Mg. T.M. Robert Caballero B.

Docente

DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO:
COLORACIONES
 FINALIDAD

• Proporcionar resultados preliminares con

objetivo clínico

• Medida de control de calidad

• Diagnóstico (Ziehl Neelsen)

 MUESTRA

• Muestra representativa

• Evitar la contaminación con la microflora propia

de la piel y membranas mucosas

• Transporte inmediato al Laboratorio para su

proceso

• Medios de transporte adecuados

• Importante para la efectividad del Laboratorio

 FROTIS

• Preparar evitando deformaciones de los

microorganismos

• Frotis en lámina limpia (nueva)

• Frotis delgado

• Tiempo de secado adecuado

• Fijarse a calor suave

 GENERALIDADES

• Se necesita 105 microorganismos/ml para encontrar

1/C con microscopio de inmersión

• La concentración de microorganismos pueden

incrementar 10 a 100 veces

• Muestras mucoides, pueden requerir digestión por

un agente mucolítico

• Cantidad relativa de leucocitos y células de

descamación confirman la calidad del especimen
 COLORACION GRAM

• Diseñado por el microbiólogo Danés Hans

Christian Gram en 1884.

• Procedimiento más usado en

microbiología

• Técnica basada en las propiedades

fisiológicas de la pared celular
 Diferencia entre
Gram + y gram-

BACTERIAS GRAM BACTERIAS GRAM

POSITIVAS NEGATIVAS

• Pared celular delgada:

• La pared celular gruesa:
peptidoglicano, ac. peptidoglicano
Teicoico • P.C. no esta en contacto
• P.C. en contacto directo directo con la membrana
con la membrana celular
citoplasmatica • La membrana externa
• No posee membrana compuesta de una capa
externa. doble de fosfolipidos (LPS).
ESTRUCTURA DE LAS
BACTERIAS
 REACTIVOS

• CRISTAL VIOLETA
– 2 gr de violeta de metilo +100 ml de alcohol etílico + 100 ml
alcohol metílico
– 4 gr de oxalato de amonio +200 ml de agua destilada
– Se juntan las dos soluciones + 200 ml de agua destilada
– Reposar 24 hs, luego se filtra y se guarda en frasco oscuro

• LUGOL
– 4.5 gr de iodato de potasio + 450 ml de agua destilada
– 3gr de yodo metálico
– Para uso: 2ml de lugol + 38 ml de agua destilada
 REACTIVOS

• ALCOHOL ABSOLUTO 95%

• SAFRANINA
– 2.5 GR DE SAFRANINA + 500 ML DE AGUA DESTILADA
– Guardar en frasco oscuro
 TECNICA

• Paso I: Preparar el FROTIS, dejar secar

• Paso II: Aplicar coloración primaria (cristal violeta) por 1min, luego lavar para
eliminar el exceso de colorante

• Paso III: Aplicar el agente fijante (solución yodada) por un minuto

• Paso IV: Lavado

• Paso V: Decoloración con alcohol acetona durante 10 segundos, repetir

procedimiento si fuera necesario

• Paso VI: Lavar con agua para remover el exceso de alcohol

• Paso VII: Cubrir el portaobjeto con la sustancia de contraste (safranina) por 30 seg.

• Paso VIII: Lavar, secar y observar.

 FUNDAMENTO

Colorante primario + fijador = complejo violeta-yodo insoluble en el citoplasma

de las bacterias
GRAM POSITIVOS:
Solvente produce contracción
de los poros del
peptidoglicano, impermeable
al complejo.
GRAM NEGATIVOS:
El solvente disuelve la porción
lipídica y el complejo cristal
violeta-yodo es removido,
decolorando las células.
RESULTADOS
 RESULTADOS

• “Gram-negativos falsos”: si la bacteria

gram-positiva es vieja, dañada o si la
pared celular no esta intacta,
decoloración prolongada
• “Gram-positivo falso”: no existe, pero
puede ocurrir si el paso de decoloración
es omitido accidentalmente.
• Uso de colorantes con precipitados que
pueden dar falsos positivos
 SENSIBILIDAD

La sensibilidad de la coloración GRAM varía con el tipo de

muestra:

• LCR: 60 – 90% de sensibilidad

• En Líquido pleural y pericardico de 50 a 70%

• Líquido peritoneal: 25 – 50 % ( peritonitis expontanea)

• Líquido sinovial: La sensibilidad varía según la etiología

• 75% para stafilococo
• <25% gonococo
• 50% para los gram negativos
 COLORACION
ZIEHL NEELSEN
• Se emplea para detectar la presencia de
BAAR (Bacilos Acido-Alcohol Resistentes)

• La pared celular de los BAAR:

- Su estructura básica es característica de
las
bacterias gram positivas
- Compleja y rica en lípidos
 MICOBACTERIUM

Los BAAR poseen una pared celular rica en lípidos y

ácidos carboxílicos (ácido micólico)
 RECOMENDACIONES EN EL
MANEJO DE MUESTRAS

• ESPUTO:
– La calidad de muestra es determinada por el número de células
epiteliales y el número de leucocitos
– Se necesita 10 BAAR/ml de esputo para poder observar al
microscopio
– Es necesario 3 muestras de 5-10 ml
– Esputos hemoptoicos interfieren el diagnóstico
• ASPIRADOS BRONQUIALES:
– Procesar inmediatamente
• ORINA:
Primera de la mañana en tres días sucesivos por la
discontinuidad en la eliminación del BARR. No
recomendable el sondaje, ni la orina obtenida durante 24
horas.
 RECOMENDACIONES EN EL
MANEJO DE LAS MUESTRAS
• JUGO GÁSTRICO:
– Procesarse antes de 4 horas después de su
obtención, si esto no es posible debe neutralizarse
con carbonato sódico.
– Especialmente para niños
• HECES
Principalmente útiles en casos de SIDA para el
diagnóstico de presencia de M. avium
• LÍQUIDOS ORGÁNICOS
En los líquidos orgánicos como LCR, L. pleural,
L. peritoneal o L. pericárdico, es importante la
mayor cantidad posible de muestra
(concentración)
 REACTIVOS

• CARBOL FUCSINA:
– 3 gr de fucsina básica +10 ml de alcohol etílico 95%
– 5 ml de fenol fundido
– 95 ml de agua destilada
– Juntar ambas soluciones y dejar reposar

• AZUL DE METILENO

• ALCOHOL ACIDO
 TECNICA: Coloración en caliente

Paso I: Se aplica el colorante primario sobre la muestra y se deja

reposar.
TECNICA: Coloración en caliente

Paso II: Se emplea la llama de un mechero para calentar la

muestra hasta la aparición de vapores blancos

Se forma el complejo colorante – pared (fucsina soluble en los

lípidos) Calor ; mordiente
TECNICA: Coloración en caliente

Paso III: Se lava con agua corriente

TECNICA: Coloración en caliente

Paso V: Se aplica el colorante secundario, se deja reposar y se

lava con agua

Colorante de contraste: Azul de metileno

 FUNDAMENTO

Se forma el complejo
colorante – pared
(fucsina soluble en los lípidos)
Calor ; mordiente

Colorante de contraste:
Azul de metileno
 INFORME DEL RESULTADO

METODO DE CDC
BAAR INFORME CDC
0 Negativo
1-2/300 C Número observado (+_)
1-9/100 C Número medio/100C (+)
1-9/10 C Número medio/10C (2+)
1-9/ C Número medio/C (3+)
>9/ C > 9/C (4+)
 RESULTADOS

• Resultados erróneos: Por errores en la técnica

durante cualquiera de los pasos: frotis →
coloración → paso de la llama (mordiente) →
secado y observación.
– Extendido muy grueso.
– Orden incorrecto de aplicación de los colorantes.
– Cantidad insuficiente de colorante sobre la muestra.
– Tiempo de contacto insuficiente, entre el colorante y la
muestra.
– Exposición a la llama durante poco tiempo (no se forma
el complejo) o mucho tiempo (carbonización celular).
– Cantidad insuficiente de decolorante, no se retira el
exceso de colorante primario de la muestra.
 SENSIBILIDAD

• La sensibilidad varía de acuerdo al tipo de

muestra
• La baciloscopia tiene una sensibilidad de 20
a 30%
– LCR: 40%
– Líquido pericardico: 50%
– Líquido peritoneal: 20 a 30 %
– Líquido sinovial: 20%
– Líquido pleural: 10 a 25%.
 COLORACION GIEMSA

• Coloración compuesta o diferencial (ya que

emplea más de un colorante

• Su empleo en Microbiología para identificar

parásitos (protozoarios de la sangre y los
tejidos), espiroquetas, levaduras y hongos
(Chlamydia).

• En hematología para observar elementos

sanguíneos normales
 FINALIDAD

1. En frotis sanguíneos para observar a los

agentes patógenos junto a las células
sanguíneas y mostrar las diferencias entre
ambos.

2. Citopatológico: ponen en evidencia la

morfología y estructura de los microbios
que pueden ayudar al diagnóstico certero
de varias enfermedades infecciosas de la
sangre.
 TECNICA

• Reactivos:
1. Metanol o etanol → fijador.
2. Colorante de Giemsa +
Agua tamponada (pH 7.2).

• Fundamento: se basa en la distinta afinidad que

demuestran las células y sus componentes a los distintos
colorantes incluidos en el colorante de Giemsa.
 TECNICA

• Técnica:
- Se realiza el extendido de la gota de sangre
(gota gruesa del pulpejo del dedo gordo).
- Se deja secar, se cubre con la solución de
Giemsa, se lava con agua y se observa.
- El fijador (metanol o etanol) se usa cuando se
cuentan con muestras de tejidos, no debe
usarse con extendidos de sangre.
 RESULTADOS
OBSERVACION ESPERADA:

• Núcleo celular = Rojo púrpura

• Citoplasma: 
- Granulocitos Neutrófilos= Rojo púrpura profundo
- Eosinófilos= Naranja amarronado
- Basófilos= Rojo negruzco
- Monocitos= Azul grisáceo
- Gránulos= Rojo púrpura
- Linfocitos= Azul
- Gránulos azurófilos= Rojo púrpura
- Eritrocitos= Marrón anaranjado
- Formas policromáticas= Azul violeta
- Punteado basófilo= Azul oscuro
- Cuerpos Howell Jolly= Rojo púrpura
Trombocitos:
- Hialómeros= Azul brillante
- Granulómeros= Rojo púrpura

PARASITOS 
• Núcleo celular= Rojo profundo
• Citoplasma = azul.
 RESULTADOS

• Resultados erróneos:
- Se deben principalmente a errores
durante el extendido sanguíneo o durante
la aplicación del fijador
 COLORACION TINTA CHINA

• No es un coloración de rutina
• Usado para mejorar la detección
microscópica del cryptococcus
• Coloración para células con cápsula
• La cápsula excluye al colorante: el
material capsular desplaza las partículas
de carbón de la tinta, tanto que la cápsula
aparece con un halo claro alrededor
 MUESTRAS

• Esputo
• Pus
• Exudado
• Tejidos
• Sedimento de Orina y LCR
 COLORACION TINTA CHINA

Sensibilidad de
25 a 50%

Especificidad >
100%: leucocitos
 AZUL DE TOLUIDINA

• Para diagnóstico de P. carinii

• Muestras: esputo y lavado broncoalveolar
• Sensibilidad de 80%

• REACTIVOS:
– Reactivo de Sulfatación:
– 45 ml de Ácido acético glacial
– 15 ml de ácido sulfúrico
– Azul de toluidina O
– 0.3 gr de Azul de Toluidina
– 60 ml de agua destilada
– 2 ml de ácido clorhidrico
– 140 ml de etanol absoluto.
 AZUL DE TOLUIDINA

TECNICA:
• Cubrir las láminas con reactivo de sulfatación
por 5 minutos
• Agitar la placa en movimientos rotatorios por 30
veces
• Dejar reposar 5 minutos
• Retirar y lavar por 5 minutos en agua destilada
• Colorear en Azul de Toluidina por 40 a 50
minutos
• Pasar por xilol y montar