HPLC

C R O M ATO G R A F Í A L Í Q U I D A D E A LTA R E S O L U C I Ó N
Qué es HPLC y para que se utiliza
HPLC

Originalmente son siglas derivadas de las palabras en inglés high pressure liquide chromatography, y
seguidamente High Performance Liquid Chromatography.

Al igual que la GC es una técnica cromatográfica utilizada para separar los componentes de una muestra
Que ventajas hay al utilizar la técnica HPLC, sobre una cromatografía de líquidos
convencional

Mejor resolución

Disminución de los tiempos de corrida

También tienen ventajas sobre la GC: 85% de los compuestos conocidos no son lo
suficientemente volátiles o estables como para ser separados por GC
Cuáles son los componentes básicos del HPLC
En HPLC la fase móvil es un líquido o una mezcla de
líquidos que pueden utilizase de forma isocrática o por
gradiente.

Los principales componentes del HPLC son:

◦ Reservorio de eluyentes
◦ Válvula de varias vías y volumen amortiguador
◦ Bomba para la fase móvil
◦ Guarda de columna y Columna con fase estacionaria
◦ Inyector
◦ Detector
◦ Integrador o PC
Columnas
Suelen tener una fase estacionaria sólida, como
sílice de alta pureza con diámetro típico de 5 a
10m, Estas partículas pueden interactuar por
adsorción o tener otro líquido unido en su
superficie con la que se hace la distribución en la
fase estacionaria con la fase móvil
Inyectores
Se utilizan para introducir la muestra en la columna
¿Cuáles son los cuidados que deben tenerse para la operación de HPLC para no
dañar la columna?

Verificación de la pureza de la fase móvil (puede ser grado HPLC o filtrarse previo a utilizarse
con un filtro que pueda retener partículas muy pequeñas

El uso de guarda columna retiene basura como fragmentos de sellos de bomba y materia sólida
proveniente de la muestra que de otro modo llegaría a la columna
HPLC
Fase normal: Fase estacionaria polar (como la silica) y fase móvil no polar

Ej: silica- hexano

Fase reversa: Fase estacionaria no polar y fase móvil polar

Ej: C18: acetonitrilo ó C18- metanol

Orden de elución de los componentes en fase
normal y fase reversa
 Metformine hydrochloride, magnesium
stearate

Solubility In water,
1.06X10+6 mg/L
(miscible) at 25 °C (est)
Fuerzas de dispersión de London
Resultados
Debe obtener un print screen de los siguientes cromatogramas

Curva de calibración

Cromatograma de muestra con C-18 –acetonitrilo

Cromaograma de muestra con silica-hexano

Cromatograma de muestra con C-18 hexano

Cromatograma de muestra con silica-acetonitrilo

CROMATOGRAMA C-18-METANOL
Simulador Labster
Escuche el contexto por el cual se realizará el análisis
Objetivo de la práctica
Ingrese al laboratorio
Explore los componentes del HPLC
En su reporte conteste las preguntas que
aparecen en la tablet
Preparación de la muestra
Construya una curva de calibración usando concentración en
las ordenadas y el área bajo la curva en las abscisas
Puede usar estos datos para la línea de
regresión
Construya una línea de regresión en Excel
Responda las preguntas de la Tablet en su
informe
Inyecte la muestra en el HPLC
Paso de la muestra por la columna
Cromatograma
Segundo objetivo
Relación entre las condiciones de
almacenamiento y los cromatogramas
En base a su regresión
lineal, estime la
concentración de
metformina en las
muestras
Discusión
Discuta acerca del principio de la ténica de HPLC

Compare la metodología en fase normal versus la fase reversa

Compare los cromatogramas usando C-18 acetonitrilo versus silica-hexano

Compare los cromatogramas usando C-18 hexano versus siica-acetonitrilo

Discuta acerca de la aplicación de esta técnica en el control de calidad de diversas industrias