Variabilidad en el contenido de saponina, actividad antiproliferativa del cáncer y propiedades

fisicoquímicas de la savia de agave concentrada

En los últimos años los endulzantes derivados del agave han ganado importancia y popularidad
como alternativa al azúcar refinada, debido a su origen natural y capacidad antioxidante
(Foster-Powell y otros 2002; Phillips y otros 2009; Santos-Zea y otros 2016a) ) y beneficios para
la salud como propiedades anticancerígenas y antidiabéticas (Santos-Zea y otros 2012). Entre
estos productos, hay 2 tipos a reconocer: néctares de agave (también denominados jarabes),
producidos a partir de la hidrólisis térmica o enzimática de fructanos de cabeza de agave
(Willems y Low 2012) y savia de agave concentrada (CAS), un líquido almibarado. obtenido
después de hervir la savia de agave o “aguamiel” (Gutiérrez-Uribe y Serna-Saldivar 2013). La
savia de agave contiene saponinas esteroides (Ortiz-Basurto y otros 2008; Leal-D´ıaz y otros
2015) y dichos compuestos han mostrado una fuerte actividad anticancerígena (Man y otros
2010; Santos Zea y otros 2012). Los estudios sobre diversos glucósidos de Agave utahensis
reconocieron que los cambios en los patrones de hidroxilación de la aglicona reducían la
citotoxicidad de las saponinas de espirostanol (Yokosuka y otros 2009). La cantidad de
azúcares adheridos a la sapogenina también afecta la bioactividad, como se ve en las
propiedades antifúngicas de los glucósidos de hecogenina de Agaveamericana, donde los
restos de carbohidratos de 4 o 5 azúcares tuvieron un efecto más fuerte (Jin y otros 2003). La
madurez de la planta en el momento de la recolección afecta la concentración de saponina de
la savia de agave (Leal-D´ıaz y otros 2015), por lo tanto, la concentración de saponina CAS
puede tener una variación significativa entre lotes y sitios de producción. Cabe destacar que
después de almacenar CAS durante 20 semanas, no se observó una disminución significativa
en el contenido de saponina (Santos-Zea y otros 2016a).

Durante el almacenamiento, el CAS puede sufrir cambios en sus propiedades fisicoquímicas,

destacando un pardeamiento no enzimático y un aumento en la capacidad antioxidante
(Santos-Zea y otros 2016a). Estudios similares sobre la miel y el jarabe de arce han encontrado
una relación entre el color más oscuro y una mayor capacidad antioxidante (Brudzynski y
Miotto 2011; Singh y otros 2014).

Los métodos multivariados han servido para detectar adulteración en mieles y néctares de
agave (Rios-Corripio y otros 2012, Willems y Low 2012), discriminación de jarabes de agave
entre otros edulcorantes (Mellado-Mojica y López 2015) y reconocimiento de posibles
compuestos bioactivos en extractos de miel y frijol negro (Brudzynski y Miotto 2011; Guajardo-
Flores y otros 2013).

En el caso del reconocimiento del jarabe de agave de otros endulzantes o de muestras

adulteradas, el análisis multivariado determinó que el perfil de oligosacáridos y azúcares
fueron los parámetros que permitieron discriminar las muestras según su origen (Willems y
Low 2012; Mellado-Mojica y López 2015). El análisis de la concentración de saponinas
mediante herramientas como el análisis de componentes principales permitiría distinguir un
CAS con bioactividad potencial, según su diferente perfil de saponinas, y establecer qué
compuesto o compuestos están relacionados con la bioactividad.

En consecuencia, el objetivo de este estudio fue determinar los parámetros fitoquímicos o

fisicoquímicos que generan mayor variabilidad entre dieciocho muestras de CAS producidas en
diferentes estados de México, así como una correlación entre el perfil de saponinas y la
reducción de la viabilidad de las células de cáncer de colon. Actividad de agua, pH, sólidos
solubles totales (TSS), índice de pardeamiento (BI), capacidad antioxidante,
Se determinaron el contenido de saponina y la actividad antiproliferativa y los datos se
analizaron utilizando métodos multivariados.

Materiales y métodos

Muestras biológicas

Dieciocho muestras de CAS producidas en diferentes estados de México (Figura 1) fueron

gentilmente donadas por la empresa AGMEL, Monterrey, México. Para la elaboración del CAS
se utilizaron medios artesanales como se describió anteriormente (Santos-Zea y otros 2016a).

Caracterización fisicoquímica Los parámetros fisicoquímicos seleccionados para este estudio

fueron la actividad del agua (aw), el pH, los SST y el BI, evaluados de acuerdo con los métodos
descritos anteriormente (Santos-Zea y otros 2016a). La instrumentación para la medición de la
actividad del agua fue Aqualab con sensor de punto de rocío (4TEV, Decagon Devices, Pullman,
Wash., U.S.A.), para el pH el pHmetro digital (Mettler-Toledo AG, Schwerzenbach, Suiza), y los
TSS se determinaron con manual. refractómetro en escala 58 a 90 °Brix (ATAGO, Tokio, Japón).
El BI se determinó a 490 nm (OD490) en un lector de microplacas (Synergy HT, Bio-Tek,
Winooski, Vt., U.S.A.), reportando resultados como OD490 por gramo de peso fresco CAS
(OD490/g fw).

Capacidad antioxidante Los extractos se prepararon utilizando 80/20 de acetona/agua (v/v)

según lo descrito por Santos-Zea y otros (2016a). La capacidad antioxidante (AOXC) de los
extractos se determinó de acuerdo con el ensayo de capacidad de absorción de radicales de
oxígeno hidrofílico (ORAC) como se informó anteriormente (Huang y otros 2002). La
fluorescencia se registró a λex/em = 485/530 nm en un lector de microplacas (Synergy HT, Bio-
Tek). Se usó como estándar ácido (±)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico
(Trolox) adquirido de Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., EE. UU. (25 a 100 μM), y los resultados se
expresaron como equivalentes Trolox μmol por gramo de peso fresco de CAS (TE μmol/g fw).

Identificación y cuantificación de saponinas La extracción, identificación y cuantificación de

saponinas se llevaron a cabo como se informó anteriormente (Santos-Zea y otros 2016a). Se
realizó una extracción utilizando 2.5 g de CAS y 50 mL de n-butanol acuoso al 50% (Desarrollo
de Especialidades Químicas, Monterrey, México) a 250 rpm durante 60 min en una incubadora
con agitación.

El extracto se centrifugó (SL16R Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Mass., U.S.A.) a 3000
rpm y 4 °C durante 5 min, la fase superior se recolectó y se concentró al vacío a 40 °C (Rocket
Evaporator, Genevac Ltd, Ipswich , Inglaterra). El extracto seco se resuspendió en 5 ml de
metanol en agua HPLC al 50 % (v/v) (BDH, Poole, Reino Unido) antes de someterlo a extracción
en fase sólida (SPE) utilizando cartuchos Strata C18-E, 55 μm, 70 A (Phe nomenex, Torrance,
California, EE. UU.). Después de la carga, el cartucho se lavó con 12 mL de agua, luego se
usaron 12 mL de metanol/agua 60/40 para obtener una fracción enriquecida en glucósidos de
kamogenina (F1) y las saponinas restantes se eluyeron con 12 mL de metanol al 100% (F2).
Todas las fracciones se concentraron al vacío hasta sequedad, F1 y F2 se resuspendieron en 1
ml de una solución de agua/metanol al 50 % (v/v), se filtraron a través de econofiltros de PTFE
de 0,45 μm (Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE. UU.) y se almacenaron a – 20 °C
antes del análisis.

La identificación de saponina se llevó a cabo mediante HPLC acoplada a un detector de tiempo

de vuelo de espectroscopia de masas (HPLC-MS-TOF) (serie 1100, Agilent Technologies). Para
la cuantificación, se utilizó un HPLC acoplado a un detector de dispersión de luz evaporativa
(HPLC-ELSD (serie 1200, Agilent Technologies). La cromatografía y las condiciones del detector
para ambos métodos se ejecutaron como se informó anteriormente (Leal-D´ıaz y otros 2015).
Los resultados para cada compuesto en F1 y F2 se informaron como microgramos equivalentes
de protodioscina (PE) por gramo CAS fw (PE/g fw).

Actividad antiproliferativa

La actividad antiproliferativa en células cancerosas se evaluó en la línea celular de cáncer de

colon Caco-2 (HTB-37, ATCC, Manassas, Virginia, EE. UU.) como se informó anteriormente
(Antunes-Ricardo y otros 2014). Para centrarse en el efecto del perfil de saponina sobre la
bioactividad, las fracciones F1 y F2 de muestras CAS se ajustaron a una concentración total de
saponina de 25 PE μg/mL en medios de cultivo. La viabilidad celular se determinó usando el
ensayo de proliferación celular Cell Titer 96 R AQueousOne Solution Cell (Promega, Madsion,
Wis., EE. UU.) y registrando la absorbancia en un lector de microplacas (Epoch, Biotek,
Winooski, Vt., EE. UU.) a 490 nm.

análisis estadístico

Las mediciones informadas como media con la desviación estándar correspondiente se

realizaron al menos por duplicado. Los análisis estadísticos se realizaron con el software JMP
8.0 (SAS Institute Inc. Cary, N.C., EE. UU.). Los datos se analizaron mediante la metodología
ANOVA seguida de las pruebas HSD de Tukey con un nivel de significancia de P < 0,05. Se
realizó un análisis de componentes principales sobre la covarianza para determinar los factores
que afectaron principalmente las diferencias entre CAS y establecer relaciones entre las
saponinas y el efecto sobre la viabilidad celular.

Resultados y discusión

Parámetros fisicoquímicos

Los datos obtenidos experimentalmente de las dieciocho muestras CAS indicaron que la
actividad del agua (Cuadro 1) presentó una media de 0,73 ± 0,05 dentro de un intervalo de
confianza del 95% de 0,71 a 0,75. Hubo un outlier en los valores inferiores (0.61 ± 0.01),
correspondiente a una muestra de Jalisco (JL2). TSS siguió un patrón similar (Tabla 1) con un
valor medio de 74,6 ± 4,4 °Brix, dentro de un intervalo de confianza del 95% de 73,1 a 76,1
°Brix. Solo la muestra de Durango (DGO) contenía SST muy bajos (59.5 ± 0.5 °Brix).

Estos resultados estuvieron de acuerdo con la información publicada para 3 lotes de CAS
(Santos-Zea y otros 2016a), excepto los puntos fuera del intervalo de confianza para TSS y aw.
Con respecto a los jarabes de agave de Agave salmiana hidrolizado, los SST fueron similares a
los datos obtenidos en este estudio (Willems y Low 2012; Mellado-Mojica y López 2015). La
variación en el pH ocurrió dentro de un intervalo de confianza del 95% de 4,69 y 5,02 (Tabla 1),
con un valor medio de 4,85 ± 0,48. Naturalmente, la savia fresca de agave se recolecta a un pH
cercano a la neutralidad (6.5 ± 0.5), y durante la fermentación por la microbiota endofítica
disminuye a 4.3 (Escalante y otros 2008). Estos resultados indican que los lotes de CAS
analizados en este estudio probablemente experimentaron una fermentación espontánea
antes de ser concentrados.

La capacidad antioxidante (AOXC), con valores de 5 a 29 μmol TE/g fw, se correlacionó

directamente con el BI, con valores que van de 25 a 125 OD490/g fw (Figura 2). Esta
correlación también se observó en el jarabe de arce, donde la AOXC medida como ORAC se
relacionó con la absorbancia medida a 420 nm, posiblemente correspondiente a las
melanoidinas (Unno 2015). Es importante señalar que se requiere más experimentación para
validar la actividad antioxidante de CAS y, en particular, para señalar si los compuestos
responsables del pardeamiento de CAS podrían prevenir la oxidación en las células. Dado que
no existe una extrapolación directa entre los ensayos químicos y los ensayos in vitro e in vivo,
una validación a través del bioensayo de actividad antioxidante celular podría ser útil para
estudios futuros (Wolfe y Liu 2007).

Contenido de saponina

Se detectaron once glucósidos de saponina diferentes (Figura 3A y B) entre las 18 muestras,

junto con trazas de sus correspondientes sapogeninas (Figura 3A, compuestos 12 a 15). Los
compuestos 2, 3, 4, 5, 6 y 10 se identificaron previamente en CAS (Santos-Zea y otros 2016,
2016b). El compuesto 1 (Figura 3B) se identificó como un pentaglucósido de kammogenina con
una cadena de azúcar de 4 unidades de hexosa y 1 pentosa en solo 8 de las muestras
analizadas. Este compuesto no había sido reportado previamente en CAS, pero estaba
abundantemente presente en la savia fresca de A. salmiana (Leal-D´ıaz y otros 2015). El
compuesto 2 era un tetraglucósido de kammogenina con 3 unidades de hexosa y 1 pentosa
conocido como magueyosido B (Figura 3B). Se encontró en todas las muestras CAS en un rango
de 7.4 a 134 PE μg/mL, donde los valores por debajo de 10 PE μg/mL para este compuesto
fueron atípicamente bajos y correspondieron a muestras de Jalisco, Michoacán, Aguascalientes
y MX3 de México. Estado. El magueyosido B se detectó por primera vez en flores de A.
offoynana (Perez y otros 2013) y también se informó en savia fresca de A. salmiana (Leal-D´ıaz
y otros 2015) y extracto de acetona CAS (Santos-Zea y otros 2016b). El compuesto 3, un
tetraglucósido de kammogenina, se encontró en 17 de las muestras de este estudio, excepto
en MCH producido en la lata de Michoa. Las cantidades más altas (>30 PE μg/g pf) se
encontraron en muestras de Puebla e Hidalgo, excepto HG7, que contenía 8.3 PE μg/g pf. El
compuesto 3 solo se ha informado en CAS (Santos-Zea y otros 2016a, 2016b). El compuesto 4
(Figura 3B) se identificó como magueyoside C, un tetraglucósido de manogenina con 3
unidades de hexosa y 1 pentosa que se reportó previamente en savia fresca de A. salmiana
(Leal-D´ıaz y otros 2015) y CAS de Hidalgo (Santos -Zea y otros 2016a, Figura 4: representación
gráfica del análisis de componentes principales para parámetros fisicoquímicos y fitoquímicos
de savia de agave concentrada entre 18 muestras CAS, 2016b).

El compuesto 5 fue reconocido como una manogenina diferente

tetraglucósido, con 2 unidades de hexosa y 2 de pentosa. Se encontraba en bajas

concentraciones, de 2,7 a 11 PE μg/g pf en 10 de las muestras. El compuesto 6 correspondía a
un triglicósido de manogenina con 2 hexosas y 1 pentosa. Se detectó en todas las muestras a
bajas concentraciones (1,2 a 18 PE μg/g fw), excepto DGO y MX3. El compuesto 7 se identificó
como un pentaglucósido de gentrogenina con 3 unidades de hexosa y 2 pentosas, conocido
como magueyosido H, informado por primera vez en flores de A. offoyana (Perez y otros
2013). Se encontró en cantidades muy bajas (2.7 a 9 PE μg/g pf) solo en las muestras HG1 de
Hidalgo, MX2 del Estado de México y CAS de Puebla y Veracruz. Magueyoside H también
estuvo presente en baja abundancia en savia fresca de agave (Leal-Dıaz y otros 2015) y CAS del
estado de Hidalgo (Santos-Zea y otros 2016a, 2016b). Por otro lado, el compuesto 8 estuvo
presente en 14 de las 18 muestras, también en cantidades bajas (4.5 a 17 PE μg/g pf) y
correspondió a un tetraglucósido de gentrogenina con 3 hexosas y 1 pentosa, encontrado
previamente en “aguamiel” (Leal-Dıaz y otros 2015). El contenido de tetraglucósido de
gentrogenina fue mayor en las muestras de Coahuila y algunas de Hidalgo (HG1, HG2 y HG4).
Los compuestos 9, 10 y 11 se clasificaron como glucósidos de hecogenina (Figura 3B). El
compuesto 9 correspondía a la hecogenina pentaglucósido cantalasaponina 4, con 3 unidades
de hexosas y 2 pentosas. Las concentraciones fueron inferiores a 20 PE μg/g pf, excepto el CO1
y CO2, producido en Coahuila (Figura 3C). El compuesto 10 se reconoció como agavoside C', un
tetraglucósido de hecogenina con 3 hexosas y 1 pentosa en su cadena de azúcar (Figura 3B).
Fue el derivado de hecogenina más abundante reportado en las 18 muestras en
concentraciones entre 2.7 y 45 PE μg/g fw, y estuvo ausente solo en la muestra HG6 de
Hidalgo. La concentración más alta reportada fue en las dos muestras de Coahuila, de 2.5 a 16
veces más agavoside C’ con respecto a muestras de otras regiones. El compuesto 11
correspondió a un triglicósido de hecogenina con 3 hexosas denominado agavasaponina C. Se
encontró en niveles inferiores a 10 PE μg/g fw, solo en muestras de Hidalgo (excepto HG6),
MX2 del Estado de México, Puebla y Veracruz. Se han reportado cantalasaponina 4 y agavoside
C' en savia fresca de A. salmiana, otras muestras CAS, flores de A. offoyana y A. cantala (Pant y
otros 1986; Pérez y otros 2013; Leal-Dıaz y otros 2015; Santos-Zea y otros 2016a, 2016b), y
recientemente se detectó agavasaponina C en jugo de hojas de Agave atrovirens (Olvera-Garc
´ıa y otros 2015).

El contenido total de saponina varió significativamente (P < 0.0001) entre muestras, pasando
de 20 a 390 PE μg/g fw (Figura 3C). Las muestras producidas en Coahuila (Figura 3C) tuvieron
mayor contenido de saponina (P < 0.001), con más de 350 PE μg/g pf. En el caso de los CAS de
los estados de Hidalgo, México, Durango y Puebla, la concentración de saponina se consideró
intermedia, de 100 a 270 PE μg/g pf, excepto MX4, con solo 37 PE μg/g pf. Las muestras con las
cantidades más bajas de saponinas provinieron de los estados de Jalisco, Aguascalientes y
Michoacán, con menos de 50 PE ´ μg/g pf. Para la mayoría de las muestras, la concentración de
saponina total estuvo dentro del rango reportado para “aguamiel” recolectado en Coahuila
(Leal D´ıaz y otros 2015) y CAS producido en Hidalgo (Santos-Zea y otros 2016a). Los glucósidos
de kammogenina (compuestos 1 a 3) fueron los compuestos más abundantes en la mayoría de
las muestras analizadas, representando más del 50% del total de saponinas; mientras que los
glucósidos de manogenina (compuestos 4 a 6) representaron del 15% al 30% (Figura 3C). En
términos generales, los glucósidos de gentrogenina (compuestos 7 y 8) fueron las saponinas
menos abundantes (5% a 20%) en todas las muestras analizadas en este estudio (Figura 3C) y
estuvieron ausentes en HG5 y HG6 de Hidalgo, MX3 del Estado de México y MCH de
Michoacán. El análisis de componentes principales de los parámetros fisicoquímicos (Figura 4)
mostró que la concentración de saponina explicaba la mayor parte de la variación entre las
muestras; aunque no hubo correlación significativa entre la concentración de saponina y el
resto de parámetros. Como era de esperar, hubo una correlación positiva entre la capacidad
antioxidante y el BI (Brudzynski y Miotto 2011; Singh y otros 2014; Santos-Zea y otros 2016a).
También hubo una correlación negativa entre AOXC y BI con el pH.

Efecto antiproliferativo de extractos ricos en saponinas

Las células de cáncer de colon (Caco-2) tratadas con F1 tenían una viabilidad media del 66,7 ±
20,9%, pero no se observaron diferencias significativas entre las muestras CAS (datos no
mostrados). F1 contenía principalmente glucósidos de kam mogenina (compuestos 1 a 3). El
resto de los glucósidos, junto con una cantidad relativa baja de kammogenina saponinas, se
encontraron en F2. En el caso de F2, existe una diferencia significativa en su efecto
antiproliferativo sobre las células Caco-2. Se observó que el triglicósido de manogenina
(compuesto 6) se correlacionó estrecha y positivamente con la viabilidad (Figura 5A) y, por lo
tanto, no tuvo en cuenta la bioactividad. Los compuestos 1, 3, 5, 7, 9, 10 y 11 no estaban
relacionados con la viabilidad ni positiva ni negativamente (Figura 5A). Las fracciones F2 de
HG1, HG2, HG3, HG4, MX1, MX3 y CO2 redujeron la viabilidad al 50 % o menos y, en
consecuencia, se encontraron en el lado izquierdo de la representación gráfica de PCA donde
el efecto sobre la viabilidad celular estaba relacionado con el componente 1 , que representa
el 58% de la covarianza (Figura 5B).

Hubo un efecto importante de la proporción tetraglucósido de kamogenina (compuesto 3),

sobre el componente 2, que representó el 16% de la covarianza (Figura 5A). Curiosamente, la
cantidad de este compuesto contrastó entre los sitios de producción, como se observa en la
representación gráfica de PCA, donde las muestras de Hidalgo, Puebla y Veracruz tenían un
mayor porcentaje de glucósido de kammogenina en F2 (Figura 5B).

En las muestras de México, Coahuila, Jalisco, Aguascalientes, Michoacán y Durango, la

reducción de la viabilidad de las células Caco-2 estuvo relacionada con el porcentaje de
magueyoside B (compuesto 2) en F2 (Figura 6A). Con respecto a las muestras encontradas en
el cuadrante inferior izquierdo, el tetraglucósido de gentrogenina (compuesto 8) contribuyó a
la reducción de la viabilidad celular (Figura 6B). Trabajos previos con fracciones ricas en
saponina obtenidas mediante cromatografía de partición centrífuga rápida indicaron que los
magueyosidos B y C inducían la apoptosis en la línea celular de cáncer de colon HT-29,
mientras que las muestras que contenían glucósidos de gentrogenina y hecogenina
provocaban la muerte por necrosis (Santos-Zea y otros 2016b). Los resultados obtenidos de
este trabajo validan aún más el potencial citotóxico de las saponinas CAS.

Conclusiones

El contenido de saponina fue el parámetro que explicó la mayor parte de la variabilidad

observada entre los 18 CAS analizados en este estudio. El BI y la capacidad antioxidante
estuvieron directamente relacionados y variaron entre las muestras. El seguimiento con un
ensayo de antioxidantes celulares sería útil para validar esta bioactividad, particularmente para
los compuestos responsables del pardeamiento CAS. El rango de concentración de saponina
total fue desde menos de 50 hasta 450 PE μg/g pf. Entre las 11 saponinas detectadas, el
magueyosido B estuvo presente en todas las muestras y junto con la concentración del
compuesto 3, un tetraglucósido de kammogenina, fueron importantes para diferenciar las
muestras CAS de Hidalgo y Puebla de las de otros estados mexicanos. En este estudio, había al
menos 2 compuestos que parecían ser responsables de la disminución de la viabilidad de la
línea celular cancerosa Caco-2: el magueyosido B y un tetraglicósido de gentrogenina. Una vez
que hayamos reconocido dos objetivos moleculares potenciales en CAS, se requiere más
investigación para abordar su biodisponibilidad y efectos toxicológicos. Los estudios que
utilizan modelos in vivo ayudarían a determinar cómo se absorben, metabolizan y distribuyen
estas saponinas entre los tejidos diana y a encontrar dosis clínicamente significativas.