica. 2006.
Efecto analizado Probabilidad
asociada
Potencia de
prueba
1
Matriz 1,0000 1,0000
Nivel de inculo 1,0000 1,0000
Mtodo de dilucin 1,0000 1,0000
Matriz x nivel de inculo 1,0000 1,0000
Matriz x Mtodo de dilucin 1,0000 1,0000
Nivel de inculo x Mtodo de
dilucin
1,0000 1,0000
1
Nivel de signifcancia de 0,05 y diferencia mnima a detectar
de 0,1 log
10
(UFC/ml o UFC/g).
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270 WONG: ROBUSTEZ DEL RECUENTO TOTAL AEROBIO
de los grupos de alimentos analizados infuy sobre el
efecto en el cambio de mtodo de dilucin. Esto signi-
fca que no importa si el alimento es de naturaleza acuo-
sa (vegetales), grasosa (salchichn) o mixta (leche), el
mtodo de dilucin 1:9 funciona igual que el de 10:90
para predecir el recuento total aerobio. Lo mismo ocu-
rri con los niveles de inculo, pues tanto en la carga
alta como en la baja, los resultados por ambos mtodos
de dilucin resultaron iguales (p=1,0000, 1-=1,0000).
En conclusin el recuento total aerobio present
una robustez alta al modifcar la etapa de diluciones
decimales (utilizar una relacin volumen de muestra:
volumen de diluyente de 1:9 (tubos) en lugar de una re-
lacin de 10:90 (botellas). Este cambio puede aplicarse
con confanza de obtener los mismos resultados, con la
ventaja de que al utilizar tubos de 9 ml se ahorran recur-
sos, y se genera menos material para lavado tras aplicar
el mtodo. Existe una mayor facilidad de manipulacin
de la cristalera y se logra homogenizar la dilucin ms
fcilmente en comparacin con las botellas.
LITERATURA CITADA
AOAC. 2002. AOAC international methods committee
guidelines for validation of qualitative and quantitative
food microbiological offcial methods of analysis.
AOAC International, Washington DC. 25 p.
Banwart, G.J. 1989. Basic food microbiology. 2 ed. Chap-
man & Hall, New York. 773 p.
Downes, FP; Ito, K. 2001. Compendium of methods for the
microbiological examination of foods. 4 ed. APHA,
Washington DC. 676 p.
Maturin, LJ; Peeler, JT. 1998. Aerobic plate count. In:
Bacteriological analytical manual (captulo 3). 8 ed.
FDA, Maryland. sp.
Peters, FT; Drummer, OH; Musshoff, F. 2007. Validation
of new methods. Forensic Science International 165:
216-224.
Cuadro 2. Recuento total aerobio segn matriz, nivel de inculo y mtodo de dilucin utilizado. Laboratorio Laboratorio
de Microbiologa de Alimentos. Centro Nacional de Ciencias y Tecnologa de Alimentos, Univer-
sidad de Costa Rica. San Jos, Costa Rica. 2006.
Matriz Nivel de inculo
Mtodo de dilucin
(ml de muestra:ml diluyente)
Recuento total aerobio
(log
10
UFC/g o UFC/ml)
1
Vegetales
Bajo
10:90 3,25 0,06
1:9 3,19 0,06
Alto
10:90 6,56 0,05
1:9 6,57 0,03
Salchichn
Bajo
10:90 3,09 0,02
1:9 3,03 0,04
Alto
10:90 6,94 0,01
1:9 6,95 0,02
Leche
Bajo
10:90 3,03 0,06
1:9 3,00 0,04
Alto
10:90 6,49 0,03
1:9 6,58 0,05
1
UFC/g para vegetales y salchichn; UFC/ml para leche UHT.