Trabajo de disertación

laboratorio de baogía

Tema: Agar Mueller Hinton

Nombre y apellido: Fabiana Heidi Mollo Vidaurre.

Docente: Aracely balanza Orozco.
Materia: Laboratorio de bacteriología.
Tema: Método de agar mueller hinton
Fecha: 21/07/20.

Tarija - Cercado
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Método de Agar Mueller Hinton

Definición. –
El agar Müeller Hinton es un medio nutritivo sólido, no selectivo, que está compuesto
por infusión de carne, peptona ácida de caseína, almidón, agar y agua destilada. Este
medio permite un excelente desarrollo microbiano de la mayoría de las bacterias de
crecimiento rápido.

Fundamento. –

Por ser un medio nutritivo no selectivo es excelente para el crecimiento de la

mayoría de las bacterias patógenas.

Por otra parte, su composición simple hace que las sustancias difundan fácilmente
sobre él, siendo una característica esencial para la prueba de susceptibilidad por el
método de difusión en disco.

Otra de sus características es que contiene baja cantidad de inhibidores, lo que

permite que puedan evaluarse de manera efectiva las sulfonamidas, el trimetoprim y
las tetraciclinas.
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Sin embargo, se debe tener presente que el medio debe cumplir ciertas condiciones
para garantizar su buen funcionamiento, entre ellas:

El ajuste del pH, la profundidad del agar y la concentración adecuada de timina,

timidina, Ca++, Mg++ y Zn++.

También hay que saber que la metodología está estandarizada y por tanto deben
cumplirse todos los parámetros, tales como:

La concentración del inóculo, la concentración y conservación de los discos de

antibióticos, la colocación del número adecuado de discos sobre el agar, la distancia
entre un disco y otro, la colocación estratégica de ciertos antibióticos, la atmósfera, la
temperatura y el tiempo de incubación.

Objetivo. –

El objetivo es comprobar y saber la susceptibilidad a antibióticos y También para

aislar y mantener especies de Neisseria y Moraxella.

Método. –

Suspender 38 g del medio de en un litro de agua purificada. Calentar con agitación

suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en
autoclave ah 121 C 15 libras de presión durante 15 minutos. Dejar enfriar a una
temperatura entre 45-50 C y vaciar en placas de Petri estériles para obtener desarrollo
de neisseria enfriar el medio a 45-50 C y agregar sangre de borrego desfribrinada
estéril al 5 porciento calentada a 80 C. para realizar pruebas de oxacilina y meticilina
con estafilococcos, el medio deberá ser suplementado con 2 porciento de cloruro de
sodio El color del medio preparado es beige claro.

Usos. –

Se utiliza para realizar el antibiograma o la prueba de susceptibilidad a los

antibióticos a la mayoría de los patógenos no exigentes de crecimiento rápido.

Si el agar es suplementado con sangre sirve para realizar el antibiograma de

microorganismos exigentes como: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp,
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Neisseria meningitidis, entre otros. También ha sido utilizado para aislar Legionella

pneumophila.

Técnica del antibiograma. -

Antes de realizar el antibiograma se debe preparar una solución bacteriana

equivalente a 1,5 x 108 células.

Para ello, se toman 3 a 4 colonias del cultivo puro y se suspenden en un caldo soya
tripticasa o en caldo Müeller Hinton, se incuba por 2 a 6 horas y se ajusta la
concentración con solución salina estéril, comparándolo con un patrón Mac Farland
de 0,5%.

Si se tratan de microorganismos exigentes se pueden suspender colonias de forma

directa hasta llegar a la concentración 0,5% de Mac Farland. Posteriormente, se
siembra la placa de Müeller Hinton con un hisopo impregnado con la solución
bacteriana preparada.

Para ello, se sumerge el hisopo en la solución y luego se quita el exceso de líquido

haciendo presión contra las paredes del tubo. Inmediatamente después se pasa el
hisopo por toda la superficie, sin dejar sitios sin tocar, luego se gira levemente la
placa y se vuelve a sembrar. La operación se repite 2 veces más.
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Deje reposar por 10 minutos y luego coloque los discos de antibióticos con una pinza
estéril, dejando un espacio de 24 mm entre uno y otro. Después de colocar cada disco
sobre el agar presione levemente a cada uno con la pinza para asegurar que queden
bien adheridos.

Finalizado el proceso, se invierte la placa y se incuba a 35-37°C en aerobiosis por 16

a 18 horas. Si se trata de un microorganismo exigente puede ameritar microaerofilia y
si el antibiograma contiene discos de oxacilina se debe leer a las 24 horas.

Para medir el diámetro de cada halo se utiliza una regla. Los resultados se deben
anotar en mm. Posteriormente se correlacionan los valores obtenidos con las tablas de
puntos de cortes publicadas por el manual de la CLSI vigente.
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Medición
del halo de inhibición. Fuente: USCDCP, Pixnio.com

Reportar como sensible (S), intermedio (I), o resistente (R), según sea el caso.

Los antibióticos se seleccionan de acuerdo al microorganismo aislado y al tipo de

infección que está produciendo.

En ocasiones se debe tener presente la colocación estratégica de antibióticos para

evidenciar patrones fenotípicos de resistencia.

Colocación estratégica de discos sobre el agar Müeller Hinton

Para enterobacterias se debe colocar el disco de ácido clavulánico frente a

cefalosporinas de 3er y 4ta generación. Un ensanchamiento en forma de huevo indica
que la cepa es productora de betalactamasas de espectro extendido (BLEE). Esto
significa que el paciente no debe ser tratado con ninguna cefalosporina.
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Expresión fenotípica de producción de betalactamasas de espectro extendido (BLEE)

en una cepa de Escherichia coli. Fuente: Foto tomada por la autora MSc. Marielsa Gil

En Staphylococcus es importante colocar el disco de eritromicina o azitromicina

frente al disco de clindamicina (prueba D-test).

Un halo resistente en eritromicina y un achatamiento en el halo de clindamicina

indica que la cepa posee una resistencia inducible a clindamicina, cepa (RIC). Esto
quiere decir que un tratamiento con clindamicina no será efectivo.

Para la búsqueda de cepas AMP C inducibles en enterobacterias y algunos bacilos

Gram negativos no fermentadores, se enfrentan los discos de ceftazidime, cefoxitin o
piperacilina tazobactan frente a un disco de imipenem, a una distancia de 27 mm.

Un halo achatado en alguno de los discos enfrentados a imipenem indica presencia de

AMP C inducible.

Para la búsqueda de AMP C constitutiva se enfrenta un disco de cloxacilina 500 µg

con ceftazidime (30 µg) y con cefotaxime (30 µg), a una distancia de 25 mm. Un halo
ensanchado en alguna de las cefalosporinas indica positividad.

También se puede sustituir el disco de cloxacilina por un disco de 9 mm de papel de

filtro Whatman N°6 impregnado con ácido fenil bórico (400 µg) con una distancia de
18 mm. Se interpreta igual al anterior.

Finalmente, para investigar la producción de metalobetalactamasas especialmente en

Pseudomonas aeruginosa, se utiliza un disco impregnado con 10 µl de ácido
etilendiamintetraacético (EDTA 750 µg) y ácido tioglicólico (SMA 300 µg), el cual
se enfrenta con los discos de imipenem y meropenem, a una distancia de 15 mm.

La prueba es positiva si hay ensanchamiento de los halos de imipenem o meropenem

hacia el disco de EDTA/SMA. Este resultado debe confirmarse por el test de Hodge
modificado.
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Este método consiste en inocular una cepa de Escherichia coli ATCC 25922 sobre la
placa Müeller Hinton. Se coloca un disco de imipenem en el centro de la placa y
luego se hace una estría desde el disco hacia la periferia con la cepa de P. aeruginosa
sospechosa. Se pueden probar hasta 4 cepas por placa.

La prueba será positiva si hay una zona de distorsión del halo de imipenem alrededor
de la estría.

Causas de resultados erróneos. -

 Discos de antibióticos mal conservados puede producir falsas resistencias. Por

ejemplo, el disco de oxacilina es muy vulnerable a los cambios de
temperatura.
 Un pH del medio por debajo al indicado (ácido) produce halos más pequeños
en los aminoglucósidos y macrólidos (riesgo de falsa resistencia), y halos más
grandes en la penicilina, tetraciclina y novobiocina (riesgo de falsa
sensibilidad).
 Si el pH se encuentra por encima del indicado (alcalino) se invierten los
efectos descritos anteriormente.
 Los medios con concentraciones de timina y timidina elevadas influyen
reduciendo significativamente los halos de inhibición de las sulfonamidas y el
trimetoprim.
 Altas concentraciones de calcio y magnesio producen falsas resistencia de los
aminoglucósidos, polimixina B y tetraciclinas frente a cepas de Pseudomonas
aeruginosa.
 Bajas concentraciones de calcio y magnesio producen falsas sensibilidades de
los aminoglucósidos, polimixina B y tetraciclinas frente a cepas de
Pseudomonas aeruginosa.
 La presencia de zinc afecta los resultados de los discos de carbapenems
(imipenem, meropenem y ertapenem).
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 El grosor del medio por debajo de 3 mm produce resultados de falsa

sensibilidad, mientras que un grosor por encima de 5 producirá falsa
resistencia.
 La movilización de discos en el antibiograma dará halos deformes, ya que la
descarga de antibióticos es inmediata.
 Inóculos muy débiles afectan los resultados, pues no habrá un crecimiento
uniforme o confluido en el agar, condición necesaria para poder medir los
halos de inhibición, además de que los halos pueden dar más grande de lo
normal.
 Inóculos demasiado cargados pueden dar halos más pequeños de lo normal.
 No respetar la distancia entre discos hace que se superponga un halo con otro
y no se puedan leer correctamente.
 Incubar con CO2 aumenta el tamaño de los halos de los discos de tetraciclina y
meticilina.
 Incubar a temperaturas por debajo de 35°C produce halos más grandes.
 El agregado de sangre disminuye el tamaño del halo de las sulfamidas.

Limitación. -

La sensibilidad de un antibiótico demostrada en el antibiograma frente a un

microorganismo (in vitro) no es garantía de que funcionará in vivo.

Control de calidad. -

Para saber si el medio contiene la cantidad adecuada de timina, se debe sembrar una
cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212 y probar la susceptibilidad a trimetoprim
sulfametoxazol (SXT), el mismo debe dar un halo igual o > a 20 mm para que sea
satisfactorio.