Cromatografia de exclusión:

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION:

TIPO DE CROMATOGRAFÍA LIQUIDA EN

LA CUAL LA FASE ESTACIONARIA ES
SOLIDA Y LA FASE MÓVIL ES LIQUIDA.

“CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION
POR TAMAÑO”

“CROMATOGRAFIA DE
PERMEABILIDAD SOBRE GEL”
CARACTERISTICAS:

• FASE ESTACIONARIA ES INERTE,

ENTRADA DE MUESTRA
POR LO QUE LA COLUMNA NO SE
DESACTIVA. LIQUIDO QUE BAÑA EL GEL

SUPERFICIE DEL GEL

• LA MUESTRA NO INTERACCIONA
QUIMICAMENTE CON LA FASE GEL DEPOSITADO
ESTACIONARIA, NI CON LA FASE
MOVIL. FILTRO POROSO QUE RETIENE EL
GEL
• LOS SOLUTOS SON ESPACIO OCUPADO POR RELLENO
INERTE
GENERALMENTE SUSTANCIAS DE
PESO MOLECULAR ELEVADO.
SALIDA DE MUESTRA FRACCIONADA

“ESQUEMA DE UNA COLUMNA DE CROMATOGRAFIA DE FILTRACION DE GEL”

PRINCIPIOS:
• CON LA CROMATOGRAFIA DE FILTRACION
DE GEL SE SEPARAN MOLECULAS POR SU
DIFERENCIA DE TAMAÑOS.

• LA CAPACIDAD SEPARADORA RESIDE EN

EL GEL CUYA MATRIZ CONSTA DE UN
GRAN NUMERO DE ESFERAS POROSAS
MICROSCOPICAS.

• ESTAS ESFERAS ESTAN CONSTITUIDAS

POR LARGAS CADENAS DE POLIMEROS
UNIDOS ENTRE SI POR ENLACES
QUIMICOS PARA FORMAR UNA RED
TRIDIMENSIONAL.
 1. LA LONGITUD DE ONDA.

FACTORES QUE 2. VOLUMEN DE LA MUESTRA.

INFLUYEN EN LA 3. FLUJO.
SEPARACION: 4. EL EMPAQUETADO DEL GEL EN
LA COLUMNA.
MATERIAL NECESARIO:

ESPECTROFOTOMETRO CELDAS COLUMNAS

MATERIAL DE LABORATORIO:

PIPETAS DE 3 Y 5
GRADILLA TUBOS DE ENSAYO MICRO PIPETAS
ml
REACTIVOS:

AGUA AZUL DE
FERROCIANURO
DESTILADA DEXTRANO
PROCEDIMIENTO EN LABORATORIO:

1. Cada grupo recibe una columna ya

equilibrada en el tapo de elución, una alícuota
de mezcla.
2. Se coloca la columna en el soporte de forma
que se encuentre vertical, se quita el tampón
inferior de la columna y se deja caer el
tampón por gravedad hasta que quede sobre
la superficie.
3. Inmediatamente se aplica la muestra sobre la
columna y se espera a que penetre en el gel.
Se añade después de cierto volumen de
tampón y se comienza a recoger fracciones
en orden sucesivo.
4. Una vez recogidas todas las muestras, se
mide su absorbancia en el espectrofotómetro.
PARÁMETROS DEL METODO Y CALIBRACIÓN:

FLUJO:
Puede afectar negativamente a la resolución, pues la SEC se basa en la difusión hacia
el interior y exterior de un poro para crear rutas de diferente longitud a través de la
columna.

SELECCIÓN DE FASE MOVIL:

Para evitar las indeseables interacciones secundarias, podría ser necesario realizar
una optimización del método. Tales interacciones podrían hacer que un analito se
eluya mas tarde de lo esperado y hacer que parezca de un peso molecular mas bajo.

CALIBRACION:
Una vez elegida una columna, será necesario construir una calibración con patrones
de peso molecular conocido. Cada vez que cambie la columna o realice
modificaciones a la fase móvil, deberá repetir la calibración.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION:

VENTAJAS: DESVENTAJAS:

 TIEMPO DE SEPARACION Y DE ORDEN DE X LIMITA LA CAPACIDAD DE PICO.

ELUCION FACILMENTE PREDECIBLES.

X NO SE PUEDEN RESOLVER COMPUESTOS DE

 DESARROLLO DE METODOS RELATIVAMENTE TAMAÑOS SIMILARES.
SENCILLOS, SIN GRADIENTES.
X SE REQUIERE DE UNA DIFERENTE
 NO EXISTEN PERDIDAS O REACCIONES EN LA ESTRATEGIA DE OPTIMIZACION.
COLUMNA.