Revisión de Tema: Linfocitos B y Dengue: Dora Emilia Fierro Rodríguez

Revisión de tema: Linfocitos B y dengue
Dora Emilia Fierro Rodríguez

Estudiante de Doctorado en Ciencias Biológicas
Introducción
Dengue
Enfermedad viral transmitida por mosquitos, causada por el
virus del dengue (DENV).
 Virus endémico en mas de 100 países.

 Causa +/- 390 millones de infecciones al año.
 25% de los casos hace manifestaciones clínicas.
Dengue sin signos

de alarma.
Dengue con signos
de alarma.
Dengue grave.
Las respuestas de las células B durante la infección por DENV
Virus del Dengue Virus RNA de cadena sencilla, envuelto.
El genoma codifica tres proteínas estructurales: cápside, envoltura (E) y membrana (M), y
siete proteínas no estructurales (NS): NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5.
La proteína M se forma primero como un precursor llamado proteína M

precursora (prM).
El proceso de maduración de DENV está dirigido por la escisión proteolítica de la
prM, produciendo partículas infecciosas totalmente maduras.
Proteína E
 La proteína estructural E tiene tres dominios (EDI-III).

 EDIII participa en la unión del virus a la superficie de la célula
hospedera.
 Se sabe que los Abs neutralizantes se dirigen preferentemente a EDIII.
 Hallazgos recientes indican que la proteína Abs a E podría facilitar la
infección por DENV cuando está presente en concentraciones
subneutralizantes.
Uno, N., & Ross, T. M. (2018). Dengue virus and the host innate immune response. Emerging microbes & infections, 7(1), 167. https://doi.org/10.1038/s41426-018-0168-0
Infección de células B por DENV
¿Están las células B infectadas con DENV?

Casos fatales en humanos: Proteínas virales NS1, NS3,
RNA viral en células B del
Ag virales dentro de órganos prM en el centro germinal en
centro germinal.
linfoides. humanos y en ratones.
¿Están infectados solo en sangre periférica o también en

tejidos?
Infección de células B
por DENV
Objetivo: Determinar si hay implicación de reacciones de GC durante la infección cutánea por DENV y si existe algún tipo de respuesta de Ab preferencial a proteínas
virales definidas.
Materiales y métodos: La inoculación intradérmica de DENV a una dosis relativamente baja infecta eficazmente ratones BALB / c inmunocompetentes, induciendo
mayores cantidades de células B GC específicas de DENV y GC más grandes que las condiciones de control.
Resultados: los GC exhibieron tanta prM como la proteína de envoltura (E) y proteínas virales no estructurales. A pesar de la abundancia mucho mayor de proteína E
que de proteína prM en los viriones, los animales infectados mostraron cantidades similares de células B en los centros germinales (GC) específicas de Ag y Abs
circulantes tanto para las proteínas prM como para las proteínas E, incluso significativamente más altas para prM.
Discusión y conclusiones: Hasta donde se sabe, no hay informes de las respuestas de GC durante la infección por DENV. Esta respuesta anti-prM relativamente más
fuerte podría ser desencadenada por DENV para promover preferentemente los Abs contra ciertas proteínas virales, lo que podría favorecer las infecciones al facilitar la
invasión de DENV de las células huésped. Por tanto, es concebible que DENV haya evolucionado para inducir este tipo de respuestas Ab.
El DENV cutáneo induce un mayor número y tamaño de GC en comparación con las condiciones de control.
La inoculación cutánea de DENV induce una mayor cantidad de células GC B

(IgD-CD19 + PNA +) en DLN en comparación con las condiciones de control.
Distribución in situ de proteínas DENV dentro de GC en DLN

Respuestas de plasmablastos y células plasmáticas durante la infección por DENV
 Las respuestas de PB en pacientes con infección aguda por DENV muestran un gran aumento sobre los niveles observados en pacientes
con otras infecciones y sobre los niveles basales encontrados en sujetos sanos no infectados.
Objetivo: determinar como es la respuesta aguda y temprana de las células B convalecientes que conduce a la generación de anticuerpos neutralizantes y de reacción cruzada después de la
infección por dengue.
Metodología / hallazgos principales: se analizaron muestras de sangre tomadas de pacientes con dengue con infección primaria o secundaria durante la enfermedad aguda y la
convalecencia y se compararon con muestras de pacientes que presentaban fiebre no relacionada con el dengue. El dengue indujo la formación masiva de plasmablastos precoces, que se
correlacionó con la aparición de IgG policlonal con reactividad cruzada para la infección primaria y secundaria.
Conclusiones / importancia: la IgG polirreactiva y de serotipo viral con reactividad cruzada es un componente importante de la respuesta innata en humanos durante la infección por
dengue primaria y secundaria, y las "especificidades innatas" parecen constituir parte de la respuesta adaptativa en el dengue. Si bien son de importancia potencial para la protección
durante la infección secundaria, las células B de reacción cruzada también competirán con las células B altamente neutralizantes y posiblemente interferirán con su desarrollo.
Inducción rápida de anticuerpos IgG con reactividad
cruzada después de la infección por dengue
Activación de células B policlonales después de la infección por dengue.

Respuestas primarias de células B y Abs de IgM durante la infección por DENV
 En los primeros encuentros con los hospederos, la mayoría de los patógenos desencadenarán una respuesta inmune humoral
primaria caracterizada por un aumento temprano de los Abs IgM específicos.
 Pocos estudios se han centrado en los Abs “naturales” primarios durante la infección por DENV.
 La IgM se puede encontrar en infecciones secundarias aunque, comúnmente, los títulos promedio son más bajos que en las primarias.
 La respuesta de IgM humana a DENV podría tener una reacción cruzada predominantemente entre los serotipos de DENV, y esta respuesta de
IgM es significativamente mayor en pacientes con SD que en pacientes con DF (fase aguda).
Respuestas de células B a largo plazo (memoria) y abs de memoria

durante la infección por DENV
 Los Abs de memoria IgG se generan principalmente a través de reacciones dependientes de células T.
 La respuesta de células B detectada temprano después de la infección primaria por DENV es predominantemente específica de
serotipo, mientras que las respuestas detectadas temprano después de la infección secundaria son predominantemente de reacción
cruzada de serotipo.
Conclusiones
 A pesar de que las respuestas Ab son generadas por las células B, sabemos sorprendentemente poco sobre las respuestas de
las células B (agudas, crónicas o de memoria) y los mecanismos celulares que generan estos Abs durante las infecciones por
DENV, tanto en humanos como en modelos animales.
 Se supone que las células B y T participan tanto en la protección como posiblemente en la potenciación putativa de la
enfermedad.
 Conocer qué epítopos están impulsando las diferentes respuestas de Ab y cómo es que se establecen afinidades de Ab
mayores o menores durante la infección y si estos eventos influyen en la protección o patogénesis durante la enfermedad,
podría ser de gran utilidad para diseñar más eficientes, y particularmente en el caso del dengue, vacunas más seguras.
Deterioro de la respuesta inmune independiente
de anticuerpos de las células B en pacientes con
infección aguda por dengue
Introducción
Además de la producción de anticuerpos, las
células B tienen diversas funciones.
Presentación de
antígenos.
Producción de
citocinas
Inflamación. inmunosupresoras
IL-10, TGF-β e IL-
Blausen.com staff
(2014).
35.
Subconjuntos de células B humanas tienen funciones reguladoras

C
Céélulas
lulas B
B con
con funciones
funciones reguladoras
reguladoras CD24 hi
hi CD27 +
+ B10
(Bregs):
(Bregs): mantenimiento
mantenimiento de
de la
la Plasmablastos CD19 ++ CD24 hi
hi CD27 int
int
tolerancia y la homeostasis.
tolerancia y la homeostasis. Células B de transición CD19 ++ CD24 hi hi CD38 hi
hi
En el contexto de la infección por DENV, no se sabe mucho sobre las respuestas de las células B independientes de los
anticuerpos.
Objetivo
 Definir la distribución de subconjuntos de células B en la fase

temprana de la infección por DENV y caracterizar el efecto de la
infección por DENV en diferentes funciones de las células B.
Materiales y métodos
Pacientes
Análisis de células B
Cultivo de células B
Reclutamiento de pacientes
≥ 2 años Hospital Kanta Bopha en En las 96 h del inicio de la

Síntomas similares a dengue Phnom Penh, Camboya fiebre.
 En total, 81 pacientes con dengue positivos.
 Hemograma completo disponibles para 59 niños incluidos.
 Para detectar las respuestas de células B específicas de DENV, los pacientes que
presentaban fiebre pero eran negativos para DENV se incluyeron como controles ( n = 29).
 Donantes sanos de la misma edad y sexo ( n = 29).

Resultados
Datos demográficos de la población del estudio
Aislamiento de células
B.
1
1 2
2 3
3 4
4
Las
Las células
células se
se tiñeron
tiñeron con:
con:
CD19
CD19 Alexa
Alexa Fluor
Fluor 488,
488, FcRL4
FcRL4 PE,
PE, CD27
CD27 APC
APC // Cy7,
Cy7, Células B
CD138
CD138 BV421, IgM PerCp / Cy5.5, CD24 PE
BV421, IgM PerCp / Cy5.5, CD24 PE // Cy7,
Cy7,
CD38
CD38 APC,
APC, IgG
IgG BV510.
BV510.
Medio
Medio RPMI,
RPMI, FSB
FSB al
al 10%,
10%, L-glutamina,
L-glutamina,
penicilina-estreptomicina.
Clasificación de las células
PBMC
PBMC gradiente
gradiente de
de densidad
densidad
Ficoll-Histopaque
Ficoll-Histopaque
 Promover la
 Promover la producción  Inducir la activación de
diferenciación de
de citocinas células B
células plasmáticas.
Resultados
Distribución Alterada de subconjuntos de células B en la infección grave por DENV
Resultados
Desarrollo similar de células plasmáticas en individuos infectados por DENV e
individuos sanos
Resultados
Concentraciones de CD40L y su asociaci ón con el Producción de citocinas en células B de

porcentaje de células B CD19++ CD24hi
hi CD38hi
hi en dengue grave pacientes con dengue
Resultados
Estímulo del receptor tipo TLR de las Expresión de receptores Fc inhibidores en las
células B de pacientes con Dengue células B
Discusión
 Distribución alterada de los subconjuntos de células B en los pacientes con DENV positivo
en comparación con los niños que padecían enfermedad febril, lo que se correlacionó con
la gravedad de la enfermedad en los pacientes infectados con dengue.
 Respuesta funcional de células B funcionalmente deteriorada en pacientes con dengue.
 Marcado aumento en los porcentajes de plasmablastos y células plasmáticas en

pacientes entre los días 4 y 7 posteriores a la aparición de los síntomas.
 No hay diferencias en las concentraciones plasmáticas de APRIL.
 Disminución de dos veces en las células CD24 hihi CD38 hihi dentro de la población de células

B CD19 ++ en pacientes que sufren dengue grave.
Discusión
 Mostramos aquí la disminución de las concentraciones plasmáticas de sCD40L en pacientes con dengue
grave. Estos datos están en línea con hallazgos previos, donde se observaron concentraciones séricas
reducidas de sCD40L en pacientes adultos infectados con DENV con pérdida de plasma.
 Las células B aisladas de pacientes con dengue fueron refractarias a la estimulación con TLR9, ya que no
observamos una regulación al alza de los marcadores de activación o marcadores coestimuladores
necesarios para la presentación de antígenos en células B vírgenes después de la estimulación in vitro .
 Observamos un aumento de la expresión de CD32B y LILRB1 en células CD19 ++ CD27 -- B directamente ex

vivo durante la fase temprana de la infección por dengue.
Conclusión
Se
Se observó
observó disminución
disminución dede los
los porcentajes
porcentajes de de CD24
CD24 hihi CD38
CD38 hihi células
células B
B yy CD27
CD27 -- células
células B
B naive
naive dentro
dentro de
de la
la población
población CD19
CD19 yy el
el aumento
aumento de
de los
los
porcentajes
porcentajes de
de CD27
CD27 + CD38
+
CD38 hi CD138
hi
CD138 + células
+
células plasmáticas
plasmáticas que
que correlacionan
correlacionan concon la
la gravedad
gravedad de
de la
la enfermedad
enfermedad dentro
dentro de
de 44 días
días después
después de
de
aparición
aparición de de síntomas
síntomas de
de lala fiebre.
fiebre.
CD19
CD19 ++ CD24
CD24 hihi CD38
CD38 hihi y
y CD19
CD19 ++ CD27
CD27 :: las
las células
células B
B de
de los
los pacientes
pacientes con
con dengue
dengue fueron
fueron refractarias
refractarias aa la
la estimulación
estimulación de
de TLR in
TLR in vitro ,
vitro , lo
lo que
que
resultó en una disminución de la producción de citocinas de IL-10 y TNF-α específicas de las células B, lo que se correlaciona
resultó en una disminución de la producción de citocinas de IL-10 y TNF-α específicas de las células B, lo que se correlaciona con una mayorcon una mayor
expresión
expresión de de inhibidores
inhibidores FcγR in
FcγR in vivo
vivo en
en células
células BB sin
sin tratamiento
tratamiento previo
previo de
de pacientes
pacientes infectados
infectados con
con DENV.
DENV.
Tomados
Tomados en
en conjunto,
conjunto, nuestros
nuestros resultados
resultados indican
indican una
una respuesta
respuesta defectuosa
defectuosa de
de células
células B
B en
en pacientes
pacientes con
con dengue
dengue que
que puede
puede contribuir
contribuir aa la
la
patogénesis
patogénesis de
de DENV
DENV durante
durante la
la fase
fase aguda
aguda dede la
la infección. Estos
infección. Estos datos
datos enfatizan
enfatizan la
la importancia
importancia de
de las
las funciones
funciones de
de las
las células
células B
B independientes
independientes
de los anticuerpos en la fase temprana del desarrollo de la enfermedad después de la infección por
de los anticuerpos en la fase temprana del desarrollo de la enfermedad después de la infección por dengue. dengue.
Gracias
Vol 127, August 2003
Un hombre blanco de 40 años, de profesión ingeniero, nacido en Estados Unidos.
Había vivido durante 3 años en Tokio. Antes de eso, vivió y trabajó durante 2 a 6 años en Sur Africa,
Kuwait y Zimbabwe.
 2 semanas antes de la presentación de los síntomas, estuvo de vacaciones en Borakai.
 Signos de picadura en antebrazo derecho (insecto desconocido) y desarrolló un pequeño nódulo.
 En Filipinas: tratado en un hospital local por fiebre, vómito y diarrea (antibiótico - síntomas cedieron).
 1 semana después del cuadro gastrointestinal, presentó mialgias severas, cefalea, fotofobia leve y persistente.
 Examen físico; eritrodermia, temperatura y signos vitales normales. Inyección conjuntival, nódulo
no doloroso móvil en la cadena cervical posterior derecha y ganglios inguinales bilaterales.
 Se realizó un diagnóstico presuntivo de dengue agudo.

Recuento de glóbulos blancos de 5800/ µl (rango de referencia, 4,1-10,9).

Los resultados de laboratorio en la presentación  19% de células plasmáticas (1100 / µl).
fueron notables por un sorprendente aumento de  9% anormal linfocitos plasmocitoides (520 / µl).
la población de células plasmáticas, linfocitos  37% polimorfonucleares leucocitos.
plasmocitoides, y trombocitopenia (68000 / µl).  3% de formas de banda.
 27% de linfocitos.
 4% de monocitos.
 1% de eosinófilos.
Otros resultados
• Hemoglobina fue de 16,7 g / dL (13,5– 17.0).
• Alanina aminotransferasa a 125 U / L (7-40).
• Aspartato aminotransferasa a 135 U / L (11-40).
• Pruebas de la coagulación dentro de los rangos de referencia.
La biopsia y el aspirado de médula ósea fueron normales.
La citometría de flujo de los linfocitos de la médula ósea mostró valores normales Células T y células B policlonales; no se identificaron células anormales.
Inmunoglobulinas policlonales y otras proteínas séricas estaban presentes en su orina.
Pruebas serológicas
 Sífilis VDRL
 antígeno de superficie y anticuerpos de la hepatitis B
 anticuerpo contra el antígeno central de la hepatitis B
 anticuerpo contra la hepatitis C
 antígeno p24 del virus de inmunodeficiencia humana y anticuerpo contra virus de inmunodeficiencia humana
 anticuerpos contra citomegalovirus
 anticuerpos contra la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas y el tifus fueron negativos.
 Tres frotis secuenciales de paludismo fueron negativos.
 Los cultivos de sangre (33), orina y heces fueron normales.
 Muestras de heces analizadas para huevos y parásitos y para Clostridium difficile fueron negativas.
 Pruebas serológicas para el virus de Epstein-Barr, rubéola (+ exposición previa).
• Pruebas serológicas para el virus del dengue

• CDC fueron positivas para IgM y IgG, compatibles con una Infección por dengue de serotipo desconocido.
• La fiebre y la diarrea del paciente se resolvieron 3 días después, al igual que su plasmocitosis y
trombocitopenia.
• Se mantuvieron las pruebas de función hepática levemente elevado.
• Este paciente se mantiene bien 4 años después. Sus resultados de laboratorio más recientes no fueron
notables.
Fiebre del dengue que imita una leucemia de células plasmáticas
Discusión
• La plasmocitosis extrema en sangre periférica es rara.
• Una revisión retrospectiva de 98261 completa recuentos de células sanguíneas con diferencial (Burlington, Mass)
produjo solo 6 casos en el que la plasmocitosis relativa fue del 10% o más.
• Estas se obtuvieron de 2 pacientes, ambos con neoplasias hematológicas.
Association between magnitude of the virus-specific plasmablast response and disease severity in dengue patients

Introducción
Virus de ARN monocatenario de sentido positivo (familia Flaviviridae).

Endémico (más de 100 países), causa 390 millones de infecciones al año.
Cuatro serotipos (DENV1–4), comparten un 65–80% de homogeneidad en su secuencia genética.
Infección primaria: anticuerpos con una potente capacidad protectora contra la reinfección homotípica.
Inmunidad protectora cruzada de corta duración.
Infecciones secundarias heterólogas se asocian con una mayor gravedad en los pacientes.
Introducción
Potenciación de la infección dependiente de anticuerpos

(ADE).
Anticuerpos de reacción cruzada pueden aumentar la infección

al facilitar la endocitosis de los complejos inmunes DENV
mediada por FcγR en las células diana (células dendríticas, los
monocitos y los macrófagos).
Mecanismos de neutralización y potenciación por anticuerpos

específicos del virus del dengue.

Altos niveles de ocupación de epítopos: Ac bloquean la unión
de viriones al receptor celular o pueden bloquear la fusión en
una etapa posterior a la unión.
Niveles más bajos de ocupación de epítopos: Ac pueden mejorar

la captación de viriones en las células al interactuar con los
receptores de inmunoglobulina Fc.
Rothman,
Rothman, A.
A. Immunity
Immunity to
to dengue
dengue virus:
virus: aa tale
tale of
of original
original antigenic
antigenic sin
sin and
and tropical
tropical cytokine
cytokine storms. Nat
storms. Nat Rev
Rev Immunol 11, 532–543
Immunol 11, 532–543 (2011).
(2011).
Objetivo
Caracterizar la respuesta aguda de células B en pacientes con
dengue en una cohorte hospitalaria en Brasil, comparando
infecciones primarias y secundarias y enfermedad leve y grave.
Características de los pacientes
Aumento del recambio y activación de las células B durante la infección
aguda por DENV
Evaluar el efecto de la infección por DENV sobre 84 pacientes. Citómetro de flujo LSRII (Becton Dickinson).
el número de células B y su recambio in vivo. Días 1 a 9, inicio síntomas. Análisis de datos: software FlowJo (Tree
Star).
Aumento del recambio y activación de las células B durante la infección
aguda por DENV
Un tercio de las células B vivas en individuos con infección secundaria severa por
DENV estaban sufriendo apoptosis que se correlacionó positivamente con la
proliferación y activación de las células B.
Sugieren que la infección por DENV promueve la muerte de las células B inducida
por la activación y una mayor renovación de las células B.
Activación de las células B en la infección aguda por DENV
Las células B activadas expresaron CD95 que puede contribuir a la apoptosis a través del acoplamiento de la ruta CD95 / CD95L.
Se ha propuesto un mecanismo similar para explicar la apoptosis de las células T CD8 + durante la infección grave por DENV
Expansión marcada de plasmablastos en la infección secundaria grave
por DENV
El hallazgo de expansión masiva de plasmablastos durante los días 4 a 7 de los síntomas, coincide
con informes recientes de pacientes adultos con dengue en Singapur y Vietnam, donde las
respuestas plasmáticas significativas también se asociaron con infecciones secundarias por DENV
que excedieron las de los individuos con enfermedades agudas no relacionadas con el dengue.
Expansión marcada de plasmablastos en la infección secundaria grave
por DENV
La magnitud de la respuesta de plasmablastos en pacientes con dengue aumenta

tanto con la infección secundaria como con la gravedad de la enfermedad.
Los plasmablastos en la infección secundaria grave por DENV son
específicos de DENV y presentan una reacción cruzada de serotipos,
pero reaccionan preferentemente con el serotipo infectante
Una cuestión clave relacionada con la función de los plasmablastos en el

dengue es su especificidad y capacidad para reaccionar de forma cruzada
con diferentes serotipos de DENV.
En promedio, más del 70% de los plasmablastos en los individuos

evaluados con DFC secundaria produjeron IgG específica de DENV, un
hallazgo que corresponde a otros datos publicados en la literatura.
Los plasmablastos en la infección secundaria grave por DENV son
específicos de DENV y presentan una reacción cruzada de serotipos,
pero reaccionan preferentemente con el serotipo infectante
Los Ab específicos de DENV producidos por plasmablastos reaccionaron con

varios serotipos de DENV que reflejan la reactividad cruzada de la respuesta de
las células B en la infección secundaria aguda, como se observó en otras
cohortes de pacientes con dengue.
En los pacientes infectados con DENV-3 con enfermedad grave en nuestro

estudio, los plasmablastos tuvieron una reactividad 3 veces mayor con el
serotipo infectante que con otros dos serotipos heterotípicos.
Otros estudios revelaron frecuencias significativamente más altas de

plasmablastos / células plasmáticas de reacción cruzada que reaccionaron con
un serotipo infeccioso previo.
Correlación entre la respuesta plasmática y los títulos de
Anticuerpos neutralizantes en suero
Discusión y Conclusiones
 Los mecanismos responsables de la gran expansión de plasmablastos en la infección secundaria grave por DENV no se han
determinado.
 La IL-10 y el TNF-α impulsan el desarrollo de células plasmáticas y están elevados en los pacientes con dengue con una enfermedad
cada vez más grave. En esta cohorte de pacientes no hubo una correlación aparente entre la concentración sérica de estas citocinas y la
frecuencia de plasmablastos circulantes en la enfermedad aguda (datos no mostrados).
 De manera similar, el análisis serológico preliminar de otras citocinas candidatas que impulsan la diferenciación de células B, incluidas
IL-6, IL-21, BAFF y APRIL, no reveló ninguna asociación con la magnitud de la respuesta de plasmablast (datos no mostrados).
 Un análisis más profundo de los factores que se sabe que regulan la diferenciación de las células B puede proporcionar información
sobre la respuesta del plasmablastos a la infección por DENV y su relación con la gravedad de la enfermedad.
Presentación de caso Clínico.
Experimental and Molecular Pathology 97 (2014) 208–210

Resumen
La mielofibrosis se caracteriza por reemplazo del tejido de la médula ósea por tejido cicatricial,
normalmente altas concentraciones de reticulina y colágeno en el estroma, generando citopenia
secundaria.
Causas:
• Neoplasias hematológicas clonales.
• Otras condiciones clínicas:
– trastornos hematológicos.
– neoplasias sólidas.
– síndrome de Down.
– enfermedades autoinmunes y otras.
Primer caso que se conoce de mielofibrosis asociada al dengue.

Introducción
El dengue es una enfermedad viral transmitida por mosquitos que se propaga rápidamente con una incidencia
mundial de 50 a 100 millones de casos al año.
Los síntomas incluyen fiebre, dolor de cabeza, mialgias, artralgias y una erupción característica.
La trombocitopenia es una manifestación constante del dengue.
La mielofibrosis es una entidad poco común caracterizada por aumento de reticulina y / o fibras de colágeno en la
médula ósea.
• La fibrosis de la médula ósea (mielofibrosis) puede ocurrir como trastorno primario o secundario a otras
condiciones clínicas.
• La mielofibrosis secundaria se puede observar en una variedad de enfermedades que incluyen leucemias,
linfomas, mieloma múltiple, carcinoma metastásico, trastornos endocrinos, enfermedades autoinmunes,
radiación y toxinas.
Reporte de un caso
• Un varón de 52 años previamente sano ingresó en nuestro hospital por anemia, trombocitopenia,

exantema bilateral de extremidades inferiores y hematuria.
• Había viajado a Vietnam dos meses antes de la admisión para visitar a su familia y desarrolló
fiebre, ampollas hemorrágicas bilaterales en la boca y debajo de la lengua menos de un mes después
de su viaje.
• Recordó haber tenido picaduras de mosquitos mientras estaba en Vietnam. Fue evaluado en

Vietnam por fiebre e insuficiencia hepática y le diagnosticaron dengue.
– Recibió soporte de transfusión de plaquetas.
– Aunque su fiebre y ampollas hemorrágicas se resolvieron, tenía trombocitopenia persistente,
hematuria, ictericia y sarpullido bilateral en las extremidades inferiores.
Reporte de un caso
A los dos meses:

• En la exploración física destacaba el sangrado de las encías y el exantema petequial bilateral de las extremidades inferiores que se extendía hasta el tronco y la espalda.
Las tomografías computarizadas de tórax, abdomen y pelvis:

• derrames pleurales bilaterales.
• ascitis, linfadenopatía extensa con el ganglio linfático más grande midiendo 11 a 12 mm de diámetro máximo del eje corto.
• quistes renales y cálculos renales no obstructivos.
• vejiga engrosada irregularmente.
• no se observó hepatoesplenomegalia en las imágenes.
Los estudios de laboratorio en la admisión:

• glóbulos blancos recuento de 9400 c/mm 3 (80% neutrófilos, 14% linfocitos, 4% monocitos y 2% de eosinófilos).
• una concentración de hemoglobina de 8,1 g/dl, un hematocrito de 25,3%.
• un recuento de plaquetas de 7000 c/mm 3.
• un dímero D de 2655 ng/mL.
• pruebas de función hepática normales.
El análisis de orina:
• 3 + proteínas, 2 + sangre, 115 glóbulos blancos por campo de alta potencia y más de 182 glóbulos rojos por campo de alta potencia.
Anticuerpos séricos contra el dengue:

• niveles elevados de IgG (2,47, rango de referencia: < 0,90) e IgM normal (0,83, rango de referencia: < 0,90).
Reporte de un caso
A los dos meses:
• El paciente fue tratado con glóbulos rojos empaquetados y transfusión de plaquetas y prednisona a 1 mg / kg
(60 mg al día) sin ningún aumento significativo de plaquetas.
• El frotis de sangre periférica mostró anisopoiquilocitosis moderada con hipocromía moderada, algunas células
en lágrima y esquistocitos. Se observaron glóbulos rojos nucleados circulantes y células
plasmáticas escasas. No se encontraron células mieloides inmaduras.
El examen de la médula ósea se hizo al 4 de hospitalización.

• La biopsia mostró una médula ósea hipercelular con degeneración mucinosa de las células grasas y depósito
de material amorfo eosinofílico, hiperplasia eritroide y megacariocítica, así como fibrosis reticulínica moderada.
• No hubo evidencia de cambios mielodisplásicos, agregados linfoides, leucemia, linfoma o carcinoma
metastásico.
El paciente fue dado de alta el séptimo día de hospitalización con prednisona 20 mg al día.
Frotis de sangre periférica. Análisis de médula ósea
célula en forma de lágrima
Tinción de Romanowsky Tinción de Acido periódico Tinción de Acido periódico Tinción de reticulina
de Schiff de Schiff MF 2/3 OMS 2008
Seguimiento
Tres días después del alta:

• dosis de prednisona se aumentó a 1 mg/kg debido a la trombocitopenia persistente 8000 c/mm 3.
• Aproximadamente 1 semana después del alta se realizó una cistoscopia que mostró hemorragia
estromal reciente.
– La biopsia de vejiga: negativa para tumor.
• Tres semanas después del alta, la anemia y la trombocitopenia comenzaron a recuperarse, y un
hemograma completo dos meses después del alta mostró la resolución de la anemia y la
trombocitopenia.
Discusión
• La fibrosis de la médula ósea (mielofibrosis) se puede observar en una variedad de condiciones clínicas.
• Es probable que la mielofibrosis secundaria a enfermedades infecciosas sea transitoria, que a menudo vuelve a la normalidad después
del tratamiento de enfermedades infecciosas, como en nuestro paciente.
• El virus del dengue se ha detectado en células de la piel, hígado, bazo, ganglios linfáticos, riñón, médula ósea, células endoteliales,
pulmón, timo, cerebro y corazón.
• Se ha demostrado que las células del estroma de la médula ósea y los progenitores de la médula ósea son susceptibles a la infección
por el virus del dengue.
• Se cree que una alta carga viral y la activación de una gran cantidad de células T y monocitos/macrófagos dan como resultado una
"tormenta" de citocinas inflamatorias y otros mediadores.
– Citocinas y factores solubles conduce a necrosis y apoptosis de células y tejidos, disfunción de células endoteliales, aumento de la
pérdida de plasma, supresión de la hematopoyesis y desarrollo de trastornos de la coagulación.
– Todos estos pueden contribuir a las anomalías hematológicas, incluida la mielofibrosis, observada en estos pacientes.
• Esto teniendo en cuenta la población de Neiva de acuerdo
al Censo del 2018.
• En la epidemiologia del dengue encontré siempre la
incidencia en la población, no frecuencia o prevalencia de Controles febriles
la enfermedad. dengue sin signos de alarma
• Vamos a calcular un tamaño muestral? O vamos a trabajar dengue 1
con un muestreo por conveniencia dengue 2
Dengue con signos de alarma
Dengue grave
Tamaño de población: pediátrica dengue 1
Mayores de 2 años hasta 15 años dengue 2
Tamaño de población: pediátrica - Mayores de 2 años hasta 15 años
1. Controles sanos (+/-)

2. Controles febriles
3. dengue sin signos de alarma
dengue 1
dengue 2
3, Dengue con signos de alarma (Dengue grave)
dengue 1
dengue 2
Si queremos incluir adultos, qué n es el adecuado
RT PCR tr dengue carga viral y caracterización de serotipo (plasma o suero? - cantidad)

Elisa IgM, IgG para clasificar dengue primario y dengue primaria PANBIO (suero o plasma? - cantidad)
Monitoreo inmune por citometría de flujo de los pacientes con dengue, lb, células dendríticas, lt, monocitos
Células
Qué es importante evaluar en células infectadas con dengue
Apoptosis, ROS, carga viral en células infectadas con dengue
Lo que se conoce y qué debemos mejorar para conocer

Incluirlos a todos en el mismo análisis inicialmente.
Después se hace un análisis estratificado para determinar si la variable edad genera confusión, y con el
análisis estratificado se controla la confusión.
Entre mas subgrupos se tengan, mayor debe ser la muestra del estudio.
Explicar por qué se excluyen los pacientes menores de 2 años de edad.
9-03-2021
Introducción
El dengue es la enfermedad transmitida por vectores m ás com ún en todo el
mundo.
Transmitido por los mosquitos vectores Aedes aegypti y en menor medida Aedes

albopictus (habitan zonas tropicales y subtropicales del mundo).
Los agentes etiológicos del dengue, son cuatro virus relacionados gen ética y
serológicamente que pertenecen a la familia Flaviviridae.
La infección puede conducir a un amplio espectro de enfermedades cl ínicas

(síndrome febril inespecífico hasta el dengue hemorr ágico).
El sello distintivo del dengue grave
Perturbación transitoria en la integridad de los vasos sangu íneos y la

coagulación. La recuperación suele ser rápida y completa.
Introducción
La minoría de los casos de dengue presenta una
fuga de plasma grave y hemorragia (1%).
 La necesidad de una vigilancia estrecha para la detección y el tratamiento oportunos de estas

manifestaciones graves ejerce una gran presión sobre el sistema de salud pública en las zonas
endémicas, muchas de las cuales tienen recursos limitados.
 No existen marcadores fiables para predecir el desarrollo de manifestaciones graves
 intervenciones específicas disponibles en la actualidad.
La falta de marcadores predictivos y tratamientos específicos es

consecuencia de lagunas en la comprensión de los mecanismos
subyacentes de la enfermedad grave del dengue.
Introducción
Revisar la comprensión actual de los eventos que

conducen a la inducción de las respuestas inmunes
innatas y adaptativas en el dengue y las
consecuencias de estas respuestas en el desarrollo
de manifestaciones graves del dengue.
Manifestaciones clínicas del dengue
V1
DE
NV
N
DE
Homogeneidad en
2
Proteína de envoltura E: su secuencia NS2A, NS2B, NS4B y NS5
DEN
importante en la unión viral y genética de 65 – 85 % interfieren con la señalización
3
NV
V4
entrada en las células. del interferón tipo I.
DE
NS5 y NS4B inducen la
producción de quimiocinas y
mediadores proinflamatorios.
DENV infecta una variedad de tipos de Lectinas de tipo C, incluidas DC-SIGN (CD209) y CLEC5A, expresadas en
células in vitro, incluidas células células dendríticas y macrófagos son receptores celulares de DENV.
epiteliales, células endoteliales,
hepatocitos, células musculares, células La unión de DENV a CLEC5A también induce la producción de citocinas
dendríticas, monocitos y mastocitos. proinflamatorias.
Manifestaciones clínicas del dengue
Solo el 2-3% de las infecciones

secundarias por DENV desencadenan
dengue hemorrágico (aumento de 15 a
80 veces en el riesgo de dengue
hemorrágico en comparación con las
infecciones primarias por DENV).
Relevancia y limitaciones de los estudios de patogénesis
del dengue
Los macrófagos y las células endoteliales produjeron IL-8,

un efecto mediado por las proteínas DENV NS5 y NS4B.
Las células endoteliales también secretaron IL-6, CXCL10,

CXCL11 y RANTES.
Las células dendríticas infectadas con DENV produjeron MMP -2 y MMP-9, que mejoran la permeabilidad de las
monocapas endoteliales regulando negativamente la expresión de VE-Cadherina.
Los primates no humanos infectados con DENV desarrollan viremia. Sin embargo, los niveles de viremia son bajos en
relación con los humanos, y estos animales no suelen desarrollar una enfermedad clínica.
Diferentes biomarcadores exhiben una cinética distinta durante la progresión de la enfermedad, por lo tanto, el
momento de la recolección de la muestra es integral para interpretar y comparar los hallazgos de diferentes estudios.
Introducción
 Cada año se producen entre 50 y 400 millones de infecciones.
 La infección causa una infección viral sistémica y las complicaciones asociadas con el papel patogénico de las
células endoteliales.
 Las citoquinas aumentan la permeabilidad vascular y la hemorragia durante la infección por dengue.
 El endotelio juega un papel fundamental en la fisiopatología de la infección por dengue.
 Estos factores incluyen daño hipóxico causado por disminución de la perfusión, daño directo por el virus y
daño mediado por el sistema inmunológico desregulado en respuesta al virus del dengue.
Objetivo
Investigar la expresión de citocinas durante la infección por dengue con
hemorragia y hepatitis y evaluar el grado de viremia con pérdida de plasma.
Características de la población
Parámetros de laboratorio
Fiebre Fiebre dengue
dengue hemorrágico
La interleucina-4
Es una glucoproteína del grupo de las citocinas, que pesa unos 20 kDa y producida por las células T de tipo 2
(Th2), basófilos, mastocitos y eosinófilos activados.
Actúa como antiinflamatorio al bloquear la síntesis de IL-1, TNF-alfa, IL-6 y la proteína inflamatoria del macrófago.
Entre otras funciones, promueve la diferenciación de linfocitos Th2, la proliferación y diferenciación de linfocitos B y es un potente
inhibidor de la apoptosis.
La IL-4 desempeña un papel importante en el desarrollo de enfermedades atópicas como el asma, la dermatitis atópica o
la anafilaxis sistémica.
La IL-6
Glucoproteína secretada por los macrófagos, células T, célula endoteliales y fibroblastos.
Su liberación está inducida por la IL-1 y se incrementa en respuesta a TNFα.
La interleucina-8
De la familia de las quimiocinas, de naturaleza proinflamatoria.
Su síntesis se realiza en fibroblastos, célula endotelial (se almacena en los cuerpos de Weibel-Palade), monocitos y macrófagos y
la célula dendrítica.
Es un potente factor quimiotáctico de neutrófilos, regula la producción de moléculas de adhesión, la formación de lípidos bioactivos,
amplifica la inflamación local, y estimula la angiogénesis.
La interleucina-10 (IL-10 o IL10), es una citocina con propiedades antiinflamatorias capaz de inhibir la síntesis de citocinas

proinflamatorias por los linfocitos T y los macrófagos.
El factor de necrosis tumoral (TNF, abreviatura del inglés tumor necrosis factor) es una proteína del grupo de las citocinas liberadas
por las células del sistema inmunitario que interviene en la inflamación, la apoptosis.
Su estimulación está relacionada con otros mediadores celulares como la interleucina 1 y endotoxinas bacterianas. El TNF ejerce
distintas funciones en diferentes órganos, como la activación de la producción de otros mediadores como las interleucinas 1 a la 6.
En el hígado estimula la reacción inflamatoria aguda, activando la síntesis de proteína C reactiva y otros mediadores celulares.
La liberación de TNF-α produce activación local del endotelio vascular, liberación de óxido nítrico con vasodilatación y aumento de la
permeabilidad vascular, que conduce al reclutamiento de las células inflamatorias, inmunoglobulinas y complemento, provocando la
activación de los linfocitos T y B.
Las funciones del TNF se deben a su unión a 2 receptores celulares diferentes, TNFR1 y TNFR2, 2que se localizan en diferentes células
como neutrófilos, células endoteliales y fibroblastos.
Es posible la inhibición de TNFα o de su receptor celular con anticuerpos monoclonales tales

como infliximab (Remicade®), etanercept (Enbrel®), o adalimumab (Humira®).
El interferón γ (IFN-γ, interferón de tipo II)
citocina producida por linfocitos T CD4+ y linfocitos natural killer (NK) cuya función más importante es la activación de los macrófagos, con
aumento en la capacidad fagocitaria de estos, tanto en las respuestas inmunitaria innatas como las respuestas celulares adaptativas.
El interferón-γ tiene un importante papel en la inmunidad innata. Por lo tanto, ayuda a luchar contra algunas bacterias y, además, inhibe la replicación
de virus. Esta citoquina estimula y modula el sistema inmune.
Otra de sus funciones es dirigir la diferenciación de linfocitos T CD4+ en linfocitos Th1, lo que ocurre en respuesta a los microbios, activando también a
células dendríticas, macrófagos y linfocitos natural killer para inducir mayor secreción de IL-12, la cual promueve más diferenciación a Th1, amplificando
fuertemente la reacción.
Control positivo
Las células presentadoras de antígeno liberan un grupo de citoquinas que controlan la producción de IFN-γ. Las citoquinas que regulan un control positivo
sobre la producción de este homodímero son IL-12 y IL-18. Estas ayudan a que haya una conexión entre la inmunidad innata y la infección. Una vez el
macrófago reconoce el patógeno, este causa la secreción de IL-12 y otras quimioquinas. Estas quimioquinas atraen a las células NK hacia la inflamación y IL-
12 causa la síntesis del interferón-γ en estas células. A parte de los macrófagos y las células NK, la producción de este tipo de interferón por las células T es
controlada por estas dos interleuquinas.
Control negativo
Los glucocorticoides, el factor de crecimiento B, IL-4 y IL-10 son reguladores negativos para la producción de INF-γ.
Expresión de citocinas durante las Carga viral durante la fase aguda en el
tres fases de la enfermedad dengue y dengue hemorrágico
Durante los cinco Temperatura 2 semanas

primeros días de igual o inferior posteriores
fiebre. a 37,7 oC al alta
Perfil de citocinas durante las tres fases de la infección en
fiebre dengue y dengue hemorrágico
fiebre dengue y dengue hemorrágico
Perfil de citoquinas en sangrado en las tres fases de la
infección
Perfil de citoquinas en sangrado en las tres fases de la
infección
Perfil de citocina en sangrado en las tres fases de la infección
en dengue hemorrágico
en dengue hemorrágico
en fiebre dengue
en fiebre dengue
hepatitis grave
hepatitis grave
Discusión
Hasta donde sabemos, pocos estudios han realizado análisis de citocinas durante las tres fases de la infección. En particular, diseñamos nuestro estudio
para medir los niveles de citocinas en defervescencia e identificamos niveles elevados de citocinas con complicaciones.
En las infecciones virales, las citocinas pueden interferir con la vía de señalización del interferón, que es la principal respuesta antiviral del huésped a una
infección aguda.
Los sujetos de nuestro estudio tuvieron una respuesta de IFNγ disminuida, que podría haber resultado de una infección secundaria por dengue, donde la
respuesta Th1 es prominente en la infección primaria.
La respuesta de citocinas que refleja una respuesta T-helper 2 fue apoyada por nuestros niveles indetectables de IL-2 secretada, además de los niveles muy
bajos de IFNγ, con una mayor expresión de IL-10. Esta tendencia de expresión de citocinas también sugiere efectos inmunorreguladores compatibles con
la infección secundaria.
Las células B de memoria están preparadas para producir anticuerpos mediante la expresión de IL-10, y con sus propiedades proteolíticas, IL-10 inhibió
la expresión de IFNγ y desreguló las expresiones de IL-6, IL-8 y TNFα en los sujetos de nuestro estudio y como se describió previamente.
Demostramos la activación endotelial mediante la detección de IL-6, IL-8 y TNFα como se describió anteriormente.
Esta activación del sistema endotelial no solo contribuye al sangrado, que es común en el dengue y dengue hemorrágico, sino que también está
involucrado en el daño hepático, lo que lleva a la hepatitis que complica el dengue.
Conclusión
En este estudio, se demostró una mayor viremia en el dengue hemorrágico con una respuesta T-helper 2 determinada
mediante el perfil de la expresión de citocinas. La expresión de IL-8 se elevó significativamente durante la fase
aguda en pacientes con hemorragia tanto en DF como en DH, con un aumento adicional de los niveles de IL-8 en
DHF en la defervescencia.
IL-6 actúa en sinergia con IL-8 para el sangrado con pérdida de plasma durante la fase aguda.
Significativamente, se observaron niveles más altos de TNFα, IL-6 e IL-8 en casos de hepatitis grave.
Correlación de las citocinas inflamatorias del huésped y los metabolitos relacionados con el sistema
inmunitario, pero no la proteína NS1 viral, con la gravedad de la infección por el virus del dengue
August 7, 2020
PROF. DR. SHAMALA DEVI A / P KC SEKARAN

Departamento de Microbiología Médica
Facultad de Medicina
Universidad de Malaya
shamala@um.edu.my
Introducción
Virus de ARN monocatenario de

sentido positivo (familia
Flaviviridae).
Cuatro serotipos (DENV1–4),

comparten un 65–80% de
homogeneidad en su secuencia
genética.
Codifica una poliproteína que se

transcribe en 3 proteínas
estructurales E, M y C y siete
proteínas no estructurales NS1,
NS2 a/b, NS3, NS4 a/b, NS5
Evolución temporal de la infección aguda y las respuestas inmunitarias durante la infección sintomática por el virus del
dengue.
Introducción
Wan, S. W., Wu-Hsieh, B. A., Lin, Y. S., Chen, W. Y., Huang, Y., & Anderson, R. (2018). The monocyte-macrophage-mast cell axis in dengue pathogenesis. Journal of biomedical science, 25(1), 1-10.
John, A. L. S., & Rathore, A. P. (2019). Adaptive immune responses to primary and secondary dengue virus infections. Nature Reviews Immunology, 19(4), 218-230.
Objetivo
Investigar el papel de la proteína no estructural

1 (NS1) del dengue y los factores del huésped
que contribuyen al dengue grave
Tres líneas celulares endoteliales

10 donantes sanos microvasculares humanas 10 muestras para cada categoría
30 pacientes con dengue
5 muestras al azar para cada de dengue.
-10 dengue sin signos de alarma HDMEC categoría de dengue de un panel
-10 dengue con signos de alarma (Sciencell, Carlsbad, CA, EE. UU.)
de muestras positivas para NS1 e 10 muestras de individuos sanos.
-10 dengue grave
IgM
HPMEC
RT-PCR (Sciencell)
Dengue NS1 ELISA Panbio
Dengue IgM ELISA BIOLINA HRtMEC
Prueba de inhibición de (CSC, Tysons, VA, EE. UU.)
Hemaglutinación. Espectroscopia de Perfiles de citocinas y
Impedancia Eléctrica Metabolómica no dirigida
Cultivo celular Celular
Muestras
Características de las muestras

Datos clínicos y resultados de diagnóstico de muestras
seleccionadas para la ECIS
Donantes sanos:
 Negativos para DENV PCR, NS1, IgM.
 Contenían una baja concentración de anticuerpos
neutralizantes (<10, 10, 20).
 Once muestras tienen un título de HI bajo <10, 10, 20 y 80.

 Cuatro muestras tienen un nivel alto de anticuerpos
neutralizantes con un título de HI de 640 y 2560.
Cultivo celular y espectroscopía de impedancia eléctrica en cultivos celulares.

Cultivo celular
37ºC con 5% de CO 2 y medio ECM para células
dérmicas y pulmonares y CSC para células de la retina.
HDMEC HPMEC HRtMEC
(Troy, NY, EE. UU.)

El antígeno NS1 (Bio-rad) utilizado es una proteína NS1 del serotipo
1 del virus del dengue, con una pureza de> 95% mediante diluido en
solución salina tamponada con fosfato ( Dulbecco)
 Los cambios en tiempo real en la impedancia (resistencia y capacitancia)
 Las células se trataron con antígenos NS1 en las tres inducidos en los MEC después del tratamiento se detectaron utilizando
concentraciones seleccionadas. múltiples frecuencias de corriente alternativa (CA) en una estación de
 Cinco muestras de suero que tenían niveles variables de antígeno matriz de 16 pocillos ECIS durante 72 horas.
NS1 de cada categoría (DWOWS, DWWS, SD).
 Cinco individuos sanos (HC).  Los datos brutos se normalizaron primero a pocillos sin células para eliminar
las señales de fondo, seguido de la normalización a 0 horas después de la
infección (horas post infección) en las células no tratadas.
NS1 modula la función de barrera de MEC de una manera dependiente de la dosis
Los cambios en la impedancia de los MEC tratados con tres niveles de NS1 se midieron utilizando el sistema ECIS durante 72 horas post infección.
Cambios de impedancia normalizados en tiempo real en MEC dérmicos
Cambios de impedancia normalizados en tiempo real en MEC pulmonares
Cambios de impedancia normalizados en tiempo real en MEC de la retina
 NS1 solo puede inducir la pérdida de la función de barrera en el endotelio microvascular de una manera
dependiente de la dosis. Según la medición de ECIS, la magnitud de la fuga vascular observada se correlacionó
positivamente con la concentración de proteína NS1, especialmente pronunciada en MEC pulmonares.
 Sin embargo, el nivel sérico de NS1 en pacientes con dengue no se correlacionó directamente con la extensión de
la fuga vascular observada en los MEC, lo que indica que podría haber otros factores que eclipsan el efecto directo
de la NS1 circulante hacia el endotelio, pero que aún conducen a la fuga vascular observada en los pacientes. con
SD.
Características de las muestras
Muestras de suero seleccionadas para el perfil de

citocinas y metabolómica
Perfiles de citocinas
Citocinas, quimiocinas, moléculas de adhesión y factores de crecimiento estudiados en las 40 muestras de suero seleccionadas:
CCL2, CCL5, CCL20, CD25, CXCL1, CXCL6, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-18, TNF-a, VEGF-A, HMGB-1 y ICAM-1.
Se ha demostrado que estas 14 citocinas tienen un papel durante la infección por el virus del dengue en términos de activación inmune endotelial.
Se ha informado que son producidas directamente por células endoteliales microvasculares infectadas con DENV.
Ensayo de cribado multiplex

Human Magnetic Luminex:
Basado en el análisis de
citometría de flujo de
microperlas recubiertas de
anticuerpos magnéticos
dirigidas a los analitos de
interés (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.).
 Las diferencias significativas del perfil de expresión de citocinas entre las categorías se determinaron mediante
la prueba T de Student.
Comparación de niveles séricos de citocinas, quimiocinas, moléculas de adhesión y factores de crecimiento en
pacientes con HC y dengue, así como pacientes en las categorías de DWOWS, DWWS y SD.
Comparación de los niveles séricos de HMGB-1 e ICAM-1 en pacientes con HC y dengue que se clasificaron
además en DWOWS, DWWS y SD según la gravedad de la enfermedad.
HMGB-1 e ICAM-1 estaban correlacionadas con la gravedad de la enfermedad, donde la expresión fue significativamente mayor
en pacientes con SD.
HMGB-1 (cuadro de grupo de alta movilidad 1) es una proteína de unión al ADN que regula la inmunidad innata y parcialmente
la inmunidad adaptativa. Esta proteína puede liberarse al entorno extracelular de forma pasiva tras la apoptosis o necrosis de
las células o de forma activa mediante macrófagos y monocitos activados, que luego funciona como una citocina
proinflamatoria en el ciclo de retroalimentación positiva de la respuesta inflamatoria para estimular las células endoteliales
para la producción de citocinas y quimiocinas.
También se ha demostrado que HMGB-1 induce la producción de ICAM-1 en células endoteliales, que también se expresó
significativamente más alto en pacientes con SD en nuestro estudio.
ICAM-1, una molécula de adhesión intercelular, juega un papel importante en la transmigración de leucocitos en los sitios de
células endoteliales activadas y en la formación de sinapsis inmunológica durante las respuestas inmunes celulares.
Metabolómica no dirigida
3 volúmenes de mezcla fría 2 4
(-20 ° C) de metanol y 5 6
etanol (relación de
volumen de 1: 1) a 1
volumen de suero
Se eliminó el
sedimento y se filtró el Se aplicaron 10 μl de
sobrenadante a través muestra a una columna de
centrifugación a de un filtro de nailon de fase inversa.
3 16.000 xg 4 ° C durante 0,22 µm y se sometió a (Agilent 959764–902, Eclipse Plus
C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 um, 600 bar)
se almacenaron a -20 ° C 10 minutos un procedimiento LCMS.
(Agilent Technologies, Santa Clara,
1 durante 5 minutos CA, EE. UU.)
Sistema QTOF-LCMS
software de extracción de funciones de procesamiento por lotes no dirigido, MassHunter Profinder (Agilent
(Agilent 6550 iFunnel)
Se calculó el cambio de doblez de la expresión metabólica en los grupos de dengue (DWOWS, DWWS y SD)
Disolventes utilizados:
• Disolvente A, agua con ácido frente a HC y se realizó un análisis estadístico utilizando el ANOVA multivariante de Welch de una vía con la
fórmico al 0,1% tasa de falso descubrimiento de Benjamini Hochberg para la comparación de múltiples grupos.
• Disolvente B, acetonitrilo
con ácido fórmico al 0,1%. El análisis de enriquecimiento de la vía también se completó en base a la base de datos BioCyc [41 ] y la base
de datos del metaboloma humano [ 42 ] para identificar las vías metabólicas implicadas en la progresión de la
infección por el virus del dengue.
Expresión metabólica en pacientes con dengue
Porcentaje de pacientes que expresan L-isoneucina y L-fenilalanina
Porcentaje de pacientes que expresan 2-amino-3-metil-1-butanol y C16 esfinganina
Porcentaje de pacientes que expresan Ácido indoleacrilico y Ácido neoabietico
Porcentaje de pacientes que expresan Etn-1-P-cer y amida palmítica
Porcentaje de pacientes que expresan ácido glicolólico y ácido glico-ursodeoxycólico
Conclusiones
La proteína NS1 induce la pérdida de la función de barrera del endotelio microvascular dependiente de la dosis.

El nivel de NS1 no se correlacionó con la extensión de la fuga vascular observada en el endotelio
microvascular tratado con muestras de suero de pacientes con infección por el virus del dengue.
La mayoría de las citocinas que se expresaron altamente en pacientes con dengue, están involucradas en la
infiltración de leucocitos.
ICAM-1 se detectó significativamente más alto en pacientes con SD - puede conducir a la interrupción de
las uniones inter-endoteliales.
Conclusiones
Se detectó alteración del metabolismo de los lípidos en pacientes con dengue (DWWS y SD): Esto podría estar asociado con el
metabolismo de los fosfolípidos, que puede afectar la permeabilidad de la membrana de las células, incluido el endotelio microvascular.
Se destaca la complejidad del dengue, ya que ningún factor por sí solo, ya sea viral o del huésped, es responsable de la progresión del
dengue grave, ni puede utilizarse como marcador pronóstico de la gravedad de la enfermedad.
La identificación de metabolitos alterados podría facilitar el diagnóstico del dengue o utilizarse como un objetivo potencial para nuevas
opciones terapéuticas. que puede afectar la permeabilidad de la membrana de las células, incluido el endotelio microvascular.
17-06-2020
Joel Rovnak
Microbiólogo, dedicado a investigar la

caracterización de los mecanismos
moleculares de la oncogénesis viral.
Introducción
Resumen
• La infección por el virus del dengue se asocia con la regulación positiva de las vías metabólicas dentro de las células infectadas. Este efecto es
común a la infección por una amplia gama de virus. Estos cambios metabólicos, incluido el aumento del metabolismo de la glucosa, la
fosforilación oxidativa y la autofagia, respaldan las demandas de la replicación del genoma viral y la formación de partículas infecciosas.
• Se sabe que los mecanismos por los cuales ocurren estos cambios son, en parte, dirigidos por proteínas virales no estructurales que contactan y
controlan las estructuras celulares y las enzimas metabólicas. Investigamos las funciones de las proteínas del huésped con el control general de
los procesos metabólicos, los reguladores de la transcripción, la quinasa 8 dependiente de ciclina (CDK8) y su parálogo, CDK19, como mediadores
de los cambios metabólicos inducidos por virus. Aquí, mostramos esa expresión de CDK8, pero no CDK19, aumenta durante la infección por el
virus del dengue en células de carcinoma hepatocelular humano Huh7, aunque ambos son necesarios para una replicación viral eficaz. La
inhibición química de CDK8 y CDK19 con Senexina A durante la infección bloquea la expresión inducida por virus de genes metabólicos y
autofágicos seleccionados, hexoquinasa 2 (HK2) y proteína 1 de cadena ligera 3 asociada a microtúbulos (LC3), y reduce la replicación del
genoma viral y la producción de partículas infecciosas .
• Los resultados definen además la dependencia de la replicación del virus en el aumento de la capacidad metabólica en las células diana e
identifican a CDK8 y CDK19 como reguladores maestros de genes metabólicos clave. La inhibición común de CDK8 y CDK19 ofrece una
intervención terapéutica dirigida al huésped que es poco probable que se supere mediante la evolución viral.
• Palabras clave: virus del dengue, CDK8, CDK19, hexoquinasa, LC3, Senexina, replicación viral, transcripción.
Introducción
• Según la Organización Mundial de la Salud, el virus del dengue (DENV) es endémico en más de 100 países en las regiones tropicales y subtropicales de
todo el mundo. Calculan que 500.000 personas con dengue grave requieren hospitalización cada año, con una tasa de mortalidad estimada del 2,5% [
1 ]. La Organización Panamericana de la Salud notificó 2.733.635 casos en 2019 en América Central y del Sur, el número más alto de casos jamás
registrado en las Américas; 22,127 de estos fueron clasificados como dengue severo y 1206 personas murieron [ 2 ].
• Los virus dependen de la célula huésped para proporcionar energía y precursores metabólicos para apoyar la replicación del genoma y la producción
de partículas infecciosas. La replicación viral aumenta la demanda de producción de ATP y metabolitos en la célula huésped [ 3 , 4 , 5 ]. Para satisfacer
estas demandas, los virus manipulan el entorno intracelular de la célula huésped remodelando las estructuras celulares y reprogramando el
metabolismo celular para aumentar la expresión de enzimas metabólicas clave [ 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 ].
• Las infecciones por el virus del dengue son las enfermedades transmitidas por mosquitos más comunes en todo el mundo y representan un riesgo
significativo para aproximadamente la mitad de la población mundial [ 15 , 16 ]. Hay cuatro serotipos distintos, dengue 1, 2, 3 y 4 (DENV1–4), cada
uno de los cuales causa una enfermedad aguda similar caracterizada por fiebre y dolor articular intenso. Las infecciones secuenciales con diferentes
serotipos de DENV se asocian con el dengue hemorrágico (DH) y el síndrome de choque por dengue (DSS), que son potencialmente mortales en el
15% de los pacientes [ 17 , 18 ]. De los cuatro serotipos, se ha demostrado que DENV2 se basa en una mayor captación de glucosa y un mayor
metabolismo de la glucosa para proporcionar los intermediarios metabólicos necesarios para la replicación viral [ 7 , 8 ,19 ]. La infección por DENV2
también induce autofagia y lipofagia para una replicación eficaz [ 11 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 ]. La lipofagia libera ácidos grasos de las gotitas de lípidos
que se transportan a las mitocondrias para la oxidación β y la producción de ATP [ 11 , 22 , 24 ]. Un trabajo reciente ha identificado interacciones entre
proteínas virales no estructurales y enzimas metabólicas del huésped para modificar estos procesos [ 10 , 19 , 25]. Más allá de las interacciones
proteína-proteína, también se ha demostrado que la expresión de ARNm que codifican enzimas metabólicas específicas se eleva durante la infección
por DENV2, y esto aumenta la capacidad metabólica total de las células infectadas [ 8 , 9 ]. Buscamos identificar los factores del huésped que regulan
estos cambios transcripcionales en la expresión de enzimas metabólicas durante la infección por DENV2.
Introducción
• La quinasa 8 dependiente de ciclina (CDK8) es un componente del factor de transcripción general, Mediator, un gran complejo
proteico necesario para la transactivación de toda la transcripción de la ARN polimerasa II (ARN Pol II). CDK8 regula el alargamiento
transcripcional por fosforilación del dominio C-terminal de la subunidad más grande de ARN Pol II, una variedad de factores de
transcripción y serina 10 en la histona H3 (H3S10) [ 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ]. CDK8 regula la expresión génica preferentemente
durante estados inducidos como hipoxia y falta de suero [ 27 , 28 , 31 , 32] y recientemente se ha implicado en la transcripción de
genes glicolíticos y autofágicos [ 33 , 34 ].
• Anteriormente hemos demostrado que CDK8 es el objetivo directo y muy específico del retrovirus oncogénico, el virus del sarcoma
dérmico de leucomas [ 31 , 32 , 35 , 36].], y razonó que es probable que CDK8 sea el objetivo, directa o indirectamente, de muchos
virus con demandas metabólicas y autofágicas, como lo ejemplifica la infección por DENV2. Encontramos que la expresión de CDK8
se regula al alza durante la infección por DENV2 de células de carcinoma hepatocelular humano Huh7, y que esto precede al
aumento de la expresión de dos genes clave, la hexoquinasa 2 (HK2) y la proteína 1 de cadena ligera 3 asociada a microtúbulos
(LC3). La eliminación de la expresión de CDK8, el parálogo de CDK8, CDK19, o su activador, Ciclina C, redujo la replicación del
genoma viral. CDK8 y CDK19 comparten sitios activos idénticos, lo que permite su inhibición específica con inhibidores
competitivos de moléculas pequeñas. Usamos el inhibidor del sitio activo, Senexin A y su iteración de segunda generación, Senexin
B [ 37 , 38]. Estos compuestos redujeron la inducción de DENV2 de la expresión de HK2 y LC3, la replicación del ARN viral y la
producción de partículas infecciosas. La inhibición de la actividad quinasa CDK8 / CDK19 también redujo la función mitocondrial en
células infectadas y no infectadas. Los resultados identifican la dependencia de DENV2 de la función de CDK8 para regular la
expresión génica del huésped, un mecanismo del huésped que puede ser objeto de interdicción terapéutica.
• 2. Materiales y métodos
• 2.1. Cultivo celular e infección por DENV2
• Las células Huh7, una línea celular de carcinoma hepatocelular derivada de un tumor hepático en un varón japonés de 57
años en 1982 ( https://huh7.com ), fueron proporcionadas por la Dra. Rushika Perera y cultivadas en medio Eagle
modificado de Dulbecco (DMEM ), suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de aminoácidos no esenciales,
1% de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina y HEPES 25 mM. A las 24 h antes de la infección, 1 × 10 6 Se sembraron
células Huh7 en 25 cm 2 frascos. Inmediatamente antes de la infección, las células se incubaron a 4 ° C durante 15 min, se
lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco fría (D-PBS) y se incubaron con DENV2 (cepa 16681, paso 4)
[ 39 ] a 4 ° C durante 1 h con balanceo. Los medios de virus se eliminaron y se reemplazaron con DMEM suplementado con
FBS al 2%.
• 2.2. Ensayo de viabilidad celular e inhibición de moléculas pequeñas CDK8 / 19
• Se incubaron células infectadas con Mock o DENV2 en DMEM con Senexin A (MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ,
EE. UU.) O Senexin B (ProbeChem, Shanghai, China) a las concentraciones indicadas o en medio con el equivalente
volumétrico (0,01% final) de DMSO. disolvente durante el período de tiempo indicado. La viabilidad celular con tratamiento
con Senexina o transducción de ARNhc se determinó mediante ensayo MTS modificado de acuerdo con las instrucciones
del fabricante (Ensayo de proliferación celular CellTiter 96 Aqueous One Solution, Promega, Madison, WI, EE. UU.).
2.3. Análisis qRT-PCR
En los tiempos indicados después de la infección o el tratamiento, las células se recolectaron en TRIzol (Invitrogen, Thermofisher, Waltham, MA, EE. UU.), Y el
ARN total se aisló de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se trató con Turbo DNase I (Ambion-Life Technologies, Thermofisher, Waltham, MA,
Estados Unidos). El ADNc se sintetizó con un kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante,
y luego, se sometió a análisis de qPCR con iQ SYBR green Supermix en un sistema de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad , H ércules, CA, EE. UU.). Las
secuencias de cebadores se enumeran entabla 1. La expresión relativa se normalizó con respecto al gen de mantenimiento, la subunidad A de flavoproteína
del complejo succinato deshidrogenasa, SDHA [ 40 ]. Para el análisis de equivalente genómico, los valores de Cq se estandarizaron a diluciones de diez veces
el ARN genómico de DENV2 transcrito in vitro y se sometieron a qRT-PCR.
tabla 1
Cebadores de PCR.
•
2.4. Unidad formadora de placa y análisis equivalente del genoma extracelular
• Se recogieron los medios de las células infectadas con virus en los momentos indicados, se centrifugaron a 500 xg durante 15 min para eliminar los restos celulares y se dividieron en
alícuotas en TRIzol LS (Invitrogen, Thermofisher, Waltham, MA, EE. El ARN se extrajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el ADNc se sintetizó con un kit de síntesis de ADNc
iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) Y se sometió a análisis de qPCR con iQ SYBR green Supermix en un sistema de PCR en tiempo real CFX96 (Bio -Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Los valores
de Cq se compararon con diluciones de diez veces de genómico DENV2 transcrito in vitro, como se describió anteriormente.
• Los ensayos de placa se realizaron en células BHK. Brevemente, se adsorbieron diluciones de 10 veces de sobrenadante clarificado en células BHK confluentes durante 1 h. A continuación,
las células se superpusieron con 3 ml de agarosa al 1% en MEM suplementado con FBS al 5%. Después de la incubación durante 8 días, se añadió una solución de rojo neutro al 4% en PBS a
la capa de agar y se contaron las placas a las 18-24 h después de la tinción.
• 2.5. Eliminación del gen shRNA mediada por lentivirus
• Entrega por lentivirus de ARN en horquilla cortos (shRNA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.; Listado en Tabla 2) se utilizó para anular la expresión de CDK8, CDK19 y Ciclina C. Se utilizó
un ARNhc no diana como control. Se transfectaron células 293FT (Thermofisher, Waltham, MA, EE.UU.) con construcciones de empaquetamiento de ARNhc y lentivirus, y se recogieron las
partículas de virus después de 48 h. Las células Huh7 se transdujeron con lentivirus de ARNhc a una MOI de 1 y se incubaron durante 48 h antes de la selección con 1 µg / ml de puromicina
durante cuatro días. Se recogieron las células seleccionadas para el ensayo de proteína o se volvieron a sembrar en 1 x 10 6 células por 25 cm 2 matraz para la infección DENV2 (MOI = 1)
durante 24 h.
2.6. Extractos subcelulares y análisis de proteínas
Los extractos nucleares se prepararon como se describió anteriormente [ 35 ]. Brevemente, las células se lisaron en NP-40 al 0,5% en PBS con inhibidores de
proteasa y fosfatasa (2 µg / mL de leupeptina y aprotinina, 1 µg / mL de pepstatina, 0,2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF], 0,2 mM de ortovanadato
de sodio, 2 mM de pirofosfato de sodio y glicerofosfato 1 mM). Los núcleos se sedimentaron a 1500 × g , se lavaron con PBS frío y luego, con tampón A
(HEPES 10 mM pH 8,0, KCl 10 mM, MgCl 2 1,5 mM, Ditiotreitol (DTT) 0,5 mM), antes de la extracción durante la noche con tampón de volumen de sedimento
nuclear 2,5 C (HEPES 10 mM pH 8,0, KCl 420 mM, glicerol al 20%, EDTA 0,1 mM, DTT 0,5 mM e inhibidores de proteasa y fosfatasa) . Los núcleos extraídos
se sedimentaron durante 15 min a 21.000 gy se volvieron a extraer con 1 tampón de volumen de sedimento C. Los extractos se combinaron para el
análisis. Las proteínas restantes unidas a la cromatina se prepararon a partir de sedimentos nucleares extra ídos después de un lavado adicional con tampón
C y equilibrio en tampón de digestión de ADNasa (Tris HCl 100 mM, pH 7,5, MgCl 2 25 mM y CaCl 2 5 mM ) antes de la adición de tampón de digestión. con 1
Unidad de ADNasa I / µL y rotación a 4 ° C durante 72–96 h. Las preparaciones de cromatina digeridas se aclararon a 21.000 g durante 15 min.
Los extractos mitocondriales se prepararon como se describió anteriormente [ 46 ]. Brevemente, las células se hincharon en tampón hipotónico frío (NaCl 10
mM, MgCl2 1,5 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5) y se rompieron en un homogeneizador Dounce. Los lisados se llevaron a manitol 210 mM, sacarosa 70 mM, Tris-
HCl 5 mM (pH 7,5) y EDTA 1 mM con tampón de homogeneización 2,5X. Los núcleos se retiraron por centrifugación a 1300 × g durante 5 min, y luego, las
mitocondrias se sedimentaron a 15.000 g durante 15 min, se lavaron una vez en tampón de homogeneización y se suspendieron en tampón de
inmunoprecipitación (IP) (1% Triton X-100, 0.5% NP -40, NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM (pH 8,0), EGTA 1 mM e inhibidores de proteasa
y fosfatasa).
La concentración de proteína de cada extracto se determinó con un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermofisher, Waltham, MA, EE.UU.) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. Se separaron cantidades iguales de proteína total mediante electroforesis en gel de poliacrilamida para transferencia
Western. Los segmentos de transferencia bloqueados, separados por rango de peso molecular, se sondaron simult áneamente con los anticuerpos primarios
indicados (Tabla 3 y Cuadro 4; GeneTex, Irvine, CA, EE.UU .; Novus Biologicals, Littleton, CO, EE.UU .; Tecnología de señalización celular, Danvers, MA, EE.
UU.; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU .; Sondas moleculares, Thermofisher, Waltham, MA, EE.UU .; Proteintech, Rosemont, IL, EE. UU.)
Durante la noche. Los anticuerpos se detectaron con anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de r ábano picante y se desarrollaron
con el sistema de sustrato de peroxidasa de membrana TMB (3,3 ', 5,5'-tetrametilbencidina, Seracare Life Sciences, Milford, MA, EE. UU.). Las imágenes se
escanearon con un escáner Visioneer One Touch 9420 (Visioneer, Pleasanton, CA, EE. UU.) A un valor de gamma de 1.0, y todos los ajustes de contraste se
aplicaron uniformemente usando Adobe Photoshop (Adobe, Inc., San José, CA, EE. UU.). Las imágenes de alto contraste se midieron utilizando el software
de análisis de gel NIH ImageJ (Versión 1.53b, National Institutes of Health, Bethesda, MD,
Tabla 3
Anticuerpos de proteínas celulares.
• 2.7. Pruebas de esfuerzo mitocondrial y glicolítico

• Se utilizó un analizador Seahorse XFe (Agilent Technologies) para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR)
según la prueba de estrés mitocondrial (Agilent 103015-100) y la prueba de estrés de glucólisis (Agilent 103020-100), respectivamente. . Células Huh7 se
sembraron en microplacas de XF96 de cultivo de células a 2 x 10 4 células por pocillo 16 h antes de la infección con DENV2 a una MOI de 10. En 24 o 48 hpi, los
medios de cultivo se reemplazan con 180 l de XF medio de base (Agilent Technologies) suplementado con piruvato 1 mM, L-glutamina 2 mM y con glucosa 10
mM para la prueba de estrés mitocondrial o sin glucosa para la prueba de estrés de glucólisis. Las células se dejaron reposar durante una hora en un ambiente
sin CO2 .incubadora a 37 ° C, luego se coloca en el Seahorse para su análisis. La prueba de estrés mitocondrial utilizó inyecciones secuenciales de oligomicina
(1 µM), p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP, 1,5 µM) y rotenona y antimicina A (0,5 µM cada una). La prueba de esfuerzo de glucólisis utilizó inyecciones
secuenciales de glucosa (10 mM), oligomicina (1 µM) y 2-desoxiglucosa (50 mM). Las mediciones se recogieron a intervalos de 5 minutos; tres veces antes y
después de las inyecciones y seis veces después de la última inyección. Después del análisis, se midió el número de células mediante la adición de 22 µL de
Calceína-AM 10 nM a todos los pocillos y se leyó la absorción a 520 nm después de la excitación a 488 nm en un lector de placas SpectraMax M2 e (Molecular
Devices). Las lecturas de calceína se importaron al software Wave (Agilent) para normalizar las lecturas de OCR y ECAR.
• La actividad mitocondrial se determinó de la siguiente manera: (1) La respiración basal se calculó utilizando la última medición de frecuencia antes de la
inyección de oligomicina menos la frecuencia de respiración no mitocondrial (definida como la medición de frecuencia mínima después de la inyección de
rotenona / antimicina A), (2) Producción de ATP se calculó como la última medición de frecuencia antes de la inyección de oligomicina menos la medición de
frecuencia mínima después de la inyección de oligomicina, (3) La respiración máxima se calculó utilizando la medición de frecuencia máxima después de la
inyección de FCCP menos la frecuencia no mitocondrial, (4) La capacidad de reserva fue la respiración máxima menos respiración basal, y (5) la fuga de
protones fue la medida de frecuencia mínima después de la inyección de oligomicina menos la respiración no mitocondrial. La función glicolítica se determinó
de la siguiente manera:
• 2.8. Estadísticas
• El análisis estadístico se realizó en el software Prism (Versión 8.1.2 (227)).
Resultados
• 3. Resultados
• 3.1. La quinasa 8 dependiente de ciclina aumenta durante la infección por DENV2
• Para investigar el papel de CDK8 durante la replicación de DENV2, cuantificamos el ARNm de CDK8 a lo largo del tiempo después de la infección
sincronizada con una alta multiplicidad de infección (MOI) para alcanzar la infección completa o casi completa de todas las células en el cultivo
y mitigar los efectos de las células transeúntes no infectadas. . Las células Huh7 se infectaron de forma simulada, se infectaron con una MOI de
10 o se trataron con una preparación combinada de partículas de DENV2 inactivadas con UV (UV-DENV2). Después de unirse a 4 ° C, las células
se lavaron y se incubaron en medio a 37 ° C. El ARN total se recogió a las 0, 3, 6, 9, 12, 24 y 48 h después de la infección (hpi) y se controló la
replicación del virus mediante qRT-PCR (Figura 1A). Observamos un modesto aumento en los niveles de ARNm de CDK8 en las células
infectadas a las 3 hpi seguido de un aumento constante después de 12 hpi, coincidiendo con la replicación máxima del virus (Figura 1A,
B). Vimos el aumento más agudo en la expresión de ARNm de CDK8 entre 24 y 48 hpi en células infectadas con DENV2 en relación con las
células infectadas de forma simulada y las células tratadas con virus inactivados por UV (Figura 1B), y posteriormente observó un aumento de
2,3 veces en los niveles de ARNm de CDK8 a 36 hpi en seis réplicas biológicas (Figura 1C; media = 2,30 +/− 0,09, p <0,0001). Un aumento de 2,3
veces en CDK8, aunque modesto, puede tener un profundo efecto de reprogramación en la célula huésped debido a la naturaleza en cascada
de la regulación transcripcional mediada por CDK8. El ARN viral de las células tratadas con UV-DENV2 fue absorbido por las células (Figura 1A),
pero no dio como resultado la replicación del ARN viral ni aumentó la expresión de CDK8 (Figura 1B), lo que demuestra que la inducción de la
expresión de CDK8 depende de la captación de DENV2 infeccioso. En contraste con el aumento en la expresión de CDK8, no encontramos
ningún cambio significativo en la expresión del ARNm de CDK19 (Figura 1D), lo que sugiere una demanda específica de aumento de CDK8
durante la infección por DENV2. CDK8 y su parálogo CDK19 están altamente conservados en sus dominios de unión a quinasa y ciclina, pero
tienen dominios C-terminales únicos, lo que sugiere funciones similares pero divergentes [ 47 , 48 ].
Resultados
• CDK8 se regula positivamente durante la infección por DENV. ( A , B ) Las células Huh7 se infectaron
simuladamente, se infectaron con DENV a MOI 10 o se trataron con DENV2 (UV-DENV) inactivado con UV
equivalente durante un transcurso de tiempo de 48 h. El ARN celular total se recogió en los puntos de tiempo
indicados después de la infección y se analizó mediante qRT-PCR para detectar ARN de DENV ( A ) y expresión
de ARNm de CDK8 ( B ), en relación con el momento de la infección y normalizado al gen de
mantenimiento, SDHA . Los resultados son representativos de dos experimentos independientes. ( C , D )
CDK8 ( C ) y CDK19 ( D) expresión de ARNm en células Huh7 simuladas o infectadas con DENV después de 36
h de infección en MOI 10 (n = 6 réplicas biológicas; **** p <0,0001, prueba t de dos colas no apareada ). Las
barras de error representan la media +/− SEM). ( E) Análisis de transferencia Western de 10 µg de proteína
total de extractos nucleares (extractos nucleares solubles) y de la fracción de cromatina extraída con sal
restante (proteínas unidas a cromatina) de células recolectadas cada tres horas durante 24 h después de la
infección. Las especificidades de los anticuerpos se indican al igual que las densidades de banda relativas de
CDK8 frente a Ciclina C e histona H3 fosforilada en la serina en la posición 10 (H3S10-P) frente a la histona H3
total (H3). La infección se confirmó por la presencia de DENV2 NS5 nuclear. Los resultados son
representativos de tres infecciones de curso temporal separadas.
Resultados
• Los niveles de proteína CDK8 también aumentaron en las células infectadas con DENV2 en comparación con el inicio de la infección (Figura 1MI). El
aumento de CDK8 fue visible en extractos nucleares a las 3 hpi, coincidiendo con la primera aparición de la proteína no estructural 5 (NS5) de DENV2 en
los núcleos de las células infectadas (Figura 1MI). Los niveles aparentes de CDK8 en la fracción nuclear soluble permanecieron elevados, en relación con la
Ciclina C, durante el curso de la infección y coincidieron con un aumento progresivo de la forma fosforilada de un sustrato CDK8 conocido, H3S10-P [ 29 ,
49 ], en relación con el total histona H3 (Figura 1MI). Además del aumento de CDK8 en la fracción nuclear soluble en sal, CDK8 en la fracción de cromatina
restante comenzó a aumentar después de 6 hpi (Figura 1E, consulte los métodos para obtener más detalles). El aumento de CDK8 unida a cromatina
también coincidió con el aumento de los niveles de NS5 en la fracción de cromatina. La partición de la proteína DENV2 NS5 entre fracciones solubles de
cromatina y nuclear se ha observado anteriormente [ 50 , 51 , 52 , 53 ]. También hubo un aumento aparente en H3S10-P, en relación con los niveles de
H3, en la fracción de cromatina (Figura 1MI). H3S10-P es una marca de cromatina abierta activa [ 29 , 49 ].
• Estos datos demuestran que los niveles de proteína y ARNm de CDK8 aumentan después de la infección por DENV2 y sugieren la fosforilación activa de
CDK8 de la histona H3 en la serina 10 en asociación con un aumento de la actividad transcripcional. La ocupación de cromatina CDK8 también aumenta
durante la infección por DENV2, un resultado asociado con una mayor expresión génica dependiente de CDK8 [ 27 , 28 , 31 , 32 ].
• 3.2. Las eliminaciones de CDK8 y CDK19 reducen la replicación de DENV2
• Para investigar los roles de CDK8 y CDK19 durante la infección por DENV2, utilizamos caídas de ARNhc mediadas por lentivirus de CDK8, CDK19 y su ciclina
activadora, Ciclina C, en células Huh7 (Figura 2A). Las células Huh7 se transdujeron con shRNA no diana (NT-shRNA) o CDK8-shRNA, se seleccionaron en
puromicina durante cuatro días y, a continuación, se infectaron de forma simulada o se infectaron con DENV2. Con el fin de evaluar los cambios en la
eficiencia de la replicación y transmisión viral dentro del cultivo celular, elegimos usar un MOI de 1 y equivalentes del genoma de DENV2 cuantificados
(GE) y ARN de DENV2 en relación con las transcripciones de genes internos en las células infectadas. La eliminación de CDK8 redujo la replicación de
DENV2 8.5 veces en comparación con los controles de NT-shRNA (NT-shRNA media = 4,4 ± 0,9 × 10 6 GE frente a CDK8-shRNA media = 5,2 ± 0,3
x10 5 GE, p = 0,002) y CDK19 la caída redujo la replicación 10,5 veces (media de CDK19-shRNA = 4,2 ± 0,8 × 10 5 GE, p = 0,002) (Figura 2B).
Resultados
• Figura 2
• Las eliminaciones de CDK8 y CDK19 reducen la replicación de DENV2. ( A ) Análisis de transferencia Western de 10
µg de proteína total de extractos nucleares de células Huh7 transducidas en una MOI de 1 con control no diana
mediado por lentivirus o shRNA dirigido a CDK8, shRNA dirigido a CDK19 o shRNA dirigido a ciclina C. ( B ) Las
células Huh7 transducidas por lentivirus se infectaron con DENV2 en MOI 1 durante 24 h, y el ARN celular total se
analizó mediante qRT-PCR para la cuantificación del ARN de DENV en relación con la curva estándar de equivalente
del genoma (GE) de DENV transcrito in vitro ( n = 3 biológicos repeticiones por grupo; ** p <0.01; ANOVA
unidireccional con prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Las barras de error representan la media + /
SEM). ( C) Densidad óptica relativa leída en células Huh7 transducidas con lentivirus después de cuatro días de
selección, luego tratadas con CellTiter 96 Aqueous One Solution. ( n = 4 réplicas biológicas. * p <0.05,
**** p <0.0001; ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. Las barras de error representan la media + /
SEM). ( D ) Se infectaron células Huh7 transducidas con lentivirus con DENV2 en MOI 1 durante 24 h, y se analizó el
ARN celular total mediante qRT-PCR para la cuantificación del ARN de DENV normalizado al gen de
mantenimiento, SDHA , y en relación con la expresión en controles no diana ( n = 3 réplicas biológicas por grupo;
* p <0.05, ANOVA de una vía con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Las barras de error representan
la media + / SEM).
Resultados
• Se ha demostrado previamente que la eliminación de CDK8 o CDK19 reduce la tasa
de proliferación de las células cultivadas [ 31 , 54 , 55 ], y observamos una
proliferación reducida de las eliminaciones de CDK8 y CDK19, en comparación con las
células de control de NT-shRNA (Figura 2C), por lo que normalizamos la expresión de
ARN de DENV2 a un gen de mantenimiento para corregir el número reducido de
células. Hubo una disminución significativa en el ARN de DENV2 en las células
knockdown CDK8 y CDK19 en relación con el ARN celular (Figura 2D). Derribo de la
expresión de Ciclina C (CycC-shRNA) (Figura 2A), que activa ambas CDK y es un
sustituto de la eliminación de CDK8 / 19 [ 26 ], no afectó el número de células, pero
redujo la replicación de DENV2 3,3 veces (media de NT-shRNA = 4,4 ± 0,9 × 10 6 GE
frente a CycC- media de ARNhc = 1,3 ± 0,2 × 10 6 GE, p = 0,009) (Figura 2B – D).
Resultados
• 3.3. La inhibición química de CDK8 / 19 reduce la replicación de DENV2

• Para estudiar mejor la función de CDK8 y CDK19 durante la infección por DENV2, utilizamos un
inhibidor del sitio activo de CDK8 / 19 de molécula pequeña, Senexina A [ 38 ]. El uso de Senexin A
no distingue las actividades de CDK8 y CDK19, ya que sus sitios activos son idénticos, pero el
tratamiento con Senexin A se puede administrar exclusivamente durante la infección sin
tratamiento o selección previos y no afectó negativamente la proliferación de células Huh7 a las
concentraciones utilizadas en este estudio. (12-25 μM) (figura 3A). La inhibición por senexina de
CDK8 / 19, a diferencia de las caídas, inhibe exclusivamente la actividad de la quinasa en lugar de
eliminar las funciones relacionadas con la quinasa y la estructura de CDK8 / 19 [ 38 , 48
]. Verificamos la inhibición de la función de CDK8 por Senexina A inhibiendo la expresión de un gen
de respuesta sérico conocido dependiente de CDK8 , EGRI [ 27 , 31 ] (figura 3B). Las células que
estaban privadas de suero y posteriormente repletas de suero exhibieron la inducción característica
de EGR1 , mientras que las células tratadas con Senexina A no indujeron significativamente
la expresión de EGR1 en respuesta al suero (figura 3B).
Resultados
• figura 3
• CDK8 / 19 La inhibición química reduce la replicación de DENV2. ( A ) Densidad óptica relativa de las células Huh7 después
de 72 h de tratamiento con DMSO o Senexina A a las dosis indicadas y la adición de CellTiter 96 Aqueous One
Solution. ( n = 9 repeticiones biológicas. **** p <0,0001 ANOVA unidireccional con la prueba de Dunnett. Las barras de
error representan la media + / SEM). ( B ) Niveles de ARNm de EGR 1 en células Huh7 privadas de suero y estimuladas con
suero en presencia de DMSO o Senexina A 12 μM (n = 3 réplicas biológicas; * p <0.05, **** p <0.0001 ANOVA de una vía
con la prueba de Dunnett; las barras de error representan la media +/− SEM). ( C) Los ARN de DENV2 en preparaciones de
ARN celular total (ARN intracelular, GE) y en sobrenadantes de cultivo (ARN extracelular, GE) se determinaron mediante
qRT-PCR y el virus sobrenadante se midió mediante ensayo de placa (partículas infecciosas). Las células Huh7 se
infectaron con DENV2 (MOI = 1) durante 24 o 36 hpi con DMSO o Senexina A 12 o 25 μM, respectivamente ( n = 3 réplicas
biológicas; * p <0,05, ** p <0,01, *** p < 0,001, **** p <0,0001; prueba t de dos colas no apareado ; las barras de error
representan la media + / SEM). ( D) Ensayos de transferencia Western de sedimentos de virus sobrenadantes de células
infectadas con DENV2 (UV) tratado con UV de 10 MOI, o con DENV2 sin (DENV) o con Senexina A 25 µM (DENV / Sen) a
24 y 48 hpi. Se indican las especificidades de los anticuerpos. Las densidades de banda relativas de DENV2 gE, prM y
proteínas de la cápside en preparaciones de virus infectadas con DENV2, tratadas con Senexina A versus preparaciones de
virus infectadas con DENV2 se indican a la derecha de los paneles indicados. Los resultados son representativos de tres
réplicas biológicas para cada punto de tiempo.
Resultados
• Las células Huh7 se trataron con dimetilsulfóxido (DMSO) o Senexina A solubilizada en DMSO al comienzo de las infecciones
sincronizadas y se evaluó la replicación del virus a las 24 hpi (después de una ronda de replicación del virus) (figura 3C) y a las 36
hpi (coincidente con un aumento significativo de la expresión de CDK8, Figura 1C y figura 3D). A las 24 hpi, la Senexina A 12 μM
redujo los ARN del virus intracelular 2,7 veces en comparación con los controles DMSO (media de DMSO = 4,1 ± 0,5 × 10 5 GE
frente a la media de Senexina A = 1,5 ± 0,2 × 10 5 GE, p = 0,008) (figura 3C). El tratamiento con senexina A también redujo los ARN
del virus extracelular 3,2 veces (media de DMSO = 2,2 ± 0,5 × 10 5 GE frente a la media de Senexina A = 6,8 ± 1,4 × 10 4 GE, p =
0,04) y las partículas de virus infecciosos en 8,9 veces (DMSO = 1,9 ± 0,2 × 10 4 UFP / ml frente a Senexina A media = 2,1 ± 1,0 ×
10 3 UFP / ml, p = 0,0015) (figura 3C). A las 36 h hpi, la Senexina A 25 μM redujo los ARN del virus intracelular DENV2 1.9 veces
(DMSO, 1.5 × 10 6 GE frente a Senexina A, 7.8 × 10 5 GE), los ARN extracelulares en 3.8 veces (DMSO, 1.6 × 10 6 GE frente a
Senexina A, 4,2 × 10 5 GE) y PFU / ml en 6,8 veces (DMSO, 4,0 × 10 4 frente a Senexina A, 5,9 × 10 3 ) (figura 3C).
• Analizamos las proteínas virales en células tratadas con Senexina A mediante transferencia Western (figura 3D). Las partículas de
virus libres de células, sedimentadas a partir de volúmenes iguales de sobrenadantes de células infectadas, mostraron una
reducción en los niveles de proteína de la envoltura, E, prM y cápside (figura 3D). Aunque los niveles de proteína de la cápside
estaban fuera del rango lineal del análisis western, las densidades de banda relativas de E a 24 y 48 hpi y de prM a 24 hpi en
sobrenadantes de células tratadas con Senexina A tienen aproximadamente el 15% de la proteína en el células no tratadas. Los
resultados de la inhibición de CDK8 / 19 por Senexina A durante la infección por DENV2 indican un déficit significativo en la
síntesis de ARN viral y en la producción y empaquetamiento de partículas virales infecciosas.
Resultados
• 3.4. La expresión del gen metabólico depende de la actividad de la quinasa CDK8 / 19

• Se ha demostrado que la actividad de la quinasa CDK8 controla la transcripción de genes glicolíticos
seleccionados [ 33 ]. Investigamos el papel de CDK8 y CDK19 como reguladores de las vías
metabólicas que se inducen durante la infección por DENV2. Los primeros pasos en la glucólisis son
críticos para la producción de metabolitos que apoyan la replicación de DENV2 y están marcados
por un aumento en la captación de glucosa y una mayor expresión de la primera enzima limitante
de la glucólisis, HK2 [ 7 , 8 ]. Medimos la expresión del ARNm de HK2 durante el transcurso del
tiempo de las infecciones sincronizadas por DENV2 y confirmamos que está regulado al alza en
comparación con las células infectadas de forma simulada y las células infectadas con DENV2
inactivado por UV equivalente (Figura 4A). Se detectaron niveles aumentados de ARNm de HK2
después de 12 hpi, coincidiendo con la replicación máxima del ARN del virus y con una mayor
expresión de ARNm de CDK8 (Figura 1C.A). Los niveles de ARNm de HK2 aumentaron 3,68 veces (±
0,38, n = 7) en células Huh7 infectadas con DENV a las 48 hpi (Figura 4B).
Resultados
• Figura 4
• La senexina A reduce la inducción de DENV2 de la expresión de hexoquinasa 2. ( A ) Las células Huh7 se infectaron de
forma simulada o se infectaron con DENV en MOI 10, y la expresión de ARNm de HK2 se analizó mediante qRT-PCR en los
puntos de tiempo indicados. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes. La expresión es
relativa al momento de la infección y se normaliza a SDHA . ( B ) Expresión de HK2 en células simuladas frente a células
infectadas a las 48 hpi ( n = 7 réplicas biológicas; *** p <0,001, prueba t de dos colas no apareada con corrección de
Welch). Las barras de error representan la media +/− SEM. ( C) Expresión de ARNm de HK2 en células Huh7 infectadas y
simuladas tratadas con DMSO o Senexina A 25 μM o Senexina B 12 μM añadidas al inicio de la infección (MOI 10; 36
hpi). Expresión relativa a células tratadas con DMSO, infectadas de forma simulada y normalizadas a SDHA ( n = 3 réplicas
biológicas; ** p <0,01, **** p <0,0001; ANOVA unidireccional con prueba de comparaciones múltiples de Tukey). Las
barras de error representan la media +/− SEM. ( D) Análisis de transferencia de Western de la abundancia de proteínas
celulares y virales en fracciones de 2 µg enriquecidas en mitocondrias de células infectadas simuladamente (Mock), o
células con DENV2 (UV) o DENV2 tratado con UV de 10 MOI sin (DENV) o con o con Senexina 25 µM A (DENV / Sen). Las
especificidades de los anticuerpos se indican al igual que las densidades de banda relativas de HK2 frente a Cox4. Las
densidades de banda relativas de las proteínas DENV2 NS5 y prM en preparaciones de células infectadas con DENV2
tratadas con Senexina A frente a las tratadas con DMSO se indican a la derecha de los paneles indicados. Los resultados
son representativos de seis réplicas biológicas.
Resultados
• Evaluamos el impacto de la senexina A en la expresión de HK2 durante las infecciones sincronizadas con DENV2 y observamos la inhibición de la expresión de HK2 inducida por virus, pero no de la expresión
basal de HK2. La senexina A no bloqueó por completo la inducción de HK2 por infección, pero la redujo (aumento de 2,88 ± 0,21 veces sobre la simulación frente a un aumento de 5,10 ± 0,49 veces en las
células infectadas tratadas con DMSO;Figura 4C). Las células infectadas de forma simulada no mostraron diferencias en la expresión de HK2 con o sin tratamiento con Senexina A ( Figura 4C). Mientras
realizábamos estos experimentos, obtuvimos un inhibidor de CDK8 / 19 de segunda generación, Senexin B [ 37 ], y confirmamos una reducción similar de 2.1 veces en los equivalentes del genoma de DENV2
con el tratamiento con Senexin B como observamos con Senexin A (DMSO GE media = 6.7 ± 1,0 × 10 7 , media de GE de Senexina B = 3,2 ± 0,7 × 10 7 ). Al igual que con el tratamiento con Senexina A, la
Senexina B inhibió la inducción de HK2 durante la infección por DENV2, mientras que la expresión basal de HK2 no se vio afectada ( Figura 4C, panel derecho; Cambio de veces medio de DMSO con respecto al
simulacro: 4,64 ± 0,45, Senexina B: 3,22 ± 0,45).
• Además de HK2, evaluamos los niveles de ARNm de otros cuatro genes glucolíticos que se ha demostrado que responden a la función de CDK8: fosfofructoquinasa (PFK), gliceraldehído 3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH), enolasa isoforma 1 (ENO1) e isoforma piruvato quinasa. M2 (PKM2) [ 33 ]. La expresión de estos cuatro genes no se incrementó durante la infección por DENV2 de las células Huh7
(datos no mostrados). Esto está en línea con trabajos anteriores que demuestran un papel anapleurótico de HK2 en la producción de intermediarios metabólicos en lugar de un papel productor de ATP [ 7 , 8 ].
• HK2 se localiza en la membrana mitocondrial externa, donde actúa en la regulación del metabolismo de la glucosa, la protección contra la apoptosis y el inicio de la autofagia [ 8 , 56 , 57 , 58 ]. Preparamos
fracciones enriquecidas en mitocondrias [ 46 ], que también se sabe que están enriquecidas en complejos de replicación viral y proteínas DENV2 [ 59 ]. Observamos un aumento de HK2, en relación con los
niveles de una proteína marcadora mitocondrial, subunidad 4 de la citocromo c oxidasa (Cox4), en preparaciones de células infectadas con DENV2 en comparación con las células tratadas con DENV2 simulado
y con UV-DENV2, y el tratamiento con Senexina A redujo la abundancia de HK2 a niveles en células no infectadas Figura 4D). El tratamiento con senexina también redujo los niveles aparentes de NS5 y prM en
estas preparaciones al 21% de los niveles en las preparaciones de células infectadas con DENV2 (Figura 4D). Los niveles de proteína Cox4 aparentemente no se vieron afectados por el tratamiento con Senexin.
• En general, estos datos indican que la inhibición de la actividad quinasa CDK8 / 19 por Senexina reduce específicamente los niveles inducidos por virus, pero no los niveles basales de ARNm de HK2 y la
expresión de proteínas, y que la expresión de la proteína del huésped, Cox4, no se ve afectada ni por la infección por DENV2 ni por la Senexina. Un tratamiento.
• 3.5. La senexina A reduce la inducción de la expresión del gen lipofágico
• Además de los cambios en la utilización de glucosa, DENV2 induce lipofagia, el agotamiento autofágico de las gotitas de lípidos para la liberación de ácidos grasos libres para apoyar un cambio metabólico a la
β-oxidación [ 11 ]. LC3 funciona en la formación de la membrana autofagosómica en gotitas de lípidos [ 60 ]. LC3 se modifica inicialmente a LC3-I por el factor de autofagia Atg4, y posteriormente se modifica a
la forma lipidada asociada a la membrana, LC3-II, por los factores de autofagia Atg3 y Atg7 [ 61 ]. La conversión de LC3-I en LC3-II se considera una medida de la actividad autofágica [ 60 , 61 ], y se ha
observado una mayor conversión de LC3-I en LC3-II durante la infección por DENV2 [ 23 , 24 ].
• Encontramos que el nivel de ARNm de LC3 aumentó durante el curso de la infección por DENV2 coincidiendo con los aumentos en CDK8 y HK2 ( Figura 1, Figura 4 y Figura 5A). Los niveles de ARNm de LC3
aumentaron 5,6 ± 0,2 veces ( p <0,0001) en células infectadas con DENV2 frente a células infectadas de forma simulada a las 48 hpi (Figura 5B). Al igual que con HK2 (Figura 4), la inducción viral de la expresión
de ARNm de LC3 se redujo significativamente en las células tratadas con Senexina A (DMSO cambio de veces medio con respecto al simulacro: 6,02 ± 0,31, Senexina A: 3,04 ± 0,26) y con Senexina B (cambio
medio de DMSO con respecto al simulacro: 6,25 ± 1,70, Senexina B: 2,41 ± 0,38) (Figura 5C). Además, como se observó con la expresión de HK2, la expresión de LC3 basal no fue inhibida por la inhibición de
CDK8 / 19. Senexina A, pero no Senexina B, en realidad indujo un aumento modesto en la expresión de LC3 en células infectadas simuladamente ( Figura 5C).
Resultados
• Figura 5
• La senexina A reduce la inducción de DENV2 de la expresión del gen lipofágico. ( A ) Las células Huh7 se infectaron de
forma simulada o se infectaron con DENV en MOI 10, y la expresión de ARNm de LC3 se analizó mediante qRT-PCR en los
puntos de tiempo indicados. Expresión relativa al tiempo de infección, normalizada a SDHA y representativa de dos
experimentos de curso temporal independientes. ( B ) Expresión de LC3 en células simuladas frente a infectadas a las 48
hpi ( n = 3 réplicas biológicas; *** p <0,001, prueba t de dos colas no apareada con corrección de Welch). Las barras de
error representan la media +/− SEM. ( C) Expresión de ARNm de LC3 en células Huh7 simuladas o infectadas con DENV2 a
MOI 10 durante 36 h con DMSO o Senexina A 25 μM o Senexina B 12 μM añadidas en el momento de la infección (en
relación con las células tratadas con DMSO, infectadas simuladamente y normalizadas). a SDHA ; n = 3 réplicas biológicas.
* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, **** p <0.0001; ANOVA unidireccional con prueba de comparaciones múltiples de
Tukey). Las barras de error representan la media +/− SEM. ( D) Análisis de transferencia Western de la abundancia de
proteínas celulares y virales en extractos citoplasmáticos de 2 µg de células infectadas simuladamente (Mock), o células
con DENV2 (UV) o DENV2 tratado con UV de 10 MOI sin (DENV) o con o 25 µM de Senexina A ( DENV / Sen). Las
especificidades de los anticuerpos se indican al igual que las densidades de banda relativas de LC3-I y LC3-II frente a
Cox4. Las densidades de banda relativas de las proteínas DENV2 NS3 y prM en preparaciones de células infectadas con
DENV2 tratadas con Senexina A frente a las tratadas con DMSO se indican a la derecha de los paneles indicados. Los
resultados son representativos de seis réplicas biológicas.
Resultados
• Los análisis de transferencia Western de extractos citoplasmáticos demostraron un aumento

constante de LC3-II lipidada en células infectadas con DENV2 en comparación con las células
infectadas de forma simulada o tratadas con UV-DENV2, en relación con los niveles de actina β
(Figura 5D). El tratamiento con senexina A redujo los niveles de LC3-II lipidada a la mitad (
Figura 5D). Como se observó anteriormente, el tratamiento con Senexina A también redujo los
niveles de proteína viral en extractos celulares. En este caso, NS3 fue 61% y prM 31% de lo
observado en células infectadas con DENV2 no tratadas. Los niveles de proteína actina del
huésped no se vieron afectados por el tratamiento con Senexin A.
• En general, estos datos indican que la inhibición por Senexina de la actividad de la quinasa
CDK8 y CDK19 reduce específicamente los niveles inducidos por la infección, pero no los
niveles basales de expresión del gen LC3, y que la expresión de las proteínas del huésped Cox4
(Figura 4D) y actina (Figura 5D) no se ve afectado ni por la infección por DENV2 ni por el
tratamiento con Senexin.
Resultados
• 3.6. La senexina A inhibe la respiración mitocondrial

• Probamos directamente las consecuencias posteriores de la infección por
DENV2 y la inhibición de CDK8 / 19 midiendo el flujo metabólico en células
Huh7 simuladas e infectadas con DENV2 con y sin tratamiento con Senexina
A. Usamos un analizador de flujo metabólico Seahorse XF para medir las tasas
de respiración mitocondrial según lo indicado por la tasa de consumo de
oxígeno (OCR) luego de la adición secuencial de oligomicina (inhibidor de ATP
sintasa), FCCP (desacoplador de fosforilación oxidativa) y rotenona y
antimicina A (transporte de electrones) inhibidores del complejo de cadena I y
III) (Figura 6) (consulte los métodos para obtener detalles sobre el cálculo de
los parámetros).
Resultados
• Figura 6
• La senexina A inhibe la respiración mitocondrial. Las células Huh7 se infectaron de forma simulada o
se infectaron con DENV2 a una MOI de 10 con o sin DMSO o Senexina A 12,5 µM durante 24 o 48
h. ( A , B ) La tasa de consumo de oxígeno normalizado (OCR) se midió a lo largo del tiempo durante
las pruebas de estrés mitocondrial. Se presentan los valores específicos determinados por la prueba
de esfuerzo mitocondrial (tasa basal, producción de ATP, máxima respiración, capacidad de reserva,
fuga de protones y respiración no mitocondrial). ( C) Se midió la tasa de acidificación extracelular
normalizada (ECAR) a lo largo del tiempo durante una prueba de esfuerzo con glucosa a 48 hpi. Se
presentan los valores específicos determinados en la prueba de esfuerzo de glucosa (niveles de
glucólisis, capacidad glucolítica, reserva glucolítica y capacidad no glucolítica). Los resultados se
normalizaron al número de células viables después de las mediciones metabólicas. Los parámetros
para las mediciones individuales se presentan en los métodos (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001,
**** p <0.0001 ANOVA de una vía con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. N = 3
repeticiones biológicas ). Las barras de error representan la media + / SEM.
Resultados
• Primero evaluamos los cambios en la capacidad metabólica en células Huh7 infectadas con DENV2 en comparación con las no infectadas. A las 24 hpi, no hubo diferencias significativas
en la tasa de consumo de oxígeno entre las células no infectadas y las infectadas con DENV2 (Figura 6A; panel superior: mediciones a lo largo del tiempo; paneles inferiores:
cuantificación, consulte los métodos para obtener detalles sobre los puntos de tiempo para la cuantificación). Sin embargo, a las 48 hpi, hubo aumentos sustanciales en la respiración
basal, la producción de ATP, la respiración máxima y la capacidad de reserva en las células infectadas con DENV2 en comparación con las células infectadas simuladamente (Figura 6
B; panel superior: mediciones a lo largo del tiempo, paneles inferiores: cuantificación). Solo la fuga de protones y la respiración no mitocondrial se mantuvieron sin cambios en las células
infectadas con DENV2. Estos datos están en línea con los datos de expresión génica de nuestro huésped, lo que respalda un aumento en la capacidad metabólica de las células Huh7
infectadas con DENV2 en comparación con las células no infectadas.
• Evaluamos las diferencias en el consumo de oxígeno entre las células no infectadas y las infectadas con DENV2 con o sin tratamiento con Senexina A para determinar si la actividad de la
quinasa CDK8 / 19 juega un papel en los cambios metabólicos durante la infección por DENV2. La senexina A redujo la respiración basal y la producción de ATP en las células infectadas de
forma simulada después de 24 h, pero las diferencias en otros parámetros y en las células infectadas con DENV2 no fueron significativas (Figura 6A). Por el contrario, observamos cambios
significativos en el flujo metabólico con el tratamiento con Senexina A a las 48 hpi (Figura 6B). Todos los parámetros de la respiración, excepto la fuga de protones, se redujeron y ya no
hubo diferencias distinguibles entre las células infectadas y no infectadas con DENV2 (Figura 6B). Por lo tanto, la inhibición prolongada de Senexina A de CDK8 / 19, de 24 a 48 h, resultó
en una profunda supresión de la respiración mitocondrial, coincidente con la reducción de la expresión génica metabólicaFigura 4 y Figura 5).
• También evaluamos los cambios en la glucólisis durante la infección por DENV2, ya que se había informado anteriormente de un aumento de la captación de glucosa [ 8 ]. Si se utilizara el
aumento de la captación de glucosa en las células infectadas con DENV2 para la producción de ATP, esperaríamos ver un aumento de la acidificación extracelular debido a la producción
de ácido láctico. Medimos la tasa de acidificación extracelular (ECAR) en células no infectadas e infectadas con DENV2 luego de la adición secuencial de glucosa, oligomicina (inhibidor de
la ATP sintasa) y 2-desoxi-glucosa (2-DG) (inhibidor de la hexoquinasa) (consulte los métodos para obtener detalles sobre los cálculos). de parámetros). Como lo demuestra la ECAR
disminuida, la glucólisis, la capacidad glucolítica y la reserva glucolítica se redujeron significativamente por la infección por DENV2 (Figura 6C; panel izquierdo: mediciones a lo largo del
tiempo, paneles derecho: cuantificación). Esto apoya la conclusión de que el metabolismo de la glucosa durante la infección por DENV2 no cumple una función productora de ATP, sino
que actúa en la producción de intermediarios metabólicos [ 7 ].
• También evaluamos los efectos de la Senexina A sobre la capacidad glucolítica. El tratamiento con senexina A redujo la capacidad glucolítica y no glucolítica tanto en muestras infectadas
con DENV2 como en muestras simuladas (Figura 6C). Sin embargo, a diferencia de la respiración mitocondrial, las células infectadas con DENV2 pudieron compensar, modestamente, los
efectos de la senexina A sobre la glucólisis y la capacidad glucolítica (Figura 6C). Juntos, estos datos ilustran la dependencia del metabolismo celular de la actividad quinasa CDK8 y / o
CDK19 y muestran que esta dependencia puede ser manipulada por DENV2 para soportar el aumento de las demandas metabólicas necesarias para una replicación viral eficaz.
Discusión
• 4. Discusión
• Aquí mostramos que la expresión de CDK8, un regulador transcripcional altamente conservado, se regula positivamente durante la infección por DENV2, lo que sugiere un papel de CDK8 en la respuesta celular a la infección. El aumento de los niveles de CDK8 coincide con el aumento de la expresión de dos genes metabólicos
clave, HK2 y LC3 , que apoyan la replicación de DENV2. La manipulación del entorno de la célula huésped es fundamental para soportar las demandas de la replicación viral, y las alteraciones en el metabolismo han sido el foco de varios artículos recientes que identifican los factores del huésped necesarios para la replicación del
DENV [ 6 , 7 , 9 , 62 , 63]. La autofagia también es un resultado común de la infección por flavivirus, y el metabolismo de las gotas de lípidos está relacionado con la replicación como fuente de lípidos neutros para satisfacer las demandas de energía, como fuente de intermediarios para la síntesis de novo de ácidos grasos y como
plataforma para el ensamblaje viral en el caso de hepatitis C [ 11 , 14 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73]. Mostramos que la actividad de la quinasa CDK8 / 19 es necesaria para el metabolismo alterado observado durante la replicación de DENV2.
• Primero notamos cambios en los niveles de ARNm de CDK8 durante las infecciones sincronizadas con DENV2, pero no encontramos cambios significativos en la expresión del parálogo CDK8, CDK19 (Figura 1). Ni las células infectadas de forma simulada ni las células con partículas de DENV2 tratadas con UV unidas mostraron un
aumento de CDK8, lo que indica un requisito para la replicación del virus y / o la producción de proteínas del virus. Las funciones específicas de CDK8 siguen sin estar claras, pero probablemente incluyen la expresión de los factores de transcripción que activan la expresión de HK2 y LC3 y otras proteínas que apoyan la replicación
del virus.
• Usamos las caídas de shRNA CDK8 y CDK19 mediadas por lentivirus para distinguir las funciones de estos cofactores de transcripción durante la infección por DENV2 y descubrimos que ambos son necesarios para la replicación robusta del virus (Figura 2). Sin embargo, solo la expresión de CDK8 se incrementó significativamente
durante la infección por DENV2. Esto sugiere solo que no es necesario aumentar los niveles de CDK19 para respaldar la replicación de DENV2, a diferencia de la clara asociación de infección con un aumento de CDK8. Los niveles basales de CDK19 pueden ser suficientes para la replicación, y el efecto de la eliminación de CDK19
indica que tiene un papel de apoyo en la infección por DENV2. Tal papel puede incluir una función independiente de su actividad quinasa [ 47 , 48 , 54 ]. Se justifica una mayor investigación de los roles únicos dependientes de quinasa e independientes de quinasa para CDK8 y CDK19 durante la infección por DENV2 y
proporcionará información sobre las diferencias funcionales entre estas dos quinasas mediadoras.
• La inhibición química de CDK8 y CDK19 con el inhibidor de molécula pequeña Senexina A redujo la replicación del genoma viral y la formación de partículas infecciosas (figura 3). La inhibición química de CDK8 / 19 también redujo la expresión de HK2 y LC3 en las células infectadas a niveles casi simulados de infección (Figura 4 y
Figura 5). Como era de esperar, el resultado del bloqueo de la senexina A de la inducción de HK2 y LC3 en células infectadas con DENV2 fue la pérdida del aumento de la respiración mitocondrial asociada con la infección (Figura 6). Lo que no se esperaba fue la disminución significativa en la respiración mitocondrial en las células
de carcinoma Huh7 infectadas simuladamente y tratadas con Senexina A. Estos datos indican que la respiración mitocondrial en las células Huh7 es crónicamente inducida y sujeta a la regulación de CDK8 / 19 sin la participación de virus. En muchos tipos de células cancerosas es común una sobreexpresión doble o una CDK8
hiperactiva, y la capacidad metabólica expandida desempeña un papel en el establecimiento y mantenimiento de muchos tumores [ 37 , 38 , 55]. De hecho, la capacidad excepcional de las líneas de células tumorales hepáticas para apoyar la replicación de DENV2 puede residir en su actividad metabólica ya expandida, que parece
depender de la actividad enzimática de CDK8 / 19. Aunque no está dentro del alcance de este trabajo, las investigaciones sobre el metabolismo dependiente de CDK8 / 19 en células primarias pueden proporcionar información valiosa.
• Los datos muestran que la Senexina A tiene un efecto inhibidor sobre la capacidad metabólica de las células y que este efecto no puede ser anulado por la infección por DENV2. El retraso hasta después de 24 h para los efectos completos de Senexin A sugiere que está actuando, como se esperaba, a nivel de expresión génica; La
inhibición de CDK8 / 19 bloquea la reprogramación gradual de la expresión génica que da como resultado cambios metabólicos sustanciales durante la replicación máxima del virus. El momento de la inducción de DENV2 de la expresión de HK2 y LC3 hasta después de 12 hpi, con inducción completa solo después de 24 h, y la
capacidad de Senexin A para bloquear la inducción de HK2 y LC3, respalda un papel para CDK8 / 19 específicamente en el control de la expresión génica. para regular el metabolismo.
• Recientemente se demostró que CDK8 regula la autofagia en Drosophila en condiciones de inanición al promover el alargamiento de los ARNm que codifican Atg1 y Atg8 , ortólogos de mamíferos ULK1 y LC3 [ 34 ]. El alargamiento de la UTR 3 'se logra mediante la fosforilación de CDK8 del factor de especificidad de escisión y
poliadenilación, CPSF6, un componente del complejo de escisión y poliadenilación (CPA). Tang y col. [ 34] mostró además que el tratamiento con Senexina A redujo la activación de LC3, lo que, de acuerdo con nuestros hallazgos, sugiere un papel conservado de CDK8 en la regulación de LC3, independientemente de los factores
estresantes celulares. La pérdida de la expresión del gen LC3 es un mecanismo probable para la reducción de la respiración mitocondrial en las células Huh7 simuladas e infectadas con DENV2 tratadas con Senexina A. La dependencia de la replicación de DENV2 en el aumento de la capacidad mitocondrial es consistente con
informes recientes sobre la expansión del compartimento mitocondrial durante DENV infección [ 59 ]. La ciclina C también se ha implicado en el control de la dinámica mitocondrial independientemente de las CDK [ 74 , 75 , 76]. Cualquiera de estos mecanismos propuestos es consistente con las reducciones en el ARN de DENV2
que observamos con la caída de CDK8, CDK19 y Ciclina C (Figura 2B, D). Se justifican más investigaciones mecanicistas.
• Además de los cambios en la dinámica mitocondrial, las células infectadas con DENV2 exhibieron una actividad glucolítica reducida, como se observó anteriormente, debido a la desviación de los intermedios glucolíticos de la producción de ácido láctico a funciones anapleuróticas [ 7 , 77 ]. El tratamiento con senexina A redujo la
actividad glucolítica, en términos de producción de ácido láctico, de las células infectadas con DENV2 y simulacros (Figura 6C), que indica el control CDK8 / 19 de la expresión génica glucolítica. La infección por DENV2 permitió un aumento modesto en la glucólisis y la capacidad glucolítica en comparación con las células
infectadas simuladamente en presencia de Senexina A. Esta compensación puede ser el resultado de niveles más altos de expresión de HK2 en las células infectadas con DENV2 tratadas con Senexina A en comparación con las tratadas. , células infectadas simuladas (Figura 4C) debido a un bloqueo incompleto de Senexina A de
CDK8 en las células infectadas.
• Aunque usamos HK2 y LC3 como medidas de la expresión génica metabólica dependiente de CDK8 / 19 durante la infección por DENV2, es probable que estos no sean los únicos genes regulados por CDK8 / 19 durante la infección viral. Se justifica más investigación sobre la imagen global de la expresión génica regulada por
CDK8 / 19 durante la infección por DENV2 para comprender su función completa. Anteriormente mostramos que la actividad de CDK8 se ve reforzada por una ciclina retroviral [ 31 , 32 , 35]. La interacción entre la ciclina retroviral y CDK8 mejora la función de CDK8 en la respuesta del suero en beneficio del virus, que requiere la
proliferación celular para la transmisión. Ahora mostramos que CDK8 aumenta durante la infección con un virus no relacionado, DENV2, y que el aumento de la actividad de CDK8 es, en última instancia, beneficioso para la replicación viral. En este caso, el soporte depende de mecanismos metabólicos más que proliferativos. La
dependencia de DENV2 del metabolismo del huésped lo convierte en un modelo valioso para estudiar el control del metabolismo de CDK8 / 19.
• CDK8 está altamente conservada en todos los organismos metazoarios, y el flujo metabólico y la inducción de la autofagia son comunes a las infecciones por una amplia gama de virus de ADN y ARN [ 20 , 24 ]. Proponemos que muchos virus pueden depender de la función de CDK8 y / o CDK19 para la expresión inducida de
genes metabólicos y autofágicos. Las demandas celulares para la función de CDK8 / 19 parecen estar limitadas a las respuestas proliferativas y al estrés en oposición a la homeostasis. Como tal, las terapias que se dirigen a la actividad de la enzima CDK8 / 19 son prometedoras para la infección por virus y el cáncer [ 37
]. Observamos una reducción en las PFU de casi un log 10 copias / ml en los sobrenadantes de las células tratadas con Senexina A. Wagoner y col. [ 78] calculó que las probabilidades de enfermedad grave por dengue aumentan en un 50% por cada aumento de 1 log 10 copias / ml de suero de fase aguda. Las terapias con senexina
tienen la capacidad de reducir significativamente los resultados graves de las infecciones por DENV. Además de las reducciones significativas en la gravedad de la enfermedad, existe una dosis mínima de infección por mosquitos en el suero de las personas infectadas. Nguyen y col. [ 79 ] cuantificó la dosis infecciosa de mosquitos
al 50% en 6.29–7.52 log 10 copias de ARN / mL de plasma; un tronco 10La reducción del virus plasmático que reduce la carga viral por debajo de este rango reducirá efectivamente la capacidad de transmisión de DENV. Se pueden lograr reducciones adicionales en las cargas virales con terapias combinadas de dianas de virus y
dirigidas al huésped adicionales, una estrategia común para evitar el desarrollo de resistencia a los fármacos dirigidos a virus por sí solos. En resumen, hemos identificado CDK8 / 19 como un centro de regulación transcripcional durante la infección por DENV2. CDK8 y CDK19 son responsables de la regulación positiva de genes
metabólicos clave que mejoran el metabolismo de la glucosa y la autofagia para satisfacer las demandas energéticas y metabólicas de la replicación viral.
Dr. Guey Chuen Perng
Ph.D. del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de California

Formación postdoctoral en el Centro Médico Cedars-Sinai (CSMC) (hospital
universitario afiliado a la Universidad de California, Los Ángeles).
Profesor asociado, Departamento de Microbiología e Inmunología y del Centro de

Investigación de Enfermedades Infecciosas y Señalización
Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Cheng Kung, Taiwán
Introducción
Según estadísticas recientes, hay aproximadamente 17.2
millones de nuevos casos de cáncer y 8.9 millones de muertes
relacionadas con el cáncer en todo el mundo por año.
Entre ellos, las infecciones representan alrededor del 15% de

los casos de cáncer en humanos.
Según datos del INS para el año 2017 en Colombia

10709 casos de dengue en el sexo femenino y 14339 casos en el sexo masculino, de los cuales 10777 se presentaron en menores
de 19 años de edad, correspondiendo al 42.9% de los casos de dengue.
Cáncer en menores de 18 años, según el SIVIGILA, para el año 2017 se presentaron 1492, de los cuales 653 fueron casos de
leucemias (leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide aguda, otras leucemias), representando el 43.7% del total de casos.
Introducción
Descripción de las categorías de la clasificación estándar de la IARC
Grupo 2 (A y B)
Grupo 1: 2A: Agentes, las mezclas y las condiciones de exposición para los que se
"El agente (o mezcla) es carcinógeno para el ser humano. ha demostrado, que las pruebas sobre carcinogenicidad para los humanos
son probablemente suficientes.
"Esta categoría se aplica cuando existen pruebas suficientes de Gases de escape de motores diesel, formaldehído.
carcinogenicidad en humanos.
2B: no hay pruebas sobre carcinogenicidad para los humanos pero sí para
Asbesto, benceno y radiación ionizante. los animales de laboratorio.
Lana de vidrio, estireno y gases de escape de los motores de gasolina.
Grupo 3 Grupo 4
"El agente (mezcla o condición de exposición) no puede ser "El agente (o mezcla) es probablemente no carcinógeno para el ser
clasificado respecto a su carcinogenicidad para el ser humano. " humano."
Aquellos agentes (o mezclas) para los que las pruebas de Agentes o mezclas para los que las pruebas de carcinogenicidad en
carcinogenicidad son inadecuadas en humanos y suficientes en humanos son inadecuadas, pero con pruebas que sugieren ausencia de
animales de experimentación (mecanismo de carcinogenicidad en carcinogenicidad en experimentación animal, confirmadas por un amplio
animales de experimentación no opera en humanos). espectro de otros datos significativos."
Antraceno, cafeína y la iluminación fluorescente. El único agente de este grupo es la caprolactama.
Fuente: IUPAC Glossary of Terms Used in Toxicology Classification of carcinogenicity.

Introducción
 El carcinoma hepatocelular causado por el virus de la hepatitis B o el virus de la hepatitis C.

 Cáncer de cuello uterino causado por el virus del papiloma humano.
 Carcinoma nasofaríngeo causado por el virus de Epstein-Barr.
 Sarcoma de Kaposi causado por el virus del herpes humano-8.
Para las neoplasias malignas hematológicas:

 Virus de la leucemia de células T humanas tipo I y la leucemia de células T adultas.
 Virus de Epstein-Barr: linfoma de Burkitt y linfoma de Hodgkin.
 Virus de la inmunodeficiencia humana: linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin.
 Virus de la hepatitis C y linfoma no Hodgkin.
 Helicobacter pylori y linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa gástrica.
Introducción
V1
DE
CASOS DE DENGUE
NV
N
DE
Homogeneidad en
2
250 a 400 millones su secuencia
DE
genética de 65 – 85 %
3
NV
V4 N
DE
25
75%
% DENV infecta una variedad de tipos de
células in vitro, incluidas células
epiteliales, células endoteliales,
hepatocitos, células musculares, células
dendríticas, monocitos y mastocitos.
Los perfiles hematológicos anormales

Leucopenia, Trombocitopenia, linfocitos atípicos
La supresión de la médula ósea también se observa con frecuencia en

pacientes con dengue en la etapa inicial de la infección.
Además, el virus del dengue se puede recuperar de la médula
ósea de sujetos humanos fatales y supervivientes.
Introducción
El dengue, es una enfermedad con signos y síntomas que no son patognomónicos.
Criterios para el Diagnóstico Clínico.

Introducción
 Por lo tanto, el dengue se ha considerado tradicionalmente como una enfermedad febril aguda sin secuelas a largo plazo.
 Sin embargo, se han informado síntomas de dengue persistentes que duran meses o incluso años en Cuba, Perú y Brasil.
 Por ejemplo, García y sus colegas informaron que más de la mitad de los pacientes con dengue tenían síntomas de dengue persistentes en el
seguimiento de 2 años después de la infección por el virus del dengue, y en estos pacientes se encontraron con frecuencia alteraciones de los
marcadores autoinmunes.
 Además, un estudio de cohorte retrospectivo reciente que utilizó NHIRD en Taiwán mostró que los pacientes con dengue tenían un mayor riesgo
de desarrollar enfermedades autoinmunes después de una infección aguda por el virus del dengue. Por lo tanto, existe una creciente evidencia
que sugiere que el dengue puede no ser solo una enfermedad aguda y puede tener algunos efectos a largo plazo en las personas afectadas.
Introducción
Los estudios de examen de la médula ósea han demostrado que la supresión celular transitoria de la médula ósea es un hallazgo
destacado en pacientes con dengue durante la etapa febril temprana.
Estudios experimentales in vitro y ex vivo han demostrado que el virus del dengue puede infectar eficazmente las células progenitoras
hematopoyéticas y solo se replica en leucocitos derivados de la médula ósea y no de los ganglios linfáticos, el bazo o el timo.
Estudios en primates no humanos: la inyección intravenosa del virus del dengue da como resultado la infección de las células de la
médula ósea donde se puede recuperar el virus del dengue.
Aplasia medular
A
Enfermedad hematológica caracterizada por B
citopenia periférica y marcada hipocelularidad
medular sin evidencias de infiltración o
mielodisplasia.
Incidencia: 2 a 6 casos por millón de personas.

Edad más frecuente de comienzo: entre los 20 y
25 años, sin diferencias en cuanto al sexo.
Etiología: congénita ó adquirida (más frecuente).

El 70-80 % de las adquiridas son idiopáticas, el
resto son secundarias al daño de la médula ósea
producido por agentes físicos, químicos o
infecciosos.
A. Día 4.
B. Día 7.
Los virus se han implicado en los síndromes de
insuficiencia de la médula ósea y parecen causar C. Día 12.
mielosupresión por desregulación del sistema
inmune (parvovirus B19, virus de EpsteinBarr,
citomegalovirus, virus de inmunodeficiencia
humana(VIH), virus de la hepatitis C y virus del
dengue).
Aspiraciones seriadas de médula ósea en el Paciente J. E. (X

FIGURA 5B. Aspiraciones seriadas de médula
ósea en el Paciente J. E. (inmersión en aceite, X
1250).
D. Día 4.
E. Día 7.
F. Día 12.
G. Día 4.
H. Día 7.
I. Día 12.
Introducción
Determinar si el riesgo de leucemia aumentó

después de la infección por el virus del dengue.
Hipótesis
La infección por el virus del dengue podría estar
asociada con la leucemia.
En los países hiperendémicos del dengue, la mayoría de las personas han sido infectadas por el virus del dengue varias
veces, lo que dificulta la selección de personas no infectadas para compararlas.
La disponibilidad de bases de datos integrales a nivel nacional, así como la baja incidencia del dengue en Taiwán, nos
proporcionaron recursos únicos y valiosos para probar esta hipótesis.
Fuentes de datos y población de estudio
Estudio de cohorte. Identificación personal único encriptado.

Análisis de las bases de datos de seguros de salud nacionales También permitió la vinculación a múltiples bases de datos
(NHIRD) y datos de enfermedades notificables de casos nacionales (registros de nacimientos, muertes, enfermedades
confirmados. infecciosas notificables).

En Taiwán, la ley obliga a notificar pacientes sospechosos de dengue.
Las muestras de sangre de casos sospechosos deben ser analizadas por laboratorios certificados
aprobados por el Centros para el Control de Enfermedades de Taiwán.
Los criterios de laboratorio para la infección confirmada incluyeron los siguientes:

1. aislamiento del virus.
2. detección de ARN mediante PCR de transcripción inversa en tiempo real.
3. aumento de 4 veces en el título de IgG en muestras pareadas de fase aguda y convaleciente.
4. detección de anticuerpos IgM e IgG específicos del dengue en muestras de suero individuales.
Tabla S1. Lista de códigos ICD-9-CM para identificar leucemia
y otros cánceres seleccionados.
 El resultado primario de interés de este estudio fue la

leucemia:
– 3 visitas ambulatorias o un ingreso hospitalario con códigos ICD-9-CM
– uso de al menos un fármaco de quimioterapia sugeridas en Pautas de
práctica clínica en oncología de la Red Nacional Integral del Cáncer.
 Correlación con registro de nacimientos y defunciones para

verificar fechas de muerte de los participantes del estudio.
 Se siguió a los participantes de ambos grupos desde la

fecha índice hasta
1. diagnóstico de leucemia
2. Muerte
3. final del seguimiento el 31 de diciembre de 2015
Puntos fuertes
Uso de bases de datos poblacional a nivel nacional con tasas de cobertura muy altas (sesgo de selección y la pérdida
de seguimiento poco probables).

Todos los casos de dengue fueron confirmados por laboratorio.

Leucemia: se definió utilizando los códigos ICD-9 más el uso de medicamentos de quimioterapia (minimiza el sesgo
de clasificación errónea tanto para la exposición como para el resultado).

Principal fortaleza: se utilizaron cánceres distintos de la leucemia (no se esperaba que se vieran afectados por la
exposición al virus del dengue).

La evidencia clínica y de laboratorio actual muestra que el virus del dengue puede infectar las células madre
hematopoyéticas en la médula ósea, lo que sugiere un posible vínculo con la leucemia, pero no con otros cánceres.

Población de estudio
33,854 casos Dengue 30,262,242 NHIRD
1998-2014 2000-2015
Excluidos
 2,068 ID invalido
 152 infección 2
 18,114 no dx 2002-2011
25,913,480 personas sin

13,420 casos Dengue
diagnóstico de dengue o
2002-2011
sin información sobre
edad y sexo 2000-2015
Excluidos
 20 no en NHIRD/residencia
desconocida
 765 Dx Ca antes del 2002
 62 fallecen entre 60 días de
fecha índice
12,573 Casos de Dengue 62,865 controles emparejados

sin dx de cáncer al inicio sin diagnóstico de dengue o
del estudio cáncer al inicio del estudio
75,438 seguimiento de los participantes

 dx de leucemia.
 Muerte.
 31 de diciembre de 2015
Análisis estadístico
Diferencias de medias estandarizadas (diferencia significativa entre cuando fue mayor que 0,1)
Tasa de incidencia de leucemia:

número de pacientes diagnosticados durante el seguimiento / tiempo total de seguimiento
(personas-año)
Modelo de regresión de riesgos proporcionales para estimar intervalos de confianza (IC) del 95%
para la leucemia (entre personas infectadas por DENV en comparación con personas no infectadas).
Se ajustaron posibles factores de confusión (patologías).
Análisis por tiempo de aparición de leucemia:

<3 años y ≥3 años.
≥ 3 años se clasificó además en 3-6 años y > 6 años.
Análisis estratificados por edad (<18 y ≥18 años).

Resultados
La
La evidencia
evidencia clínica
clínica yy de
de laboratorio
laboratorio actual
actual muestra
muestra que
que el
el virus
virus del
del dengue
dengue
puede
puede infectar
infectar las
las células
células madre
madre hematopoyéticas
hematopoyéticas en
en la
la médula
médula ósea,
ósea, lo
lo que
que
sugiere
sugiere un
un posible
posible vínculo
vínculo con
con la
la leucemia,
leucemia, pero
pero no
no con
con otros
otros cánceres.
cánceres.
La
La mediana
mediana del
del tiempo
tiempo de
de seguimiento
seguimiento fue
fue de
de 8,22
8,22 años
años [rango
[rango
intercuartílico
intercuartílico (IQR)
(IQR) 5,30-13,15]
5,30-13,15] en
en personas
personas infectadas
infectadas por
por el
el virus
virus del
del
dengue
dengue yy 8,22
8,22 años
años (IQR
(IQR 5,28-13,15)
5,28-13,15) en
en el
el grupo
grupo de
de control.
control.
No
No hubo
hubo diferencias
diferencias significativas
significativas en
en la
la prevalencia
prevalencia de
de cinco
cinco comorbilidades
comorbilidades
seleccionadas
seleccionadas entre
entre los
los dos
dos grupos,
grupos, pero
pero los
los casos
casos de
de dengue
dengue parecían
parecían vivir
vivir
en áreas más urbanizadas que los controles.
en áreas más urbanizadas que los controles.
Resultados
Resultados
Asociaciones positivas entre la infección previa

por el virus del dengue y todos los subtipos de
leucemia, aunque las asociaciones no fueron
estadísticamente significativas, probablemente
debido al bajo número de casos para cada
subtipo.
Resultados
Discusión
En este estudio de cohorte poblacional a nivel nacional, se encontró que el riesgo de desarrollar leucemia era
significativamente mayor en personas con una infección previa por el virus del dengue.
A diferencia de los cánceres sólidos, que suelen tardar al menos 10 años en desarrollarse, el período mínimo de
latencia de la leucemia después de una exposición perjudicial generalmente se considera de alrededor de 2 a 3 años.
La HR ajustada alcanzó a 3,22 con significación estadística entre 3 y 6 años después de la infección por el virus del
dengue, lo que sugiere una relación temporal y una posible causa entre la exposición al virus del dengue y la
leucemia, con una incidencia máxima que se produce entre los 3 y los 6 años.
Resultados
La infección por el virus del dengue se asoció con un mayor riesgo de leucemia, pero no se asoció con cánceres distintos a la
leucemia, lo que sugiere que la asociación observada entre el virus del dengue y la leucemia en nuestro estudio es consistente con la
evidencia actual y es menor probablemente debido a un resultado de factores de confusión no medidos, sesgo de detección u otras
fuentes de sesgo.
Puntos débiles
Aproximadamente el 75% de las infecciones por el virus del dengue son asintomáticas (algunos casos sintomáticos no buscan atención médica, por lo
tanto no pueden ser detectados por el sistema de vigilancia).
Como resultado, el estado de infección por el virus del dengue de algunas personas en el grupo sin dengue podría haberse clasificado
erróneamente.
Debido a que la incidencia del dengue era extremadamente baja en la mayor parte de Taiwán antes de 2011 y la seroprevalencia general de la infección
por el virus del dengue sigue siendo baja (sesgo de clasificación errónea del estado de exposición en este estudio debería ser muy pequeño).

No se pudo controlar varios factores de riesgo de leucemia (estilos de vida: tabaquismo, obesidad e ingesta dietética y exposiciones ambientales:
radiación, químicos y contaminación del aire).
Se incluyó varias enfermedades relacionadas con el estilo de vida y variables demográficas (sustitutos de los estilos de vida y las exposiciones
ambientales para el control de confusión).

Puntos débiles
No se permitió la exportación de datos individuales y resultados de menos de tres individuos para evitar la reidentificación. No se pudo informar
una descripción más detallada de los 19 posibles casos de leucemia asociada al virus del dengue.

Solo se identificaron 12.573 casos confirmados de dengue durante 10 años en Taiwán, y la incidencia de leucemia fue baja; por lo tanto, el número
de casos de leucemia que ocurrieron durante el período de seguimiento en el grupo de dengue fue bajo. Como resultado, los análisis adicionales
de la asociación entre la infección por el virus del dengue y los subtipos específicos de leucemia carecían de poder estadístico.
La leucemia es el cáncer más común en niños y la mayoría de los pacientes con dengue en países hiperendémicos también son niños. Sin embargo,
no se pudo examinar la asociación entre el dengue y la leucemia en niños porque menos del 10% de los casos de dengue eran niños en Taiwán.
Discusión
 Este estudio proporciona la primera evidencia epidemiológica de la asociación entre el virus del dengue y el riesgo de
leucemia. Los resultados deben validarse en otros países donde se disponga de bases de datos de información sanitaria
basadas en la población.
 Los mecanismos de los virus oncogénicos incluyen la integración del genoma viral en el genoma del huésped, la promoción de
la replicación de la célula del huésped, la inflamación crónica y la inmunosupresión.
 Se encontró un aumento de más de 3 veces en el riesgo de leucemia en general entre 3 y 6 años después de la infección por
el virus del dengue, pero no identificamos un subtipo de leucemia específicamente asociado con el virus del dengue.
 Se necesitan más estudios para verificar nuestros hallazgos e investigar cómo la infección por el virus del dengue puede
afectar y manipular los factores de transcripción en las células madre hematopoyéticas, y si existen otros mecanismos que
pueden contribuir al desarrollo de leucemia después de la infección por el virus del dengue.
 Los cánceres asociados a infecciones representan una parte significativa de la carga mundial de cáncer y son potencialmente
prevenibles mediante vacunas eficaces, programas de detección y otras medidas preventivas.
Objetivo 1: Caracterizar la respuesta inmune en sangre periférica de pacientes con infección aguda
por Dengue en diferentes estadios clínicos de la enfermedad, mediante citometría de flujo de
última generación.
- Proponen marcadores útiles para el estudio de
defectos numéricos y alteraciones en la
distribución relativa de las diferentes poblaciones y
subpoblaciones leucocitarias (células presentadoras de
antígeno, linfocitos T y B naive, pre-centro germinal, de
memoria (post-centro germinal) y efectoras,
plasmablastos, monocitos, etc.).
- Tubos de evaluación de células B y de isotipos IgH:

útiles para el estudio de estadios madurativos y para
la evaluación de defectos en la producción de
subclases de Igs.
- CMF estandarizada y validada, paneles >8 colores,

reproducible, altamente sensible, marcaje de millones
de células por muestra (Bulk lysis), procedimientos
operativos estándar y calibración y compensación de
equipos estandarizada.
- Bases de datos de pacientes con inmunodeficiencia.

LB pre-CG: vírgenes y transicionales
Unswitched: IgM+IgD+; IgM+; IgD+
Switched; LB memoria
Paciente con deficiencia en
STAT3:
Reducción de linfocitos T
vírgenes, ausencia de células
B-IgH-class switched y de
eosinófilos
Paciente con deficiencia

IL2RG: ausencia de células
T, células T vírgenes. células
B de memoria,
plasmablastos y NK.
- Caracterización de Subgrupos de LB con experiencia antigénica.
¿Puede el virus dengue inducir alteraciones fenotípicas, funcionales y clonalidad de LB?
¿Los extractos naturales pueden alterar el curso de la infección por virus dengue asociada con dengue grave?
Caracterizar la respuesta inmune en sangre periférica de pacientes con infección aguda por Dengue en diferentes estadios
clínicos de la enfermedad y la respuesta de Monocitos a fitomedicamentos in vitro.
mediante citometría de flujo de última generación.
1. Caracterizar la respuesta inmune en sangre periférica de pacientes con infección aguda por Dengue en diferentes estadios
clínicos de la enfermedad, mediante citometría de flujo de última generación.
2. Analizar el perfil de citocinas y quemoquinas en plasma de pacientes con Dengue en distintos estadios clínicos de la
enfermedad.
3. Identificar los marcadores inmunes más útiles que permitan monitorizar los pacientes con Dengue que progresan a fases
severas de la enfermedad.
Caracterizar la respuesta aguda de células D y monocitos en
Biología y desarrollo de las células B
Muchas líneas diferentes de ratones modificados genéticamente que llevan mutaciones de la línea germinal en genes inmunológicamente importantes eran y
siguen siendo indispensables para estudiar los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo, la selección y la respuesta de las células B. Sin embargo, la
comparación de mutantes de ratón con defectos genéticos correspondientes en sujetos humanos reveló diferencias significativas entre las células B humanas y
murinas con respecto a las fases tempranas de desarrollo, composición de subconjuntos y respuestas a antígenos. El desarrollo de células B humanas, por
ejemplo, no depende de IL-7, mientras que las mutaciones en genes como BTK y BLNK bloquean la maduración de las células pre-B humanas pero no
murinas. Los sujetos humanos, pero no los ratones, tienen células B MZ circulantes que llevan mutaciones somáticas inmediatamente después del
nacimiento, y los sujetos humanos tienen un gran compartimento de células B de memoria conmutadas de clase circulantes que es mucho más pequeño en
ratones adultos. Debido a que los primates y los roedores divergieron de un ancestro común hace al menos 65 millones de años, tales diferencias reflejan la
adaptación de los respectivos sistemas inmunológicos a las diferentes fisiologías, las diferentes vidas, el medio ambiente, los patógenos, los agentes
comensales, etc.
A pesar del aumento en el conocimiento sobre la biología de las células B humanas, aún quedan muchas preguntas básicas. Por ejemplo, ¿cómo deciden las
células B de GC si prefieren convertirse en células B de memoria conmutada o células plasmáticas? ¿Los diferentes subconjuntos de células B de memoria
conmutada tienen diferentes funciones en las respuestas inmunitarias? ¿Se convierten en células plasmáticas de vida corta o larga? ¿Qué señales de
supervivencia mantienen vivas las células B de memoria y las células plasmáticas durante décadas, o cómo podemos aprovechar las características de las
células B humanas para mejorar la vacunación? Con el ritmo actual de descubrir nuevos defectos genéticos y descifrar las funciones de sus productos
genéticos, podemos esperar poder comprender la biología de las células B humanas en un futuro cercano para fomentar el desarrollo de nuevas herramientas
que se dirijan específicamente a los linfocitos B disfuncionales para tratar autoinmunidad, neoplasias malignas de células B,
Las células B se desarrollan a partir de células precursoras hematopoyéticas en un proceso ordenado de maduración y selección. Los estudios exhaustivos con muchos mutantes de ratón
diferentes proporcionaron información fundamental sobre este proceso. Sin embargo, la caracterización de los defectos genéticos que causan inmunodeficiencias primarias fue esencial
para comprender la biología de las células B humanas. Los defectos en los componentes del receptor de células pre-B o en las proteínas de señalización aguas abajo, como la tirosina
quinasa de Bruton y la proteína enlazadora de células B, detienen el desarrollo en la etapa de células pre-B. Los defectos en las proteínas reguladoras de la supervivencia, como el
activador de células B del receptor de la familia TNF-α (BAFF-R) o la proteína 11 que contiene el dominio de reclutamiento de caspasas (CARD11), interrumpen la maduración y evitan
la diferenciación de las células B de transición en la zona marginal y células B foliculares. Subconjuntos de células B maduras, respuestas inmunes, y el desarrollo de células B de
memoria y células plasmáticas se ve afectado por mutaciones que afectan la señalización del receptor tipo Toll, correceptores del receptor de antígeno de células B (p. ej., CD19) o
enzimas responsables de la recombinación de cambio de clase de inmunoglobulina. Los modelos de ratones transgénicos ayudaron a identificar mecanismos reguladores clave, como la
edición de receptores y la anergia clonal, evitando la activación de células B que expresan anticuerpos que reconocen autoantígenos. Sin embargo, la combinación de antecedentes
genéticos susceptibles con el rescate de células B autorreactivas por células T permite la generación de clones autorreactivos encontrados en pacientes con muchas enfermedades
autoinmunes e incluso en aquellos con inmunodeficiencias primarias.
Las células B y sus anticuerpos son los elementos centrales de la inmunidad humoral y protegen, como parte del sistema inmunológico adaptativo, contra una variedad casi ilimitada de
patógenos. Los defectos en el desarrollo, la selección y la función de las células B conducen a autoinmunidad, malignidad, inmunodeficiencias y alergia. Combinado con el enorme
aumento en el conocimiento sobre la función de los genes y la diversidad genética de los sujetos humanos que se ha desarrollado desde que se descifró el genoma humano, las
inmunodeficiencias primarias son una fuente de mutaciones aún en crecimiento, brindando oportunidades únicas para estudiar la función del sistema inmunológico humano. . Además,
cada inmunodeficiencia recién descubierta representa un nuevo desafío para desarrollar las formas de tratamiento más óptimas y personalizadas.
En esta revisión, analizamos el desarrollo de las células B humanas (Fig. 1) a la luz de los defectos genéticos descubiertos mediante el estudio de las inmunodeficiencias primarias. Al
señalar las diferencias y las características comunes con los modelos de ratón correspondientes, proporcionamos una descripción general de los mecanismos que regulan la maduración, la
supervivencia y la selección de los linfocitos B en las respuestas protectoras y autoinmunes.
Fig. 1 Desarrollo de células B y subconjuntos de células B. Las células B se desarrollan en la BM a partir de células
precursoras hematopoyéticas (HSC). Gen activador de la recombinación (RAG) 1/2 El reordenamiento dependiente
de la cadena H, el gen D y los segmentos del gen J de la línea germinal (GL) comienza en la etapa pro-célula B.
El reordenamiento del segmento del gen V sigue en la etapa temprana de células pre-B.
En CD10 + CD19 +Las células pre-B, las cadenas H funcionales (VDJ-Cμ) se emparejan con V-preB y similares a λ,
formando la pre-BCR, que se expresa dentro de una célula y no se detecta en la superficie. Las señales inducidas
por pre-BCR desactivan la expresión de RAG, evitando el reordenamiento del segundo alelo de la cadena H e
induciendo la proliferación.
A continuación, los genes RAG se reexpresan para iniciar el reordenamiento VJ de las cadenas L. Las cadenas L κ
o λ reorganizadas con éxito reemplazan V-preB / λ5 del par pre-BCR con la cadena H y forman IgM.
La IgM expresada por células B inmaduras cambia el patrón de expresión de muchos genes e inicia la salida a la
circulación.
Las células B inmaduras ingresan al bazo como células B de transición, donde reciben señales de supervivencia a
través de BAFF-R y completan la primera etapa de desarrollo como células B MZ o células B foliculares, según la
especificidad de su BCR. Las células BH, las células MZ B se convierten en células plasmáticas de vida corta. Las
células B foliculares se activan mediante la unión de antígenos y se desarrollan en GC con el apoyo de células TH en
células B de memoria (CSR +) o células plasmáticas (PC).
La activación de las células B induce AID y otros componentes de la maquinaria SHM / cambio de clase, cambiando
así la afinidad del BCR y el isotipo (IgM a IgG, IgA o IgE).
Desarrollo temprano de células B en la médula ósea
En sujetos humanos adultos, como en todos los mamíferos, los linfocitos B se desarrollan en la médula ósea (MO) a partir de células precursoras hematopoyéticas. Durante la vida
embrionaria, la MO es sembrada por células madre hematopoyéticas que se desarrollan en el hígado fetal. Sus células precursoras se originan en la aorta-gónada-mesonefros, que
está formado por descendientes del mesodermo. Las etapas tempranas del desarrollo de células B dependientes de BM se estructuran a lo largo del proceso de reordenamiento
funcional de los segmentos del gen de inmunoglobulina. V H, DH y JH, los reordenamientos de la cadena pesada (cadena H) junto con los reordenamientos VL-JL de los segmentos
génicos de la cadena ligera (cadena L) generan un repertorio de células B que expresan anticuerpos capaces de reconociendo más de 5x10 13 antígenos diferentes.
Según el reordenamiento de los segmentos génicos de la cadena H y de la cadena L, se definen 3 etapas de desarrollo.
En la primera etapa, las células pro-B reorganizan los segmentos D y J de la cadena H, seguido de un segundo reordenamiento que une una región V aguas arriba con el segmento
DJ reorganizado.
• El reordenamiento funcional de los segmentos génicos de la cadena μ-H abre la entrada a la siguiente fase, la etapa de pre-células B. En sujetos humanos, las células pre-B se
someten a 1 o 2 divisiones celulares y reorganizan los segmentos génicos que codifican las cadenas κ y λ.
• Combinada con la cadena μ, se forma una molécula de IgM y se expresa en la superficie celular. Estas células se denominan células B inmaduras.
• Las células B inmaduras abandonan la MO y migran al bazo, donde finalizan el desarrollo temprano al diferenciarse en células B vírgenes, foliculares o de zona marginal (MZ).
Teniendo en cuenta la enorme diversidad de especificidades de los anticuerpos, el primer desafío del sistema inmunológico es encontrar un equilibrio entre las especificidades
variables contra los patógenos y, al mismo tiempo, evitar la autorreactividad. Por lo tanto, las células B se examinan en varios puntos de control durante el desarrollo para
determinar su grado de autorreactividad. La primera pantalla tiene lugar después de la diferenciación de pro-B en células pre-B.
• La expresión de la cadena μ-H reordenada productivamente, de las cadenas L sustitutas (en sujetos humanos compuestas por λ-like y V-preB), y de los componentes
transductores de señales Ig-α e Ig-β permite la formación de el llamado complejo del receptor de antígeno de células pre-B (BCR). El pre-BCR tiene 2 tareas. La primera tarea es
detener las actividades y la expresión de la maquinaria enzimática que cataliza los reordenamientos de los segmentos de genes de la cadena H, un proceso denominado
exclusión alélica.
• Esto evita la expresión de 2 cadenas H con 2 especificidades diferentes por la misma célula. La segunda tarea es iniciar el reordenamiento de
los genes de la cadena L.
• Varios defectos genéticos que afectan a componentes de las proteínas de señalización pre-BCR o aguas abajo han sacado a la luz el desarrollo
de células B humanas y han descubierto diferencias fundamentales en la linfopoyesis de células B entre ratones y sujetos humanos. En sujetos
humanos, por ejemplo, mutaciones en genes que codifican componentes de la cascada de señalización de IL-7 , como el receptor de IL-2
común γ, la cadena α del receptor de IL-7, o la cinasa asociada Janus cinasa 3, no afectan el compartimento de las células B, pero interrumpen
el desarrollo de las células T, lo que conduce a una inmunodeficiencia combinada grave (B + T -inmunodeficiencia combinada grave).
• Bruton tirosina quinasa (BTK), un componente de señalización central aguas abajo del pre-BCR y el BCR, vincula la activación del pre-BCR y el
BCR al influjo de Ca 2+, la activación de la cascada de la proteína quinasa activada por mitógenos y los cambios en la actividad de los factores de
transcripción, incluido el factor nuclear κB (NF-κB).
• A diferencia de los ratones, el desarrollo de células B humanas en la BM depende en gran medida de la actividad de BTK. Hasta el 90% de los
pacientes que reciben un diagnóstico de hipogammaglobulinemia de inicio temprano portan mutaciones en el gen BTK ubicado en el
cromosoma X (agammaglobulinemia ligada al cromosoma X).
• En lactantes y adultos, la falta de células B de sangre periférica conduce a títulos de anticuerpos de todos los isotipos muy reducidos. El análisis
de muestras de MO de pacientes con agammaglobulinemia ligada al cromosoma X reveló niveles normales de los primeros progenitores de
células B, mientras que las células citoplasmáticas Ig-μ + pre-B mostraron anomalías en el número y la proliferación de células.
• Por el contrario, los ratones que carecen de Btk tienen una reducción más leve en el número de células B periféricas y títulos de
anticuerpos IgG 1 , IgG 2a , IgG 2b e IgA cercanos a los normales ; sólo se demostró una reducción significativa de los niveles de IgM e IgG 3 en
suero.
• Por lo tanto los ratones en un Btk fondo deficientes son todavía capaces de montar respuestas inmunes humorales. Al igual que BTK, los defectos en la
proteína enlazadora de células B (BLNK; SLP65) tienen resultados diferentes en sujetos humanos y ratones. La deleción de Blnk en ratones inhibe el
desarrollo de linfocitos B en la etapa de pequeñas células pre-B, pero debido a que el bloqueo es permisivo, las células B deficientes en Blnk pueblan los
tejidos linfoides periféricos en ratones adultos y generan respuestas inmunitarias dependientes de las células T.
• En sujetos humanos, las células B deficientes en BLNK detienen el desarrollo en la etapa de células pro-B, lo que resulta en un fenotipo muy similar a la
deficiencia de BTK. Las células B circulantes están casi ausentes y las concentraciones séricas de IgM e IgA son menores que los niveles de
detección. Además, la falta de función BLNK / SLP65 en ratones pero no en sujetos humanos promueve la proliferación de células pro-B / pre-BI y el
desarrollo espontáneo de leucemia linfoblástica aguda de células pre-B. Debido a que BLNK / SLP65 y BTK son elementos críticos de la función pre-BCR,
las señales inducidas por el pre-BCR en sujetos humanos inducen el desarrollo de pre-células B e inhiben el reordenamiento del segundo alelo de la cadena H
al mismo tiempo. En ratones, las señales derivadas de pre-BCR también inhiben la proliferación de células pre-B impulsada por IL-7.
• La señalización de BCR ha recibido la máxima atención clínica no solo porque la mayoría de los defectos monogenéticos en pacientes con
agammaglobulinemia y diferentes hipogammaglobulinemias se han identificado en esta vía, sino también porque el inhibidor específico de la señalización de
BCR ibrutinib (PCI-32765), un inhibidor de BTK, está a punto de revolucionar no solo el tratamiento de los linfomas de células B pero también podría
resultar beneficioso en las enfermedades autoinmunes provocadas por las células B.
• En términos generales, las causas de todas las deficiencias de anticuerpos que surgen de afecciones con discrasia de células B nos enseñarán sobre la biología
de las células B, que a su vez podrían convertirse en los principales objetivos para los hematólogos que tratan las neoplasias malignas de las células B.
• Sin embargo, las mutaciones que afectan a las proteínas del complejo BCR, como la cadena μ, Ig-α e Ig-β, conducen a fenotipos similares en ratones y seres
humanos. Los pacientes con una deleción de la cadena μ presentan hipogammaglobulinemia grave causada por un bloqueo en el desarrollo temprano de las
células B. Aunque las células pro-B están presentes en niveles normales, los pacientes carecen de células pre-B en la MO y, en consecuencia, todos los
subconjuntos de células B maduras en la periferia, lo que es similar a lo que se observa en ratones con una deleción de la μ- cadena.
• De manera similar, el desarrollo de células B se detiene en la etapa pro-células B en pacientes con mutaciones nulas en genes que codifican Ig-α (CD79a). e Ig-β
(CD79b).
• Una mutación sin sentido en el gen CD79B da como resultado una sustitución de aminoácidos cerca de un residuo de cisteína, evitando así la formación del enlace
disulfuro entre Ig-β e Ig-α y el ensamblaje de un pre-BCR funcional. Fenotípicamente, el defecto da como resultado una linfopenia grave de células B con menos del
0,1% de células B periféricas.
• Recientemente, se demostró que una deleción homocigótica de la proteína 11 que contiene el dominio de reclutamiento de caspasa del componente de señalización
BCR cadena abajo (CARD11) da como resultado una deficiencia de anticuerpos al bloquear la diferenciación de las células B. CARD11 interactúa con el linfoma de
células B 10 (BCL10) y la proteína de translocación de linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas 1 (MALT1) y funciona en la vía de señalización activando el NF-κB
canónico después de la participación de BCR.
• Curiosamente, el trabajo realizado en ratones ha demostrado que CARD11 actúa también como modulador de la tolerancia de las células B
• porque mutaciones puntuales en Card11 equivalentes a las encontradas en linfomas de células B inducen la proliferación de células B autorreactivas en lugar de
apoptosis.
• Aunque las mutaciones que afectan a los componentes principales de la maquinaria de señalización de BCR, como la cadena μ, Ig-α, Ig-β y BTK, conducen a un
bloqueo del desarrollo de las células B tempranas en la BM, las mutaciones en los genes que codifican los componentes de la B Se ha demostrado que el complejo
correceptor -celular es menos severo. Sujetos humanos que carecen de CD19, CD21, o CD81 mostró un número normal de células B en la periferia. Sin embargo,
la maduración de la afinidad y las respuestas de anticuerpos se vieron afectadas, lo que provocó hipogammaglobulinemia y una mayor susceptibilidad a las
infecciones.
• Sinopsis: Existen diferencias notables entre el desarrollo de células B murinas y humanas. A diferencia de las células pre-B murinas, los precursores de células B
humanas no dependen de IL-7 como factor de crecimiento de células pre-B, mientras que las mutaciones en genes que codifican componentes aguas abajo de la
señalización pre-BCR bloquean completamente el desarrollo en la BM. Las mutaciones en los genes correceptores de BCR alteran las respuestas inmunitarias
humorales y aumentan la susceptibilidad a las infecciones bacterianas. Los inhibidores de la señalización de BCR son nuevas terapias prometedoras para tratar las
neoplasias malignas de las células B y las enfermedades autoinmunes dependientes de las células B.
Salida de la médula ósea y guía a los órganos linfoides secundarios
• Al circular por el cuerpo a través del torrente sanguíneo y la linfa, las células B visitan regularmente los órganos linfoides secundarios, como el bazo,
los ganglios linfáticos, las amígdalas, las placas de Peyer y los tejidos de las mucosas. El desplazamiento hacia los folículos de células B, la formación
de centros germinales (GC) y la salida de los tejidos de regreso a la circulación están reguladas por moléculas de adhesión y por la interacción entre
diferentes receptores acoplados a proteína G. Aunque los receptores de quimiocinas responden a un gradiente de quimiocinas producidas por las
células del estroma tisular, los receptores de esfingosina-1-fosfato (S1P) reaccionan contra S1P. S1P es un mediador lipídico multipotente sintetizado
por plaquetas, eritrocitos, y células endoteliales vasculares.
• Las concentraciones altas de S1P en sangre y linfa atraen a las células B e inducen la salida de los tejidos linfoides, donde las concentraciones de S1P
son bajas.
• Los modelos de ratón con genes del receptor S1P suprimidos han demostrado que la salida de las células B inmaduras de la BM está regulada en parte
por el receptor 1 S1P. Los ratones knockout del receptor 1 de S1P tienen menos células B de transición circulantes, mientras que la cantidad de células
B inmaduras en la BM aumenta, donde permanecen más tiempo. Se demostró que el receptor cannabinoide 2 (CNR2) desempeña un papel en la
retención sinusoidal de células B inmaduras en la BM. Los antagonistas de CNR2 desplazaron a las células B inmaduras de los sinusoides y, además, la
deficiencia de CNR2 en ratones resultó en una reducción en el número de células B λ + en la periferia, principalmente porque las células B inmaduras
en la BM tenían menos tiempo para reordenamientos secundarios de su L- genes de cadena. Después de salir de la BM, los linfocitos B se dirigen al
bazo. Aquí las células B pueblan nichos para formar el MZ y el compartimento folicular de células B. Se demostró que el posicionamiento de las células
en el MZ de los ratones está guiado por la expresión de CNR2. Los ratones deficientes en CNR2 tienen menos células B MZ. Los antagonistas de los
endocannabinoides fueron capaces de agotar las células B de la MZ, y viceversa , la sobreexpresión de las células B guiadas por CNR2 hacia la MZ.
•
• Sinopsis : En ratones, los receptores acoplados a la proteína G, como los receptores S1P y CNR2, regulan la salida de las células B de la BM, así como el
posicionamiento en los folículos de las células B y la MZ esplénica.
Células MZ B, receptores tipo Toll y remodelación citoesquelética
• Las respuestas humorales independientes de las células T son montadas por las células B de la MZ y la mucosa. En el bazo, las células MZ B son la primera línea de defensa contra los patógenos transmitidos por la sangre. Durante los primeros
3 días de una infección, se convierten rápidamente en células plasmáticas extrafoliculares que secretan IgM, que forma complejos inmunes con el patógeno. Las células B humanas MZ expresan IgM que porta hipermutaciones
somáticas (SHM) dentro de las regiones variables y recirculan, mientras que sus contrapartes murinas tienen regiones variables no mutadas y permanecen en el bazo.
• Varios hallazgos indican que el SHM en regiones variables de IgM de células B MZ humanas se origina independientemente de la expansión clonal dirigida por antígeno en GC. Primero, los niños pequeños muestran una mayor diversidad
clonal en el subconjunto MZ que en las células B conmutadas.
• En segundo lugar, el compartimento MZ que se encuentra en niños menores de 2 años muestra la expresión de niveles bajos de citidina desaminasa inducida por activación (AID) , una enzima crítica para SHM, mientras que la expresión de
AID no se detectó en células MZ B de bazos adultos. En tercer lugar, aunque su número es reducido, las células MZ B se encuentran en pacientes con defectos genéticos en los genes CD40LG o CD40 que codifican 2 moléculas esenciales para
las reacciones GC dependientes de células T H.
• Por tanto, se propuso que las células MZ B se desarrollen y muten durante los primeros años de edad independientemente de las respuestas inmunitarias. Recientemente, se demostró que las células B MZ humanas dependen en gran
medida del gen 88 de respuesta primaria de diferenciación mieloide (MyD88), la quinasa 4 asociada al receptor de IL-1 (IRAK4) y la proteína adaptadora que contiene el dominio del receptor de Toll-IL-1 (TIRAP). ), que son componentes de
señalización descendentes de muchos receptores tipo Toll (TLR).
• Sin embargo, no se encontraron anomalías en el número de células B MZ en pacientes con mutaciones en el IFN-β (TRIF) que induce el adaptador que contiene el dominio del receptor de IL-1 tipo Toll y el 93B descoordinado
(UNC93B). Ambos factores son esenciales para la señalización a través de TLR ubicados en endosomas, como TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9. Por lo tanto, los autores postularon que el desarrollo, la homeostasis o ambos de las células B MZ
humanas podrían depender de las señales transmitidas por TIRAP inducidas por los TLR expresados en la superficie celular, como el TLR10.
• Dos estudios de pacientes con inmunodeficiencias severas han descubierto al dedicador de la citocinesis 8 (DOCK8) como un factor importante para la generación de respuestas inmunes humorales.
• DOCK8 es un factor de intercambio de guanina que interactúa directamente con la proteína de control de la división celular Rho GTPasa 42 (cdc42), un componente crítico de las vías de señalización que regulan la morfología celular y
división. Las manifestaciones clínicas relacionadas con la deficiencia de DOCK8 se caracterizan por una susceptibilidad muy aumentada a las infecciones bacterianas y al aumento de los niveles de IgE, lo que resulta en un síndrome de hiper-
IgE.
• Los pacientes con deficiencia de DOCK8 carecen de células B MZ, no producen anticuerpos protectores después de la vacunación y tienen un número extremadamente bajo de células B de memoria conmutada. Además del papel de DOCK8
como factor de intercambio de nucleótidos de guanina que regula la remodelación citoesquelética y la formación de sinapsis inmunológica, recientemente se demostró que DOCK8 se asocia con MyD88 y sirve como un adaptador en la vía de
señalización TLR9 en las células B. Debido a que la proliferación de células B se vio afectada en las células B deficientes en DOCK8 después de TLR9 pero no después de la coestimulación de CD40, DOCK8 podría ser más importante para las
respuestas de células B independientes de T que para las dependientes de T.
• Además de DOCK8, se demostró que otro regulador de la reorganización citoesquelética, denominado L-plastina, es esencial para el desarrollo de células B MZ murinas.
• Además de una reducción superior al 80% en el número de células B MZ, los ratones Lpl - / - tienen solo el 60% de células B foliculares. Como proteína de unión a actina, la L-plastina desempeña un papel en la señalización de BCR, así como en
el posicionamiento dirigido por S1P de las células B en la zona MZ. Otro defecto que perturba la organización citoesquelética y las respuestas de las células B es causado por mutaciones en el gen WAS, lo que resulta en el síndrome de
Wiskott-Aldrich (WAS). Debido a que codifica un regulador crítico de la polimerización de actina, las mutaciones en WAS dan como resultado una migración defectuosa de las células B y la ruptura de la tolerancia de las células B.
• Por lo tanto, además de la inmunodeficiencia, los pacientes con WAS también tienen autoinmunidad. Debido a que las células MZ B se desplazan en respuesta a S1P y señales de quimiocinas entre los folículos y la MZ,
Las mutaciones WAS inhiben el desarrollo y mantenimiento de las células B MZ.
•
• Sinopsis: Las células MZ B forman una primera línea de defensa contra los patógenos transmitidos por la sangre y provocan una respuesta inmune independiente de T. En sujetos humanos, las mutaciones en los componentes de señalización
de TLR alteran las respuestas de las células B MZ.
Sobrevivir en la periferia
El activador de células B de la familia TNF-α y un sistema de ligandos que induce la

proliferación
La supervivencia de las células B en la periferia depende de la expresión de un BCR

funcional y de las señales generadas por la unión del activador de células B de la familia
TNF-α (BAFF) al receptor BAFF (BAFF-R). Durante la maduración de las células B, BAFF-R
se expresa primero por las células B inmaduras en la BM. Además de BAFF-R, BAFF se une
a 2 receptores denominados activador transmembrana, modulador de calcio e interactor
del ligando de ciclofilina (TACI) y factor de maduración de células B (BCMA). Estos 3
receptores forman un sistema ligando-receptor que incluye al ligando homólogo un
ligando inductor de proliferación (APRIL). APRIL, en contraste con BAFF, se une solo a TACI
y BCMA pero no interactúa con BAFF-R ( Fig 2 ).
Fig. 2 Cascadas de señalización de BCR y BAFF-R en células B. La unión del antígeno a la
IgM de superficie induce cambios conformacionales en el BCR, incluidos los componentes de
señalización Ig-α (CD79A) e Ig-β (CD79B). Los cambios conformacionales permiten la unión
de las tirosinas quinasas, como la tirosina quinasa del bazo (SYK), e inicia varias cascadas de
señalización clave compuestas por reacciones de procesamiento y fosforilación de
proteínas. La tirosina quinasa del bazo fosforila Ig-α / Ig-β y la proteína adaptadora SLP65
(BLNK), que sirve como andamio para otros sustratos, incluido BTK. Fosforilación de
sustratos posteriores, incluida la fosfatidilinositol-4.5 bisfosfato 3-quinasa (PI3K) y la
fosfolipasa C (PLCγ2), activa factores de transcripción posteriores, como NF-κB1, factor
nuclear de células T activadas (NFAT) y factor de respuesta sérica (SRF). AKT (PKB) induce la
síntesis de proteínas y la aptitud celular, prolongando la supervivencia celular. Las señales de
BCR activan la esfingosina quinasa 1 (SPHK1). La enzima fosforila la esfingosina (Sph), un
metabolito de la esfingomielina lipídica de la membrana, para generar S1P, que es requerida
por el factor 2 asociado al receptor de TNF (TRAF2) como cofactor. BAFF se une a BAFF-R y
con menor afinidad a TACI y BCMA, mientras que APRIL solo se une a TACI y BCMA. BAFF-R
es expresado por todas las células B, TACI por MZ y células B de memoria, y BCMA por
células B activadas y plasmáticas. La vía alternativa NF-κB se activa mediante la unión de
BAFF a BAFF-R. Los cambios conformacionales de BAFF-R promueven la unión de TRAF y
permiten la liberación de la quinasa inductora de NF-κB (NIK). NIK activa el inhibidor de NF-κB
quinasa α (IKKα), que fosforila NF-κB2 p100. La p100 fosforilada se procesa por ubiquitinación
en la forma activa p52, que se ensambla con relB en un activador transcripcional que regula
positivamente los genes de supervivencia. La señalización de BAFF-R también induce AKT y
síntesis de proteínas, aumentando así la aptitud celular. TROZO DE CUERO,
Diacilglicerol; IP3, inositol-1,4,5-trifosfato; MALT, proteína de translocación de linfoma de tejido
linfoide asociada a mucosas; MAPK, proteína quinasa activada por mitógenos; mTOR, diana
de la rapamicina en mamíferos; PKC , proteína quinasa C.
• La expresión de BAFF-R aumenta cuando las células B de transición se diferencian en células MZ y B foliculares. Sin embargo, BAFF-R no se encuentra en las células plasmáticas de larga
vida en la BM, que expresan BCMA, mientras que TACI es expresado por células B de la MZ y células B de memoria conmutada. El papel de BAFF-R en la supervivencia de las células B se
demostró por primera vez en ratones. La función principal de BAFF-R es proporcionar señales de supervivencia para las células B maduras e inmaduras. Los ratones con una deleción en
los genes Baff-r o Baff mostraron una marcada reducción en el número de células B y un bloqueo del desarrollo en la etapa T2 de transición. La producción de anticuerpos específicos fue baja
en ratones deficientes en BAFF-R, pero aumentó después de la inmunización con antígenos independientes de células T y dependientes de células T.
• El fenotipo de los ratones deficientes en BAFF-R es menos severo que en los ratones Taci - / - porque muestran una sólida respuesta de anticuerpos independiente de las células T que puede ser
mantenida por TACI. Como reflejo del papel principal de BAFF-R en la supervivencia, la sobreexpresión de Bcl2 transgénico en ratones Baff-r - / - permitió el desarrollo de células B maduras.
En sujetos humanos, la deficiencia de BAFF-R se descubrió mediante el cribado de pacientes con inmunodeficiencia común variable (IDCV) con un número bajo de células B. Además de una
fuerte linfopenia de células B, el fenotipado de células B reveló un aumento relativo en el número de células B de transición. La fuerte reducción en el número de células B de memoria
conmutada y MZ estuvo acompañada de niveles reducidos de IgM e IgG en suero y respuestas inmunes independientes de las células T deterioradas contra los polisacáridos neumocócicos. A
diferencia de otros pacientes con IDCV, los niveles séricos de IgA eran normales y se encontraron células plasmáticas IgA + en el intestino. Asimismo, los ratones Baff - / - tienen niveles
normales de IgA. En contraste con la deficiencia de BAFF-R, la deleción de Taci o abril en ratones y mutaciones en el gen TNFRSF13B que codifica TACI en sujetos humanos han reducido
significativamente los niveles de IgA. Por tanto, parece que las concentraciones séricas de IgA dependen de las interacciones funcionales TACI-APRIL.
• La deficiencia de TACI también se asocia con inmunodeficiencia humoral, como se documenta por una disminución grave de las respuestas inmunitarias independientes de las células T a los
antígenos polisacáridos. En consecuencia, TACI se expresa en subconjuntos de células B MZ, que responden fuertemente a los antígenos de tipo II independientes de las células T. Debido a
que los ratones deficientes en TACI tienen un gran número de células B, se propuso que TACI actúa como un regulador negativo de la supervivencia de las células B. De acuerdo con esto, los
ratones deficientes en TACI tienden a tener trastornos linfoproliferativos y enfermedades autoinmunes con títulos altos de autoanticuerpos.
• Los pacientes con IDCV comparten características inmunológicas de los ratones Taci - / - , que incluyen inmunodeficiencia, linfoproliferación y autoinmunidad. De hecho, entre el 5% y el 10%
de los pacientes con IDCV portan al menos una mutación de la línea germinal en TACI.
• La expresión de BAFF-R aumenta cuando las células B de transición se diferencian en células MZ y B foliculares. Sin embargo, BAFF-R no se encuentra en las células plasmáticas de larga vida en la BM, que expresan BCMA, mientras que TACI es expresado
por células B de la MZ y células B de memoria conmutada. El papel de BAFF-R en la supervivencia de las células B se demostró por primera vez en ratones. La función principal de BAFF-R es proporcionar señales de supervivencia para las células B
maduras e inmaduras. Los ratones con una deleción en los genes Baff-r o Baff mostraron una marcada reducción en el número de células B y un bloqueo del desarrollo en la etapa T2 de transición. La producción de anticuerpos específicos fue baja en
ratones deficientes en BAFF-R, pero aumentó después de la inmunización con antígenos independientes de células T y dependientes de células T.
• El fenotipo de los ratones deficientes en BAFF-R es menos severo que en los ratones Taci - / - porque muestran una sólida respuesta de anticuerpos independiente de las células T que puede ser mantenida por TACI. Como reflejo del papel principal de
BAFF-R en la supervivencia, la sobreexpresión de Bcl2 transgénico en ratones Baff-r - / - permitió el desarrollo de células B maduras. En sujetos humanos, la deficiencia de BAFF-R se descubrió mediante el cribado de pacientes con inmunodeficiencia
común variable (IDCV) con un número bajo de células B. Además de una fuerte linfopenia de células B, el fenotipado de células B reveló un aumento relativo en el número de células B de transición. La fuerte reducción en el número de células B de
memoria conmutada y MZ estuvo acompañada de niveles reducidos de IgM e IgG en suero y respuestas inmunes independientes de las células T deterioradas contra los polisacáridos neumocócicos. A diferencia de otros pacientes con IDCV, los niveles
séricos de IgA eran normales y se encontraron células plasmáticas IgA + en el intestino. Asimismo, los ratones Baff - / - tienen niveles normales de IgA. En contraste con la deficiencia de BAFF-R, la deleción de Taci o abril en ratones y mutaciones en
el gen TNFRSF13B que codifica TACI en sujetos humanos han reducido significativamente los niveles de IgA. Por tanto, parece que las concentraciones séricas de IgA dependen de las interacciones funcionales TACI-APRIL.
• La deficiencia de TACI también se asocia con inmunodeficiencia humoral, como se documenta por una disminución grave de las respuestas inmunitarias independientes de las células T a los antígenos polisacáridos. En consecuencia, TACI se expresa en
subconjuntos de células B MZ, que responden fuertemente a los antígenos de tipo II independientes de las células T. Debido a que los ratones deficientes en TACI tienen un gran número de células B, se propuso que TACI actúa como un regulador
negativo de la supervivencia de las células B. De acuerdo con esto, los ratones deficientes en TACI tienden a tener trastornos linfoproliferativos y enfermedades autoinmunes con títulos altos de autoanticuerpos.
• Los pacientes con IDCV comparten características inmunológicas de los ratones Taci - / - , que incluyen inmunodeficiencia, linfoproliferación y autoinmunidad. De hecho, entre el 5% y el 10% de los pacientes con IDCV portan al menos una mutación de la
línea germinal en TACI.
• Las células B de pacientes con deficiencia de TACI no inician la recombinación de cambio de clase (CSR) cuando se cocultivan con APRIL o BAFF. Los títulos bajos de anticuerpos IgA e IgG en pacientes con deficiencia de TACI subrayan el papel de este
receptor en la RSC en sujetos humanos. La ausencia de anticuerpos IgG específicos de polisacáridos de la pared celular neumocócica en algunos pacientes con deficiencia de TACI también respalda el papel de TACI en las respuestas inmunitarias a los
patógenos transmitidos por la sangre. También se ha sugerido que la disminución del número de receptores de unión a BAFF causada por la ausencia de TACI da lugar a una unión de BAFF más circulante a BAFF-R, lo que favorece la supervivencia de las
células B. En sujetos humanos, se demostró recientemente que el número de sitios de unión de BAFF puede regular las concentraciones de BAFF en estado estacionario. Los altos niveles de BAFF, como lo demuestran los ratones transgénicos BAFF,
aumentan el número de células B maduras y conducen a una enfermedad autoinmune progresiva similar al lupus eritematoso sistémico. En el bazo humano, las áreas que rodean la MZ están colonizadas por un subtipo especial de neutrófilos
denominados neutrófilos auxiliares de células B (células N BH ), que son distintos de sus homólogos circulantes, las células N C. La colonización de MZ con células N BH se produce a través de una vía no inflamatoria en ausencia de
infección. Las células N BH proporcionan una estructura que interactúa con las células B MZ que facilita la producción de anticuerpos y SHM mediante la activación de las células B MZ con APRIL y BAFF. A diferencia de las células T H , que apoyan a las
células B foliculares en la reacción GC, las células N BH inducen una potente respuesta extrafolicular de células B contra antígenos independientes de las células T. En consecuencia, los pacientes con neutropenia congénita tenían menos células B MZ con
menos SHM. El papel de BCMA como factor de supervivencia de las células plasmáticas aún no está claro. Originalmente, se describió que los ratones con deficiencia de BCMA tenían un compartimento de células B normal. Sin embargo, la supervivencia
de las células plasmáticas de larga vida se vio afectada. En un entorno deficiente en Fas / CD95, los ratones Bcma - / - tienen un síndrome linfoproliferativo mortal causado por un enorme aumento de las células plasmáticas de vida corta y larga. Las
características patológicas incluyen títulos elevados de autoanticuerpos contra el antígeno nuclear, el factor reumatoide y el depósito de inmunocomplejos. De manera similar a los ratones Bcma - / -, los ratones Fas - / - Bcma - / - tenían un menor número de
células plasmáticas de BM. Por lo tanto, BCMA podría tener una función dual. Debido a que BCMA se regula al alza rápidamente junto con Fas en las células B activadas, ambos receptores parecen controlar sinérgicamente la proliferación y selección de
células B en la reacción de GC. Sin embargo, en el BMCA, el BMCA podría actuar como un factor de supervivencia para las células plasmáticas de larga vida. Sinopsis: La supervivencia de los linfocitos B depende de la señalización de BAFF-R porque la
deficiencia de BAFF-R bloquea el desarrollo de las células B en la etapa de células B de transición. Las mutaciones en el receptor relacionado TACI perjudican el desarrollo de células plasmáticas secretoras de IgA e IgG y promueven la
linfoproliferación. Las células N BH que rodean la MZ esplénica son críticas para la producción de BAFF y APRIL, 2 ligandos similares a TNF que se unen a BAFF-R y TACI, respectivamente.
Desarrollo y mantenimiento de células B de memoria y células plasmáticas.
• Desarrollo y mantenimiento de células B de memoria y células plasmáticas.

• Los estudios con sobrevivientes de la pandemia de influenza de 1918 han demostrado que las células B de memoria específicas de antígeno pueden persistir durante décadas en ausencia de antígeno.
• La activación de linfocitos B dependiente de linfocitos T inducida por antígenos tiene lugar en GC en el bazo y los ganglios linfáticos y conduce al desarrollo de linfocitos B de memoria conmutada y plasma.
• La activación de las células B en los GC aumenta la AID. La enzima desamina los residuos de citidina en el ADN, generando así residuos de uracilo, que están marcados por la uracilo-N-glicosilasa (UNG) para ser reconocidos por las enzimas reparadoras. Este proceso es parte de la maquinaria enzimática que
genera SHM en la región variable del gen de inmunoglobulina expresado.
• Las hipermutaciones en las regiones variables aumentan o disminuyen la afinidad de los anticuerpos por el antígeno. Por tanto, representan, además del reordenamiento del gen de inmunoglobulina en la MO, un segundo paso de diversificación. Esto ha evolucionado para transformar anticuerpos con
afinidades intermedias o bajas en herramientas altamente específicas contra antígenos patógenos. Paralelamente, las inmunoglobulinas cambian sus funciones efectoras al reemplazar la región constante de IgM por las de IgG, IgA o IgE. Este proceso, denominado inmunoglobulina CSR, es catalizado por
componentes de la maquinaria SHM, incluyendo AID y enzimas del complejo de unión de extremos no homólogos. En última instancia, las células GC B se convierten en células B de memoria de larga duración o células plasmáticas. Pueden residir en órganos linfoides secundarios o migrar al BM. También se
muestra por inmunodeficiencias humorales,
• UNG, y la segregación posmeiótica aumentó 2 (PMS2). Como lo demuestran las inmunodeficiencias humorales, se requieren otros componentes y pares de receptor-ligando para interacciones exitosas de células B / T, como CD40, Ligando CD40, o coestimulador inducible, que se expresa en las células
T H foliculares. De manera similar a estos defectos genéticos definidos, los pacientes con IDCV con deterioro del desarrollo de células plasmáticas casi no tienen células B de memoria conmutada. Esto sugiere que el desarrollo de células de memoria conmutadas está íntimamente relacionado con el desarrollo
de células plasmáticas. Sin embargo, todavía se desconoce dónde se ramifican exactamente las células B de memoria conmutada en el camino hacia el desarrollo de células plasmáticas.
• El compartimento de las células B de la memoria humana es mucho menos uniforme de lo que se pensaba originalmente. Una publicación reciente ha definido la existencia de varios subconjuntos de células B de memoria que se diferencian de 3 orígenes diferentes.
• El origen de las células B de memoria CD27 - IgG + es el bazo, mientras que las células B de memoria CD27 + IgM + IgD - y CD27 + IgG / IgA + con cambio de clase se desarrollan en los GC. Al compartir características comunes con las células B IgA + en la lámina propia, las células B CD27 - IgA + pueden provenir del
intestino, donde se generan fuera de los GC, incluso en pacientes con deficiencia del ligando CD40. Este subconjunto de células B de memoria se caracteriza por un historial de replicación limitado y un uso dominante de la cadena H de IgA 2 y de la cadena L de Igλ.
• Las células B de memoria conmutada también se diferencian de sus precursores por sus requisitos de señales de supervivencia. El tratamiento de pacientes con lupus eritematoso sistémico con el mAb belimumab neutralizador de BAFF reveló que la persistencia de las células B de memoria no requiere
interacciones BAFF / BAFF-R, como es el caso de las células B de transición, foliculares y MZ. El tratamiento de pacientes con enfermedades autoinmunes con rituximab mAb anti-CD20 que agota las células B reveló que las células plasmáticas en sujetos humanos pueden ser de corta y larga duración.
• Las células plasmáticas de larga vida sobreviven en nichos especializados del BM. o mediante la diferenciación continua, dirigida por antígenos, de las células B de memoria.
• Los análisis de las titulaciones de inmunoglobulinas en suero contra antígenos virales o vacunas en pacientes tratados con rituximab, cuyas células B fueron eliminados por completo, mostraron que CD20 - células plasmáticas de larga vida pueden persistir durante años. Parte del repertorio de células
plasmáticas de larga vida de la BM se reemplaza por células plasmáticas recién llegadas generadas durante las respuestas inmunitarias agudas.
• Se ha aceptado ampliamente que las células plasmáticas de larga duración se originan a partir de células B activadas en concierto con células auxiliares foliculares T en la reacción de GC. Sin embargo, hallazgos recientes revelaron métodos independientes de las células T para la formación de células
plasmáticas de larga duración. Por ejemplo, se pueden generar células plasmáticas de larga duración en ratones con deficiencia de células T que han sido tratados con LPS haptenado.
• Aunque se pensaba que los anticuerpos IgM eran secretados por células plasmáticas de vida corta, ahora se ha informado de que las infecciones crónicas con Ehrlichia muris inducen
• células plasmáticas de BM con alto contenido de IgM de CD138, lo que contribuye a un título de IgM de larga duración.
• El desarrollo de células plasmáticas de vida corta y de vida larga depende de la expresión de la proteína 1 de maduración inducida por linfocitos del factor de transcripción B (Blimp-1), un gen maestro del desarrollo de células plasmáticas. Blimp-1 induce la proteína de unión a X-box 1 (XBP1), un factor de
transcripción clave, para iniciar la respuesta de la proteína desplegada. La actividad de Blimp-1 también es necesaria para regular a la baja la proteína 5 de caja emparejada del factor de transcripción (PAX5), el gen maestro para el desarrollo de células B inducido en células progenitoras de linfocitos comunes
para iniciar el compromiso del linaje B. La guía de las células plasmáticas a sus nichos se logra cambiando la capacidad de respuesta a las quimiocinas específicas de tejido. La regulación a la baja de los receptores de quimiocinas relacionados con GC, como CXCR5, así como la regulación al alza de CXCR4,
promueve la localización de las células plasmáticas en sitios con alta expresión del ligando CXCR4 CXCL12, que es producido, por ejemplo, por las células del estroma de la BM.
• Las células plasmáticas de vida larga se diferencian terminalmente y parecen no dividirse. Por lo tanto, necesitan señales de supervivencia para garantizar una existencia a largo plazo. Los factores potentes de supervivencia de las células plasmáticas in vitro son IL-6 y ligandos para CD44, como el ácido
hialurónico.
• Recientemente, se ha demostrado que las células plasmáticas humanas y murinas expresan CD28 junto con sus ligandos, B7.1 y B7.2. CD28 se expresa en células T, proporcionando señales coestimuladoras sobre la unión a moléculas B7 en células presentadoras de antígenos. Se han utilizado ratones
deficientes en CD28 para descubrir un papel de este receptor en las células plasmáticas de vida corta y larga. Esto se debe a que las células plasmáticas secretan niveles más altos de anticuerpos en ausencia de CD28. Debido a que la deficiencia en las moléculas B7 causa el mismo fenotipo, Las interacciones
CD28-B7 parecen regular negativamente la tasa de secreción de anticuerpos por las células plasmáticas. Sin embargo, en las células plasmáticas malignas, se demostró que la señalización de CD28 induce la supervivencia celular, protegiéndolas así contra la apoptosis inducida por citostáticos.
• A pesar de estos extensos estudios sobre el papel de los ligandos, receptores, componentes de señalización y factores de transcripción, los mecanismos por los que las células plasmáticas de larga vida persisten en la MO aún no se comprenden completamente.
• Sinopsis : En las respuestas inmunitarias dependientes de T, las células B de memoria de cambio de clase y las células plasmáticas se desarrollan en los GC. Las mutaciones que afectan a los componentes de la maquinaria de cambio de clase y SHM previenen la formación de células de memoria B y plasmáticas
que expresan IgA, IgG e IgE. El compartimento de las células B de memoria humana es más complejo de lo que se pensaba originalmente, incluidos los linfocitos B de memoria extrafolicular y las células que se originan en el intestino y el bazo. Las células plasmáticas de larga vida que no se dividen residen en
el BM. Estas células no se eliminan con el tratamiento con rituximab. La figura 3 resume los defectos genéticos que interrumpen el desarrollo y la activación de las células B.
Fig. 3 Defectos genéticos que interrumpen el desarrollo de las células B. Los defectos genéticos que interrumpen
el desarrollo de las células B en diferentes etapas están marcados en rojo.
Tolerancia de células B
• Tolerancia de células B
• Paul Ehrlich ya reconoció, después de postular la “teoría de la cadena lateral” en 1897 para describir la función de los anticuerpos aún por descubrir, que la reactividad contra los autoantígenos representa un hilo conductor del organismo. Teniendo esto en cuenta, acuñó el término
"horror autotóxico". Décadas más tarde, Frank Mcfarlane Burnet desarrolló el concepto de deleción clonal o selección de células B autorreactivas o no autorreactivas, respectivamente. Este concepto explica cómo se puede lograr la reactividad contra antígenos y patógenos extraños sin
generar un amplio espectro de autorreactividades potencialmente dañinas. Con el inicio de la tecnología de ratón transgénico y knockout / knock-in, fue posible probar estos conceptos directamente para especificidades de anticuerpos definidas in vivo. Chris C. Goodnow desarrolló un
modelo de ratón muy elegante para demostrar la anergia clonal de las células B y la deleción clonal a medida que evolucionaban los mecanismos para silenciar las células B autorreactivas. El modelo se basa en ratones transgénicos que expresan lisozima de huevo de gallina (HEL),
inmunoglobulinas IgM / IgD específicas de transgenes μ-δ / κ que se combinaron con otra cepa de ratón que expresa HEL transgénica, ya sea en forma soluble o unida a la membrana.
• Se ha utilizado ampliamente para investigar los mecanismos de selección que actúan sobre las células B y las moléculas implicadas en este proceso. Varios otros grupos también mostraron la deleción clonal de células B autorreactivas en la etapa de células B inmaduras utilizando
diferentes modelos de ratones transgénicos. Además de la anergia clonal y la deleción, se descubrió que los reordenamientos secundarios de los genes de la cadena L expresados por células B inmaduras IgM + autorreactivas en la BM son uno de los mecanismos reguladores clave. Esto
evita la salida de células B altamente autorreactivas del BM a la circulación.
• ¿Cuál de estos mecanismos juega un papel en la selección de células B humanas y en la configuración del repertorio de células B en sujetos humanos? La comparación de las especificidades de los anticuerpos entre las células B inmaduras recién formadas en la MO, las células B de
transición circulantes y las células B maduras ha demostrado claramente que el repertorio de células B inmaduras contiene una gran proporción de especificidades que reconocen autoantígenos, como la insulina o el ADN. Por el contrario, estas especificidades representan solo una
pequeña parte dentro del repertorio de células B maduras. Análisis de repertorio con células B de pacientes con defectos en el BCR, TLR,
• y señalización del receptor accesorio reveló que en sujetos humanos las señales BCR y TLR son críticas para guiar la selección de células B.
• Estos análisis muestran que el sistema inmunológico humano está equipado con un sistema de contraselección eficaz que impide la salida de células B autorreactivas al conjunto de células B maduras circulantes. Sin embargo, las enfermedades autoinmunes y las muchas
especificidades de los autoanticuerpos demuestran claramente que este proceso de selección deja muchos agujeros, lo que permite que las células B autorreactivas se filtren. ¿Dónde están estos agujeros y qué mecanismos podrían permitir que las células B autorreactivas se
conviertan en células plasmáticas de vida corta o incluso prolongada?
• El modelo de ratón transgénico anti-HEL IgM / DX HEL mostró claramente que las células B que expresan IgM / IgD de superficie con alta afinidad por HEL soluble como autoantígeno son "silenciadas" porque su BCR no responde a la activación del antígeno. La falta de respuesta se debe
principalmente a las diferentes tasas de internalización del receptor entre la IgM de superficie y la IgD de superficie porque la IgD de superficie es más estable y menos rápidamente regulado a la baja que IgM al unirse a HEL como un autoantígeno.
• Recientemente, Zikherman et al demostraron la regulación de la capacidad de respuesta de las células B mediante diferentes tasas de reciclaje de IgM de superficie de unión a autoantígeno e IgD de superficie. en un modelo de ratón transgénico. Se basa en la observación de que la
transcripción del receptor nuclear 77 (nur77), un miembro de la familia del receptor retinoide de la hormona esteroide tiroidea, se induce rápidamente después de la unión del antígeno al BCR. Al expresar un transgén de proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control transcripcional
de elementos reguladores nur77, las células B de estos ratones emiten fluorescencia verde cuando el BCR se une al antígeno. Allí, el sistema es un reportero ideal para monitorear el compromiso de BCR in vivo.. Sorprendentemente, y en contraste con los conceptos actuales, todas las
células B maduras expresaron GFP impulsada por nur77, aunque a diferentes intensidades, lo que sugiere que todas las células B son autorreactivas. La unión de autoantígenos se detectó primero en las células B de transición al entrar en el bazo, mientras que las células pre-B
inmaduras y en la BM no activaron la expresión de nur77-GFP. Esto podría explicarse asumiendo que las señales detectadas por las células B inmaduras que se unen a autoantígenos en la BM podrían no ser lo suficientemente fuertes como para regular al alza la transcripción de
nur77. Sin embargo, en el bazo, la intensidad de fluorescencia nur77-GFP se correlacionó directamente con el patrón de expresión de superficie de IgM e IgD. Los niveles más altos de GFP se encontraron en células B foliculares IgD hi IgM lo . Porque IgD hi IgM loLas células B tuvieron una
respuesta más fuerte por el flujo de Ca 2+ a anti-IgD que a la reticulación de IgM, estas células B foliculares tienen todos los atributos de las células B anérgicas silenciadas, como se describe en el modelo HEL. En sujetos humanos, la mayoría de las células B foliculares tienen
un fenotipo IgD hi IgM lo . Por lo tanto, una parte importante de nuestro repertorio de células B parece estar formada por células B autorreactivas que se mantienen vivas mediante la señalización BAFF / BAFF-R a la espera de ser activadas por las células T H al unirse al antígeno. Por lo
tanto, todo el mundo tiene un gran repertorio de células B autorreactivas que forman un depósito de clones que tienen el potencial de diferenciarse en la reacción de GC en células plasmáticas que secretan autoanticuerpos patógenos altamente autorreactivos.
•
• En otro modelo de ratón transgénico anti-HEL / HEL, se demostró que el desarrollo de dichos clones está regulado por su afinidad por el autoantígeno y por la distancia del autoantígeno del GC, en el que las células B autorreactivas se activan por cruzamiento. -antígenos extraños
reactivos.
• Niveles suficientemente altos de autoantígenos dentro del GC previenen eficazmente la diferenciación de las células B de GC autorreactivas en células plasmáticas, incluso si sus BCR tienen una alta reactividad cruzada con antígenos extraños. Sin embargo, si los autoantígenos se
expresan en otros tejidos y órganos fuera del GC, las células B autorreactivas escapan a la deleción y pueden seleccionarse positivamente para iniciar una respuesta autoinmune de alta afinidad.
• Este mecanismo podría explicar, por ejemplo, la presencia de autoanticuerpos de reacción cruzada en las respuestas inmunitarias antivirales. y en la trombocitopenia autoinmune relacionada con la hepatitis C. Por lo tanto, el equilibrio entre la afinidad relativa de los BCR por los
autoantígenos y los antígenos extraños y la distancia entre los autoantígenos y los clones de células B activados en el GC son parámetros clave para determinar el destino de los linfocitos B de GC autorreactivos y para discriminar entre respuestas inmunes protectoras y autoinmunidad.
La figura 4 resume los puntos de control para las células B autorreactivas.
Figura 4Modelos de tolerancia de células B. Si las células B inmaduras se

unen a los autoantígenos, pueden sufrir un reordenamiento secundario de
los loci de la cadena L para generar nuevas especificidades con menor
afinidad por los autoantígenos. Las células que se unen fuertemente
morirán en la BM; todas las demás células emigran al bazo, donde las
BCR se unen a autoantígenos con diversas afinidades. La unión fuerte
puede conducir a la exclusión de los folículos de células B, y la unión
intermedia puede conducir a una mayor internalización de IgM y anergia
funcional. La unión de antígenos (extraños) a IgD combinada con las
células T ayuda a rescatar las células B anérgicas y permite la activación
y la entrada en la reacción de GC. Las células expuestas a los
autoantígenos en los GC no se seleccionan en el grupo de células B de
memoria conmutadas de larga duración y células plasmáticas. Los
linfocitos B que expresan BCR reactivos contra autoantígenos ubicados
fuera de los GC se seleccionan en el conjunto de linfocitos B de memoria
y células plasmáticas. Este mecanismo podría explicar la generación de
células B autorreactivas en pacientes con enfermedades autoinmunes.
Sinopsis: En el BM, las células B autorreactivas son rescatadas por

reordenamiento secundario de sus cadenas L, lo que da como resultado nuevas
especificidades de anticuerpos. En el bazo, la mayoría, si no todas, las células B
parecen unirse a los autoantígenos hasta cierto punto. Las células con mayor
afinidad se vuelven insensibles a la señalización dependiente de IgM. Pueden
rescatarse mediante la unión del antígeno a su BCR en cooperación con la ayuda
de las células T. Los autoantígenos expresados en GC bloquean la formación de
células plasmáticas y de memoria que expresan autoanticuerpos de alta
afinidad. Debido a que las células B no discriminan entre antígenos extraños y
autoantígenos que se encuentran solo fuera del GC, estos últimos podrían servir
como dianas para autoanticuerpos de alta afinidad.
Linfocitos B y dengue

Introducción
Dengue
Enfermedad viral transmitida por mosquitos, causada por el
virus del dengue (DENV).
 Virus endémico en mas de 100 países.

 Causa +/- 390 millones de infecciones al año.
 25% de los casos hace manifestaciones clínicas.
Dengue sin signos

de alarma.
Dengue con signos
de alarma.
Dengue grave.
Las respuestas de las células B durante la infección por DENV
A continuación, proporcionamos una visión actualizada

de la respuesta inmune a la infección por DENV desde
la perspectiva de las células B: desde la entrada viral
temprana en los ganglios linfáticos regionales (LN)
después de la infección cutánea, destacando la
activación y proliferación de las células B o la muerte
de las células B inducida por la activación, a la inducción
de células B del centro germinal (GC), plasmablastos
(PB), células plasmáticas (PC) y MBC, también
ilustramos información actual sobre las bases celulares
de la respuesta de Ab a los antígenos de DENV (Ag)
(Figura Figura 1).
Virus del Dengue Virus RNA de cadena sencilla, envuelto.
El genoma codifica tres proteínas estructurales: cápside, envoltura (E) y membrana (M), y
siete proteínas no estructurales (NS): NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5.
La proteína M se forma primero como un precursor llamado proteína M

precursora (prM).
El proceso de maduración de DENV está dirigido por la escisión proteolítica de la
prM, produciendo partículas infecciosas totalmente maduras.
Proteína E
 La proteína estructural E tiene tres dominios (EDI-III).

 EDIII participa en la unión del virus a la superficie de la célula
hospedera.
 Se sabe que los Abs neutralizantes se dirigen preferentemente a EDIII.
 Hallazgos recientes indican que la proteína Abs a E podría facilitar la
infección por DENV cuando está presente en concentraciones
subneutralizantes.
Uno, N., & Ross, T. M. (2018). Dengue virus and the host innate immune response. Emerging microbes & infections, 7(1), 167. https://doi.org/10.1038/s41426-018-0168-0
Infección de células B por DENV
¿Están las células B infectadas con DENV?

Casos fatales en humanos: Proteínas virales NS1, NS3,
RNA viral en células B del
Ag virales dentro de órganos prM en el centro germinal en
centro germinal.
linfoides. humanos y en ratones.
¿Están infectados solo en sangre periférica o también en

tejidos?
Infección de células B
por DENV
Objetivo: Determinar si hay implicación de reacciones de GC durante la infección cutánea por DENV y si existe algún tipo de respuesta de Ab preferencial a proteínas
virales definidas.
Materiales y métodos: La inoculación intradérmica de DENV a una dosis relativamente baja infecta eficazmente ratones BALB / c inmunocompetentes, induciendo
mayores cantidades de células B GC específicas de DENV y GC más grandes que las condiciones de control.
Resultados: los GC exhibieron tanta prM como la proteína de envoltura (E) y proteínas virales no estructurales. A pesar de la abundancia mucho mayor de proteína E
que de proteína prM en los viriones, los animales infectados mostraron cantidades similares de células B en los centros germinales (GC) específicas de Ag y Abs
circulantes tanto para las proteínas prM como para las proteínas E, incluso significativamente más altas para prM.
Discusión y conclusiones: Hasta donde se sabe, no hay informes de las respuestas de GC durante la infección por DENV. Esta respuesta anti-prM relativamente más
fuerte podría ser desencadenada por DENV para promover preferentemente los Abs contra ciertas proteínas virales, lo que podría favorecer las infecciones al facilitar la
invasión de DENV de las células huésped. Por tanto, es concebible que DENV haya evolucionado para inducir este tipo de respuestas Ab.
El DENV cutáneo induce un mayor número y tamaño de GC en comparación con las condiciones de control.
La inoculación cutánea de DENV induce una mayor cantidad de células GC B

(IgD-CD19 + PNA +) en DLN en comparación con las condiciones de control.
Distribución in situ de proteínas DENV dentro de GC en DLN

Respuestas de plasmablastos y células plasmáticas durante la infección por DENV
 Las respuestas de PB en pacientes con infección aguda por DENV muestran un gran aumento sobre los niveles observados en pacientes
con otras infecciones y sobre los niveles basales encontrados en sujetos sanos no infectados.
Objetivo: determinar como es la respuesta aguda y temprana de las células B convalecientes que conduce a la generación de anticuerpos neutralizantes y de reacción cruzada después de la
infección por dengue.
Metodología / hallazgos principales: se analizaron muestras de sangre tomadas de pacientes con dengue con infección primaria o secundaria durante la enfermedad aguda y la
convalecencia y se compararon con muestras de pacientes que presentaban fiebre no relacionada con el dengue. El dengue indujo la formación masiva de plasmablastos precoces, que se
correlacionó con la aparición de IgG policlonal con reactividad cruzada para la infección primaria y secundaria.
Conclusiones / importancia: la IgG polirreactiva y de serotipo viral con reactividad cruzada es un componente importante de la respuesta innata en humanos durante la infección por
dengue primaria y secundaria, y las "especificidades innatas" parecen constituir parte de la respuesta adaptativa en el dengue. Si bien son de importancia potencial para la protección
durante la infección secundaria, las células B de reacción cruzada también competirán con las células B altamente neutralizantes y posiblemente interferirán con su desarrollo.
Inducción rápida de anticuerpos IgG con reactividad
cruzada después de la infección por dengue
Activación de células B policlonales después de la infección por dengue.

Respuestas primarias de células B y Abs de IgM durante la infección por DENV
 En los primeros encuentros con los hospederos, la mayoría de los patógenos desencadenarán una respuesta inmune humoral
primaria caracterizada por un aumento temprano de los Abs IgM específicos.
 Pocos estudios se han centrado en los Abs “naturales” primarios durante la infección por DENV.
 La IgM se puede encontrar en infecciones secundarias aunque, comúnmente, los títulos promedio son más bajos que en las primarias.
 La respuesta de IgM humana a DENV podría tener una reacción cruzada predominantemente entre los serotipos de DENV, y esta respuesta de
IgM es significativamente mayor en pacientes con SD que en pacientes con DF (fase aguda).
Respuestas de células B a largo plazo (memoria) y abs de memoria

durante la infección por DENV
 Los Abs de memoria IgG se generan principalmente a través de reacciones dependientes de células T.
 La respuesta de células B detectada temprano después de la infección primaria por DENV es predominantemente específica de
serotipo, mientras que las respuestas detectadas temprano después de la infección secundaria son predominantemente de reacción
cruzada de serotipo.
Conclusiones
 A pesar de que las respuestas Ab son generadas por las células B, sabemos sorprendentemente poco sobre las respuestas de
las células B (agudas, crónicas o de memoria) y los mecanismos celulares que generan estos Abs durante las infecciones por
DENV, tanto en humanos como en modelos animales.
 Se supone que las células B y T participan tanto en la protección como posiblemente en la potenciación putativa de la
enfermedad.
 Conocer qué epítopos están impulsando las diferentes respuestas de Ab y cómo es que se establecen afinidades de Ab
mayores o menores durante la infección y si estos eventos influyen en la protección o patogénesis durante la enfermedad,
podría ser de gran utilidad para diseñar más eficientes, y particularmente en el caso del dengue, vacunas más seguras.
Deterioro de la respuesta inmune independiente
de anticuerpos de las células B en pacientes con
infección aguda por dengue
Introducción
Además de la producción de anticuerpos, las
células B tienen diversas funciones.
Presentación de
antígenos.
Producción de
citocinas
Inflamación. inmunosupresoras
IL-10, TGF-β e IL-
Blausen.com staff
(2014).
35.
Subconjuntos de células B humanas tienen funciones reguladoras

C
Céélulas
lulas B
B con
con funciones
funciones reguladoras
reguladoras CD24 hi
hi CD27 +
+ B10
(Bregs):
(Bregs): mantenimiento
mantenimiento de
de la
la Plasmablastos CD19 ++ CD24 hi
hi CD27 int
int
tolerancia y la homeostasis.
tolerancia y la homeostasis. Células B de transición CD19 ++ CD24 hi hi CD38 hi
hi
En el contexto de la infección por DENV, no se sabe mucho sobre las respuestas de las células B independientes de los
anticuerpos.
Objetivo
 Definir la distribución de subconjuntos de células B en la fase

temprana de la infección por DENV y caracterizar el efecto de la
infección por DENV en diferentes funciones de las células B.
Pacientes
Análisis de células B
Cultivo de células B
Reclutamiento de pacientes
≥ 2 años Hospital Kanta Bopha en En las 96 h del inicio de la

Síntomas similares a dengue Phnom Penh, Camboya fiebre.
 En total, 81 pacientes con dengue positivos.
 Hemograma completo disponibles para 59 niños incluidos.
 Para detectar las respuestas de células B específicas de DENV, los pacientes que
presentaban fiebre pero eran negativos para DENV se incluyeron como controles ( n = 29).
 Donantes sanos de la misma edad y sexo ( n = 29).

Resultados
Datos demográficos de la población del estudio
Aislamiento de células
B.
1
1 2
2 3
3 4
4
Las
Las células
células se
se tiñeron
tiñeron con:
con:
CD19
CD19 Alexa
Alexa Fluor
Fluor 488,
488, FcRL4
FcRL4 PE,
PE, CD27
CD27 APC
APC // Cy7,
Cy7, Células B
CD138
CD138 BV421, IgM PerCp / Cy5.5, CD24 PE
BV421, IgM PerCp / Cy5.5, CD24 PE // Cy7,
Cy7,
CD38
CD38 APC,
APC, IgG
IgG BV510.
BV510.
Medio
Medio RPMI,
RPMI, FSB
FSB al
al 10%,
10%, L-glutamina,
L-glutamina,
Clasificación de las células
PBMC
PBMC gradiente
gradiente de
de densidad
densidad
Ficoll-Histopaque
Ficoll-Histopaque
 Promover la
 Promover la producción  Inducir la activación de
diferenciación de
de citocinas células B
células plasmáticas.
Resultados
Distribución Alterada de subconjuntos de células B en la infección grave por DENV
Resultados
Desarrollo similar de células plasmáticas en individuos infectados por DENV e
individuos sanos
Resultados
Concentraciones de CD40L y su asociaci ón con el Producción de citocinas en células B de

porcentaje de células B CD19++ CD24hi
hi CD38hi
hi en dengue grave pacientes con dengue
Resultados
Estímulo del receptor tipo TLR de las Expresión de receptores Fc inhibidores en las
células B de pacientes con Dengue células B
Discusión
 Distribución alterada de los subconjuntos de células B en los pacientes con DENV positivo
en comparación con los niños que padecían enfermedad febril, lo que se correlacionó con
la gravedad de la enfermedad en los pacientes infectados con dengue.
 Respuesta funcional de células B funcionalmente deteriorada en pacientes con dengue.
 Marcado aumento en los porcentajes de plasmablastos y células plasmáticas en

pacientes entre los días 4 y 7 posteriores a la aparición de los síntomas.
 No hay diferencias en las concentraciones plasmáticas de APRIL.
 Disminución de dos veces en las células CD24 hihi CD38 hihi dentro de la población de células

B CD19 ++ en pacientes que sufren dengue grave.
Discusión
 Mostramos aquí la disminución de las concentraciones plasmáticas de sCD40L en pacientes con dengue
grave. Estos datos están en línea con hallazgos previos, donde se observaron concentraciones séricas
reducidas de sCD40L en pacientes adultos infectados con DENV con pérdida de plasma.
 Las células B aisladas de pacientes con dengue fueron refractarias a la estimulación con TLR9, ya que no
observamos una regulación al alza de los marcadores de activación o marcadores coestimuladores
necesarios para la presentación de antígenos en células B vírgenes después de la estimulación in vitro .
 Observamos un aumento de la expresión de CD32B y LILRB1 en células CD19 ++ CD27 -- B directamente ex

vivo durante la fase temprana de la infección por dengue.
Conclusión
Se
Se observó
observó disminución
disminución dede los
los porcentajes
porcentajes de de CD24
CD24 hihi CD38
CD38 hihi células
células B
B yy CD27
CD27 -- células
células B
B naive
naive dentro
dentro de
de la
la población
población CD19
CD19 yy el
el aumento
aumento de
de los
los
porcentajes
porcentajes de
de CD27
CD27 + CD38
+
CD38 hi CD138
hi
CD138 + células
+
células plasmáticas
plasmáticas que
que correlacionan
correlacionan concon la
la gravedad
gravedad de
de la
la enfermedad
enfermedad dentro
dentro de
de 44 días
días después
después de
de
aparición
aparición de de síntomas
síntomas de
de lala fiebre.
fiebre.
CD19
CD19 ++ CD24
CD24 hihi CD38
CD38 hihi y
y CD19
CD19 ++ CD27
CD27 :: las
las células
células B
B de
de los
los pacientes
pacientes con
con dengue
dengue fueron
fueron refractarias
refractarias aa la
la estimulación
estimulación de
de TLR in
TLR in vitro ,
vitro , lo
lo que
que
resultó en una disminución de la producción de citocinas de IL-10 y TNF-α específicas de las células B, lo que se correlaciona
resultó en una disminución de la producción de citocinas de IL-10 y TNF-α específicas de las células B, lo que se correlaciona con una mayorcon una mayor
expresión
expresión de de inhibidores
inhibidores FcγR in
FcγR in vivo
vivo en
en células
células BB sin
sin tratamiento
tratamiento previo
previo de
de pacientes
pacientes infectados
infectados con
con DENV.
DENV.
Tomados
Tomados en
en conjunto,
conjunto, nuestros
nuestros resultados
resultados indican
indican una
una respuesta
respuesta defectuosa
defectuosa de
de células
células B
B en
en pacientes
pacientes con
con dengue
dengue que
que puede
puede contribuir
contribuir aa la
la
patogénesis
patogénesis de
de DENV
DENV durante
durante la
la fase
fase aguda
aguda dede la
la infección. Estos
infección. Estos datos
datos enfatizan
enfatizan la
la importancia
importancia de
de las
las funciones
funciones de
de las
las células
células B
B independientes
independientes
de los anticuerpos en la fase temprana del desarrollo de la enfermedad después de la infección por
de los anticuerpos en la fase temprana del desarrollo de la enfermedad después de la infección por dengue. dengue.
Gracias
Resumen
El virus del dengue (DENV) es uno de los patógenos virales humanos más importantes transmitidos por mosquitos y puede causar
desde una enfermedad asintomática hasta fiebre leve indiferenciada, dengue clásico y dengue grave.
Las respuestas de anticuerpos (Ab) de memoria neutralizantes son uno de los mecanismos más importantes que contrarrestan las
reinfecciones y, por tanto, el objetivo principal de la vacunación.
Sin embargo, también se ha propuesto que en el dengue, algunos de estos Abs de memoria de cambio de clase (IgG) podrían
empeorar la enfermedad. Aunque estos Abs de memoria se derivan de las células B mediante procesos dependientes de las células
T, sabemos bastante poco sobre las respuestas de las células B (agudas, crónicas o de memoria) y los complejos mecanismos
celulares que generan estos Abs durante las infecciones por DENV.
Esta revisión tiene como objetivo proporcionar una perspectiva actualizada y completa de las respuestas de las células B durante
la infección por DENV, comenzando desde los eventos muy tempranos, como la entrada cutánea de DENV y la llegada a los ganglios
linfáticos de drenaje, hasta la activación, proliferación y formación de centros germinales (GC) putativos de las células B (la
fuente de los Abs de memoria de cambio de clase madurados por afinidad), hasta el resultado de reacciones GC tales como la
generación de plasmablastos, células plasmáticas secretoras de Ab y células B de memoria. Discutimos temas muy poco
explorados, como la posibilidad de infección de células B por DENV o incluso la muerte de células B inducida por
activación. También se ilustra la información actual sobre la naturaleza de las respuestas Ab a DENV.
Introducción
El virus del dengue (DENV) es uno de los patógenos virales humanos más importantes transmitidos por mosquitos y causa cada año ~ 390 millones de infecciones
en todo el mundo, lo que resulta en alrededor de 500.000 personas con dengue grave (SD). Se estima que más del 50% de la población mundial está ahora en
riesgo de infección por dengue, causado por cuatro serotipos (DENV1–4), que circulan en regiones tropicales y subtropicales ( 1 ). Se cree que la gran mayoría de
las infecciones por dengue son asintomáticas; sin embargo, una proporción se manifiesta como una enfermedad febril inespecífica o progresa a la fiebre del
dengue clásico (FD), caracterizada por fiebre y dolor articular intenso. Algunas de esas infecciones pueden evolucionar a SD, como el dengue hemorrágico (DH) o
el síndrome de choque por dengue (DSS) ( 1).
La respuesta de anticuerpos de memoria neutralizante (Ab) es uno de los mecanismos más importantes para derrotar tanto a las reinfecciones homotípicas como
heterotípicas con DENV y, por lo tanto, es el objetivo de las vacunas ( 2 - 5 ). Sin embargo, una de las principales hipótesis sobre la SD gira en torno a los Abs
de memoria de cambio de clase, en un mecanismo denominado mejora dependiente de Ab (ADE) de la infección ( 6 ). Aunque este mecanismo se ha estudiado in
vitro, su importancia potencial in vivo apenas comienza a dilucidarse ( 7 , 8).
Introducción
Los estudios epidemiológicos clásicos indican que los individuos que tienen una infección secundaria con un serotipo de DENV diferente al primero tienen un
mayor riesgo de desarrollar SD ( 9 - 11 ). Esto incluye circunstancias como bebés infectados por primera vez pero que ya tienen Abs específicos de DENV
adquiridos por vía materna ( 12 ), lo que los predispondría a la MS. Al presentar esta revisión, un informe vinculó la infección por el virus del Zika con el síndrome
de Guillain-Barré ( 13). Es de destacar que hubo concomitancia de la infección por Zika, el síndrome de Guillain-Barré y la presencia de anticuerpos IgG anti-
DENV también, lo que sugiere una relación entre estos eventos. Se prevén al menos tres escenarios preliminares: (a) la respuesta anti-DENV de memoria de
reactividad cruzada puede contribuir al síndrome de Guillain-Barré (aparentemente descartado en el estudio), (b) las respuestas anamnésicas anti-dengue IgG
podrían haber sido impulsadas por el Zika en el síndrome de Guillain-Barré, o (c) Abs con reactividad cruzada inducida por Zika a DENV ( 13 , 14). Es de destacar
que esto sigue siendo preliminar y bastante especulativo, y se necesitan pruebas más sólidas. Lo que está claro, sin embargo, es que la participación de las
respuestas de Ab necesita un escrutinio muy cuidadoso, y este hallazgo reciente destaca la importancia de estudiar las respuestas de las células B no solo en
DENV sino también en estas otras infecciones emergentes por flavivirus. Es concebible que las respuestas de memoria al DENV puedan estar involucradas en
estas otras enfermedades por flavivirus.
Si bien las respuestas de las células T durante la infección aguda por DENV se han estudiado con cierto detalle, se sabe mucho menos sobre los complejos
mecanismos de las respuestas de las células B. A pesar de que los Abs de memoria son generados por las células B, y que varios estudios recientes y elegantes
todavía están definiendo características cruciales sobre los Abs para DENV [por ejemplo, los epítopos antigénicos que inducen Abs neutralizantes o no
neutralizantes ( 7 , 8 , 15)], sabemos sorprendentemente poco sobre la respuesta de las células B en sí, ya sea durante la infección aguda cuando la enfermedad
aún se manifiesta o con respecto a los mecanismos que generan células plasmáticas de larga duración (LLPC) o células B de memoria (MBC). A continuación,
proporcionamos una visión actualizada de la respuesta inmune a la infección por DENV desde la perspectiva de las células B: desde la entrada viral temprana en
los ganglios linfáticos regionales (LN) después de la infección cutánea, destacando la activación y proliferación de las células B o la muerte de las células B
inducida por la activación, a la inducción de células B del centro germinal (GC), plasmablastos (PB), células plasmáticas (PC) y MBC, también ilustramos
información actual sobre las bases celulares de la respuesta de Ab a los antígenos de DENV (Ag) (Figura Figura 1).
Virus dengue
El virus del dengue es un virus de ARN de cadena positiva envuelto cuyo genoma codifica tres proteínas estructurales:
cápside, envoltura (E) y membrana (M), y siete proteínas no estructurales (NS): NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y
NS5 ( 16 , 17 ). Debido a que la proteína M se forma primero como un precursor llamado proteína M precursora (prM), el
proceso de maduración de DENV está dirigido por la escisión proteolítica de la prM, produciendo partículas infecciosas
totalmente maduras ( 18 - 20 ). Sin embargo, este mecanismo no es completamente eficaz, y las células huésped
producen viriones completamente inmaduros o parcialmente maduros. El estado inmaduro de los viriones depende de la
escisión de prM, la modificación del tamaño y la morfología de las partículas ( 21).
Se estima que al menos el 30-40% de las partículas de DENV liberadas por las células de mosquitos infectadas son
inmaduras y contienen diferentes cantidades de prM ( 22 ). Por lo tanto, en el primer caso después de la entrada del
virus en el huésped, el sistema inmunológico podría reconocer E, M y prM Ags de DENV. Se ha sugerido que en presencia
de Abs anti-prM de memoria conmutada de clase no neutralizantes, incluso los virus inmaduros y no infecciosos pueden
ingresar a las células a través de los receptores Fc gamma (FcγR) y replicarse de manera eficiente, lo que lleva a más
células infectadas. contribuyendo potencialmente a una enfermedad más grave ( 23 , 24 ). Por otro lado, la proteína
estructural E tiene tres dominios (EDI-III) ( 25), y se sabe que EDIII participa en la unión del virus a la superficie de
la célula huésped ( 26 ). Además, se sabe que los Abs neutralizantes se dirigen preferentemente a EDIII; sin embargo,
hallazgos recientes indican que la proteína Abs a E podría facilitar la infección por DENV cuando está presente en
concentraciones subneutralizantes ( 7 , 15 ). Asimismo, también se ha propuesto que Abs para la proteína E completa
también puede comportarse como facilitadores al mejorar la infectividad de partículas inmaduras o parcialmente
maduras debido al reconocimiento de epítopos que están expuestos en viriones inmaduros ( 27 , 28).
Virus dengue
Además de los posibles efectos facilitadores de estos Abs, los que de hecho son neutralizadores parecen estar
dirigidos contra epítopos conformacionales complejos, que se expresan solo cuando las proteínas ya están
ensambladas en una partícula de virus madura; por lo tanto, ha sido complicado diseccionar la naturaleza
antigénica precisa de estas estructuras ( 2 ). No obstante, el modelo animal actualmente preferido para estudiar
la respuesta inmunitaria in vivo a la infección por DENV se limita principalmente a ratones inmunodeficientes
[un ratón deficiente para receptores de interferón α / β y γ en un fondo 129 (AG129)] ( 29 - 31). Sin embargo,
para evaluar con precisión las respuestas inmunes intactas al DENV y, por ejemplo, la generación de Abs
potencialmente neutralizantes o no neutralizantes para este virus, estos animales podrían no ser el modelo
mejor indicado.
Además de esto, a pesar de que solo la proteína E está expuesta en la superficie de los viriones completamente
maduros, la estructura antigénica del DENV es muy compleja, ya que existen cambios conformacionales en la
morfología del DENV a lo largo del ciclo de replicación, como los diferentes estructuras encontradas en
mosquitos y humanos. Por lo tanto, los candidatos ideales para la vacuna DENV deberían generar una respuesta
humoral óptima con Abs que se unan y neutralicen todo el espectro de estructuras virales ( 32 ).
Infección y activación de linfocitos B por dengue
Durante muchos años, los monocitos se consideraron las principales células diana primarias para DENV ( 33 - 35 ). Sin embargo, los mecanismos precisos
de infección in vivo e in vitro de estas células aún son controvertidos y el porcentaje de monocitos infectados con DENV circulantes es demasiado bajo ( 36 ). Podría ser
que después de la activación, los monocitos se infecten, ya que en la circulación, en su mayoría están en reposo o inmaduros ( 37 , 38 ), por lo que de alguna manera son
“resistentes” o no permisivos a la infección. Muchos reportes han utilizado estas células para evaluar ADE in vitro debido a sus FcγRs, obteniendo una mayor frecuencia
de infección ( 34); sin embargo, la proporción de monocitos infectados sigue siendo baja. Siendo las células B, las responsables de las respuestas de Ab, no se sabe mucho
sobre su papel durante la infección por DENV o si podrían ser ellas mismas objetivos de DENV. Los estudios in vitro han demostrado que las líneas de células
linfoblastoides humanas con características de células B fueron infectadas productivamente por DENV2 ( 39 ). Además, aunque se han realizado muchos esfuerzos para
dilucidar la fracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) infectadas con DENV durante la enfermedad aguda, aún no existen evidencias definitivas y se
sabe poco sobre los tipos de células infectadas in vivo.. Hay informes de que las células B son en sí mismas el objetivo de la infección por DENV. En particular, un estudio
ha identificado a las células B como la principal población de células infectadas con DENV de las PBMC. Se recolectaron células de pacientes con dengue gravemente
enfermos y se separaron en subconjuntos. La mayor parte del virus se recuperó del subconjunto de células B, y esto fue independientemente del serotipo
DENV. Curiosamente, el DENV no se recuperó de monocitos o células NK ( 40). También se ha demostrado que las células CD19 + aumentan durante la infección por
DENV y que estos incrementos se correlacionan con la presencia de los denominados linfocitos atípicos observados en los frotis de sangre teñidos con Giemsa. Estos
linfocitos atípicos se definieron como células mononucleares grandes que tienen una cromatina nuclear fina y homogénea y un citoplasma de tinción oscura, algunas de
estas células se asemejan a células blásticas. Además, estos linfocitos atípicos representaron el 10% o más de las PBMC en pacientes con dengue o dengue hemorrágico (
41 ). Sin embargo, el origen de estos linfocitos atípicos aún no está claro, y se ha sugerido que las células B son la fuente debido al aumento de células CD19 + en
pacientes con dengue hemorrágico ( 41 , 42).). Es posible que esta población de linfocitos atípicos corresponda a PB, ya que las respuestas de PB parecen dominar el
compartimento de células B durante la infección por DENV, como se analiza a continuación.
En otro estudio ( 43 ), se demostró que las células B son las células infectadas con DENV predominantes en los
pacientes con dengue, con un 20-81% de células CD19 + en las PBMC que contienen DENV3. Sin embargo,
otros estudios in vitro han encontrado resultados diferentes. Por ejemplo, los macrófagos esplénicos humanos,
pero las células ni T ni B, parecían ser permisiva para la infección por DENV, y estos macrófagos esplénicos
exhibieron mejorada infección DENV en presencia de muy diluida de suero humano DENV-inmune ( 44 ).
En un informe que analizaba un paciente con dengue hemorrágico, fue posible aislar dos genotipos diferentes
de DENV2 y se detectaron niveles altos de Ags virales en linfocitos B periféricos; uno de los virus aislados fue
capaz de infectar y multiplicarse eficazmente en una línea de células B. Sin embargo, el otro virus aislado no se
unió eficazmente ni pudo infectar la línea de células B ( 45 ). Podría ser que la infección de las células B durante
el dengue dependa del genotipo o serotipo de DENV. Además, es importante tener en cuenta que las células B
podrían infectarse a través de FcγR si los Abs facilitan realmente la invasión de las células huésped durante las
infecciones heterólogas secundarias. De hecho, solo desde esta perspectiva, no solo las células B, sino también
cualquier célula que lleve FcγR es potencialmente susceptible de infección por DENV.
¿Están las células B infectadas con DENV? ¿Están infectados solo en sangre periférica o también en tejidos? Hay pocos informes que sugieran
células B infectadas con DENV en los tejidos. Al describir la distribución de los Ags-DENV en casos fatales en humanos, se encontró la presencia
de Ags virales dentro de los órganos linfoides. Se ha encontrado positividad para las proteínas DENV en células blásticas dentro de los folículos
de células B, PC y células B en el bazo y LN ( 46 ). La presencia de ARN viral de hebra positiva se ha relacionado con la replicación viral en células
GC B de humanos ( 47 ) (las GC se describirán a continuación). Por otro lado, se han informado proteínas virales NS3, NS1, prM y E dentro de GC
en LN tanto de humanos como de ratones ( 48 - 50), lo que sugiere infección de células GC B. Estos hallazgos mostraron DENV Ags dentro de los
tejidos linfoides, particularmente dentro de los GC, lo que sugiere una posible infección de las células B en estas estructuras. Quizás las células
B durante las reacciones de GC expresan moléculas a las que DENV puede apuntar como receptores para infectarlas. Sin embargo, es factible
que los DENV Ags lleguen a los folículos de células B por otras vías (como la linfa, la sangre o el complejo sistema de conductos intranodales), y
la presencia de DENV Ags dentro de los folículos de células B no necesariamente indica infección de las células B.
En conjunto, estos datos sugieren que las células B podrían infectarse por DENV, pero ¿son activadas por el virus o por otras células en el
microambiente durante la infección?
Analizando la expresión génica en células B durante su interacción con DENV in vitro , se describió que en respuesta a este virus, las células B
sobreexpresaban varios genes como TRAIL, IP-10 y MCP-2 ( 51 ). Otro informe evaluó la permisividad de las células B humanas a la infección por
DENV2, lo que indica la replicación activa de DENV2, y también que la infección indujo la producción de IL-6 y TNF-α por las células B. Además,
el suero heterólogo de pacientes infectados con DENV3 pudo aumentar la proporción de células B infectadas con DENV2 y la producción de
citoquinas por estas células B ( 52 ).
Durante la infección por DENV, la interacción entre las células infectadas y no infectadas y la liberación de mediadores inflamatorios
pueden desempeñar un papel importante en el resultado de la enfermedad. Algunos informes han descrito la activación de las
células B por otras células infectadas con DENV. Por ejemplo, se describió que las células B esplénicas murinas pueden ser activadas
de manera eficiente in vitro e in vivo por macrófagos peritoneales infectados con DENV, lo que lleva a la expansión clonal de esas
células B, como demostraron los autores al contar la placa de Ab IgM específica del virus. formando células ( 53 ). Por otro lado, la
ayuda de las células T por contacto directo con las células y las citocinas de los macrófagos fueron necesarias, in vitro , para la
activación de las células B esplénicas ( 54). Los ratones endogámicos A / J que fueron inoculados por vía intravenosa con un DENV2
no adaptado al ratón mostraron una activación temprana de los linfocitos B y la producción de IgM. Estas células B productoras de
IgM pueden ser importantes para eliminar la infección primaria por DENV ( 55 ), pero se necesitan más estudios al respecto.
En resumen, muchos informes sugieren que las propias células B están infectadas por DENV, pero esta infección podría depender del
serotipo o genotipo del virus, ya que muchas otras características de la infección, como, por ejemplo, la expresión de FcγR y la
historia de infecciones previas por DENV. Además, podría ser que DENV u otras células diana infectadas, como los macrófagos,
activen las células B que luego pueden contribuir a la liberación de mediadores inflamatorios. Por tanto, además de producir Abs, las
células B pueden jugar un papel importante en la activación del sistema inmunológico o en reacciones inflamatorias durante la
infección aguda por DENV.
Respuesta de plasmablastos y células plasmáticas durante la infección
Estudios epidemiológicos clásicos indican que SD es más común en las infecciones DENV heterólogas secundarios ( 9 - 11), lo que implica la participación de mecanismos
inmunes. Los esfuerzos para comprender las bases inmunes de esta SD han correlacionado Abs no neutralizantes de clase conmutada (memoria) con reactividad cruzada de una
infección previa con el efecto potenciador sobre nuevas células infectadas con DENV, entre otros mecanismos. Estos Abs de IgG de memoria serían serotipo reactivos de forma
cruzada y no neutralizantes. Dado que los Abs derivan de las células B, esto implica que los mecanismos de activación, maduración y diferenciación de las células B son
importantes para determinar el resultado clínico posterior de la enfermedad. Es de destacar que estas respuestas de memoria dependen de la ayuda de las células T. El estudio
de los mecanismos celulares básicos para la producción de Ab se ha descuidado bastante en el dengue. Por ejemplo, no fue hasta hace muy poco que se evaluó el papel
potencial de los PB y los CP durante la infección por DENV, incluso cuando estas últimas células son las células productoras de Ab reales. Las respuestas de PB en pacientes con
infección aguda por DENV muestran un gran aumento sobre los niveles observados en pacientes con otras infecciones virales, como la influenza, y sobre los niveles basales
encontrados en sujetos sanos no infectados (56 - 60 ). Los patrones de expresión génica global en PBMC aislados de pacientes con dengue hemorrágico mostraron un
enriquecimiento de firmas de PB que se acompañó de un aumento de PB mediante análisis FACS ( 60 ). Es de destacar que la cantidad de PB es mayor incluso en niños
infectados por DENV que en sujetos sanos de control ( 59). Como se ha observado una gran cantidad de PB y PC en pacientes con dengue, esto sugiere una mayor producción de
Ab. El número de PB y CP fue mayor en los casos de dengue secundario que en el primario, lo que sugiere la reactivación de los MBC. Además, el DENV parece activar las células
B policlonales que reaccionan de forma cruzada con otros Ags, como el virus de la poliomielitis, ya que se identificaron cantidades significativas de Abs polioreactivos 15-25 días
después de la fiebre en pacientes con dengue en comparación con los sujetos control ( 56 ).
Vale la pena mencionar que las respuestas de los PB parecen dominar abiertamente el compartimento de células B (a menudo hasta el 80% de la población de células CD19 +
eran PB) durante la infección por DENV, lo que representa hasta el 30% del total de linfocitos periféricos ( 58 ). Por el contrario, la vacuna antigripal o la vacunación primaria con
la vacuna contra la fiebre amarilla indujo una respuesta de PB mucho menor, alrededor del 2-3% del total de células B (CD19 +) ( 61 ). Los PB durante la infección por DENV
están presentes en la circulación periférica solo durante un tiempo relativamente corto, experimentando contracción o migración a los tejidos donde se puede mantener la
producción de Ab a largo plazo. Sin embargo, solo un pequeño número de ellos sobrevive a largo plazo como LLPC. Podría ser que la mayoría de los PB inducidos estén
predestinados a una vida corta ( 58). Los autores sugirieron que el DENV podría estar induciendo la supervivencia de las células B con reactividad cruzada, ya que el aumento de
los PC poliserotipos específicos durante una infección secundaria por DENV parece estar mediado por las CMM de reactividad cruzada formadas durante infecciones heterólogas
previas ( 59 , 62 ).
Aunque en algunos casos las PB muestran una fuerte respuesta policlonal a la proteína E, su especificidad no es representativa de los Abs
séricos secretados por las LLPC en la fase de memoria ( 63 ). En busca de un posible patrón genético específico del dengue con respecto al
uso de genes V y J tanto para la cadena H como para la cadena L, se describió en los PB específicos y no específicos de DENV aislados de
infecciones secundarias, que los PB específicos del DENV mostraron una preferencia para la familia VH1, mientras que el uso del gen VH3
fue dominante en las CMM ( 63). Los autores sugirieron que DENV podría unirse selectivamente a las células B utilizando genes de la familia
V bastante inusuales y que estas células B se activarían de manera eficiente y se diferenciarían en PB durante la enfermedad aguda. En
comparación con la respuesta pauci-clonal observada a las vacunas contra la influenza en sujetos con inmunidad preexistente, las
respuestas de los PB a la infección por DENV fueron relativamente policlonales ( 61 , 63 ).
Teniendo en cuenta las respuestas de Ab neutralizantes a DENV, los datos sugieren que después de infecciones secundarias, las células B
recién activadas producen Abs neutralizantes. Esto se debe a que hay un aumento de la respuesta de las CMM con reactividad cruzada que
producen Abs con reactividad cruzada y no neutralizantes, que preferirían potenciar la infección en lugar de controlarla ( 56). Según esto,
los Abs neutralizantes serían producidos por células B recientemente activadas. Comprender la naturaleza de las células B activadas o
reactivadas es de particular relevancia en el contexto de esfuerzos de vacunación humana eficientes y más seguros. Será importante
determinar en qué medida se seleccionan los clones de PB específicos de Ag definidos del grupo de memoria y si modifican su especificidad
o afinidad en la fase de memoria, ya que esto podría ayudar a determinar correlaciones de protección más precisas ( 63 ). Se desconoce si
un encuentro secundario durante una infección por DENV heteróloga modificará las afinidades de las MBC de reactividad cruzada
generadas durante las primeras reacciones de GC.
Además de una asociación de números altos de PB con infección secundaria grave por DENV y con la producción de Abs de memoria que reaccionan de
forma cruzada con serotipos heterotípicos de DENV, el DENV también induce la activación, proliferación y muerte celular de células B, principalmente
en pacientes con SD, lo que sugiere que La infección por DENV promueve la muerte de las células B inducida por la activación y quizás un aumento del
recambio de las células B. La muerte celular se ha determinado por la expresión de caspasa-3, un marcador de apoptosis, y por el aumento de la
expresión del marcador proapoptótico CD95 ( 57 ). Al analizar los genes apoptóticos regulados positivamente en PBMC durante la fase aguda de la
infección natural por DENV, en pacientes con SD, se encontró la regulación positiva del gen de translocación de células B 1 ( BTG1), y de muchos otros
genes apoptóticos en las células B. Sin embargo, no se analizó qué subconjuntos de PBMC se sometieron a apoptosis ( 64 ). Otro informe mostró que
una población de células T CD8 + apoptóticas aumenta entre las PBMC apoptóticas en pacientes con SD, pero no se examinó la apoptosis en la fracción
de células B ( 65 ). ¿El DENV induce la muerte en las células B? ¿Es la apoptosis el mecanismo de esta desaparición celular? Es de destacar que la
apoptosis es una forma "silenciosa" de muerte que previene, en lugar de promover, la inflamación. ¿Es esta muerte de células B inducida por activación
un mecanismo ventajoso para que el virus establezca con éxito la infección o para evitar una inflamación manifiesta al inducir la apoptosis?
El patrón de expresión génica en la fracción PB de PBMC de pacientes con DH mostró que el grupo de genes del ciclo celular / retículo endoplásmico
mostraba una fuerte correlación positiva con los linfocitos CD19 +. El análisis de citometría de flujo reveló que la mayoría de los PB / PC también
expresaban el Ag Ki67 nuclear asociado al ciclo celular, lo que indica que de hecho estaban proliferando ( 60 ). También se encontraron genes asociados
con la regulación de la apoptosis entre el grupo cuyas transcripciones fueron más abundantes durante la infección temprana por DENV, lo que se
correlaciona con la expresión de marcadores de apoptosis como caspasa-3 y Fas en PB y células B ( 57 , 60). En conjunto, los datos sugieren que DENV
induce una fuerte respuesta de células B dominada por PB con reactividad cruzada durante la fase aguda de la infección; esta respuesta incluye
proliferación celular y muerte celular, aparentemente por apoptosis no inflamatoria, y también un aumento del recambio de células B.
Es importante destacar que, a pesar de las dificultades, la mayoría de los informes sobre las respuestas de las células B durante la infección por DENV se basan en muestras
humanas. Para tratar de superar algunas de estas complicaciones, otros estudios con DENV han utilizado modelos animales, por ejemplo, ratones; sin embargo, se han
informado muy pocos hallazgos con respecto a las respuestas de las células B. En uno de ellos, los ratones infectados con DENV fueron desafiados con LPS y se evaluó la
respuesta de Ab contra esta molécula. La respuesta a LPS fue significativamente menor en ratones infectados con DENV en comparación con animales inoculados con
condiciones de control como DENV inactivado. Estos resultados sugieren que la infección por DENV en ratones puede disminuir las funciones intrínsecas de las células B y que
esta "supresión" inmune podría ser causada por la replicación viral activa y no por los propios Ags virales.66 ).
Otro estudio mostró que después de infecciones secundarias por DENV en el modelo murino inmunodeficiente (ratones AG129), el aumento de la avidez específica de DENV
en Abs no se asoció con un aumento de Abs neutralizantes específicos de DENV, cuya producción parece estar mediada por células B vírgenes ( 67 ).
Es importante enfatizar que a pesar del hecho de que los PB, PC y MBC cambiados de clase se generan y seleccionan principalmente en reacciones de GC, hasta ahora no hay
estudios sobre la posible participación (o no) de los GC durante la infección por DENV. El GC es un microambiente muy complejo, donde la expansión y selección de células B
clonales ocurre en respuesta a Ags dependientes de células T. En los GC se utilizan dos mecanismos moleculares cruciales, la hipermutación somática y la recombinación de
cambio de clase. El resultado de la reacción de GC es la generación de células / PC secretoras de Ab de larga duración y de alta afinidad, y MBC, desarrollando así una
protección inmediata y a largo plazo contra las reinfecciones ( 68 - 70). Sin embargo, no sabemos cómo se modifica la afinidad, especialmente durante infecciones secundarias
por DENV homólogas y heterólogas. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que el DENV administrado por vía cutánea tiene la capacidad de infectar ratones
inmunocompetentes induciendo una fuerte respuesta GC. El resultado general de estas respuestas GC parece una mayor cantidad de células B GC específicas de prM y un
título más alto de Abs para prM que para la proteína viral E ( 50 ). Es concebible que las proteínas DENV puedan estar induciendo Abs de memoria tanto neutralizantes como
no neutralizantes; algunos de estos (los no neutralizantes) potencialmente potenciarían la infección de otras células diana a través deFcγRs, según la hipótesis ADE,
asegurando así el éxito de infecciones heterólogas secundarias. Además, se desconoce si los Abs de memoria de reacción cruzada del primer encuentro con DENV modifican la
activación, la maduración de la afinidad y la selección de las células B durante las reacciones de GC en las infecciones heterólogas subsiguientes por DENV.
Respuesta primaria de células B y Ig M durante la infección
En los primeros encuentros con los huéspedes, la mayoría de los patógenos desencadenarán una respuesta inmune humoral primaria caracterizada por un
aumento temprano de los Abs IgM específicos de Ag en una reacción extrafolicular independiente de las células T, y si las circunstancias complejas lo
permiten, esto podría ir seguido de una maduración de la afinidad. , cambio de isotipo Ab, y el consiguiente aumento de títulos de Ab de IgG, IgA o IgE
específicos de Ag, pero ahora de una manera dependiente de las células T ( 71 ). Por ejemplo, los Abs de IgM primarios brindan protección, y su ausencia en
ratones infectados por influenza provocó un aumento de la carga viral en los pulmones, con niveles significativamente reducidos de Abs de IgG1 e IgG2a
específicos del virus ( 72 ). Cabe destacar que, a pesar del hecho de que la IgM específica de DENV se ha utilizado durante mucho tiempo como diagnóstico
de la infección por DENV ( 73), la fuente precisa de células B y los mecanismos efectores putativos de estos Abs de IgM no están claros. Abs de IgM podría
provenir de varias fuentes posibles de células B, como de reacciones extrafoliculares por células B B1, de células B de transición o de células B de la zona
marginal (MZ) en humanos y ratones, además de las células foliculares B o B2 por reacciones extrafoliculares en un Mecanismo independiente de las
células T ( 74 - 77 ). Aunque se ha explorado menos, algunos informes sugieren que las IgM-PC también podrían provenir de respuestas foliculares a través
de reacciones GC ( 78 - 80 ). Las células B de transición corresponden al tipo de células B más inmaduras en la sangre periférica ( 74 ), mientras que las
células B MZ son células B identificadas en la MZ del bazo solamente ( 76). Por otro lado, las células B1 B constituyen un linaje de células B distinto, son
parte de la respuesta inmune innata y generan efectores rápidamente en las primeras etapas de una respuesta inmune humoral ( 81 ). Sin embargo, estas
posibilidades apenas se han explorado durante las infecciones por DENV naturales o experimentales.
Como se mencionó anteriormente, muy pocos estudios se han centrado en los Abs “naturales” primarios durante la infección por DENV, por ejemplo, la IgM
se puede encontrar en infecciones secundarias aunque, comúnmente, los títulos promedio son más bajos que en las primarias ( 82 ). Sin embargo, se ha
informado que la respuesta de IgM humana a DENV podría tener una reacción cruzada predominantemente entre los serotipos de DENV, y esta respuesta
de IgM es significativamente mayor en pacientes con SD que en pacientes con DF (fase aguda) ( 83 - 85 ). Además, aunque se ha descrito que algunos Abs
de IgM tienen la capacidad de neutralizar DENV, los epítopos que reconocen parecen bastante discontinuos o conformacionales ( 86 ).
Respuesta primaria de células B y Ig M durante la infección
Además, en el suero de pacientes con DENV, es posible encontrar IgM Abs que reaccione de forma cruzada con plaquetas, un hallazgo que
puede contribuir a explicar en parte la patogénesis del DENV. Debido a la activación de las células B policlonales que causaría el DENV, esto
podría conducir a la producción de IgM ( 56 , 83 ), pero no se han evaluado las células que producen estos Abs de IgM. En ratones
inmunodeficientes humanizados BLT-NSG (ratones NOD- scid IL2r γ null ), la respuesta Ab se caracterizó por la falta de producción de IgG
específica de DENV pero por la presencia de células B secretoras de IgM específicas de DENV, tal vez debido a un número elevado de células
B inmaduras (transicionales) en la periferia ( 87). Se ha pasado por alto la investigación sobre las respuestas primarias de Ab “naturales” al
DENV, y se necesitan más estudios para dilucidar su papel durante la infección, ya sea en la eliminación del virus o en la patogenia. A pesar
de la reactividad cruzada de Abs IgM a los serotipos DENV, al parecer, no están contribuyendo a mejorar la infección ( 88 ). Sin embargo,
podrían estar involucrados en el desarrollo de la patogenia, ya que pueden reconocer auto-Ags en plaquetas. Parecería que las propiedades
potenciadoras de los Abs están restringidas a las de memoria de cambio de clase (IgG).
Los esfuerzos para dilucidar cómo es que Abs memoria putativo no neutralizantes podrían mejorar la enfermedad han descrito in
vitro utilizando líneas celulares que a través de subneutralizantes o no neutralizantes Abs, infección DENV suprime la inmunidad celular
innata a través de FcγRs, facilitando así la replicación viral ( 89 - 91 ). Experimentos similares en cultivos de células primarias humanas
parecen proporcionar diferentes vías para potenciar la infección por DENV a través de FcγRs ( 92 , 93 ). No obstante, aún no está claro si
estos mecanismos dependen de FcγR particulares ( 94 , 95 ). Datos de in vitroLos estudios indican que cualquier especificidad de los Ac
monoclonales frente al dengue podría formar complejos inmunes infecciosos (CI), siendo el requisito principal una concentración de Ab por
debajo de la necesaria para la neutralización ( 94 , 96 ). A este respecto, se ha descrito que la densidad de Ag-IgG y FcγR reticulados en
macrófagos podría influir en la fagocitosis y la producción de IL-10 ( 97 ). Algo similar podría estar sucediendo con la infección por DENV.
Respuesta de células B de memoria a largo plazo
Con respecto a la biología de las células B, quizás la función más importante de las células B es convertirse en células productoras de Ab. Hay muchos
buenos estudios sobre Abs durante la infección por DENV y recientemente sobre los epítopos de DENV que los inducen. Sin embargo, los resultados han
sido de alguna manera desconcertantes ya que los Abs neutralizantes de memoria constituyen una pequeña fracción de la actividad de neutralización anti-
DENV en sueros inmunes humanos ( 4 , 7 , 8 , 15 , 98 ). Además, ciertos Abs se han relacionado con la potenciación de la infección en el mecanismo
llamado ADE, donde los Abs de memoria de una infección primaria estarían potenciando una infección secundaria por DENV heteróloga ( 6). Sólo muy
recientemente se publicaron los primeros hallazgos sobre los epítopos de DENV que definen las respuestas de Ab en humanos, así como los mecanismos
que el virus parece utilizar para infectar las células huésped ( 7 , 8 , 15 ). Los Abs de memoria no neutralizantes podrían convertir las partículas inmaduras
de DENV en infecciosas; por lo tanto, los virus no infecciosos pueden ingresar a través de FcγR y replicarse de manera eficiente, lo que lleva a más células
infectadas, lo que puede contribuir a una enfermedad más grave ( 23 , 24 ).
Los Abs de memoria, que están presentes antes de que ocurra una exposición antigénica secundaria, constituyen una estrategia evolutiva (anticipatoria)
muy poderosa para hacer frente a posibles infecciones posteriores; esto puede permitir la neutralización de un patógeno dado antes de que una segunda
infección esté bien establecida ( 99 ). Los MBC son los implicados en la respuesta de recuerdo de Ag y se activan rápidamente durante una infección
secundaria. La activación de MBC es más rápida, lo que proporciona una protección rápida contra la reexposición a Ags potencialmente peligrosos cuando
los MBC se diferencian de los PC y generan inmunidad de células B duradera ( 100). Los Abs de memoria liberados por estos PC deberían neutralizar DENV,
como sería el caso en las reinfecciones homólogas. Sin embargo, durante las reinfecciones heterólogas de DENV, algunas LLPC y MBC podrían ser
aparentemente "responsables" de producir Abs que facilitan la infección ( 101 - 103 ), un tema importante que aún debe aclararse bien. No se ha evaluado
en la infección por DENV cómo se desarrolla la maduración de la afinidad durante el primer encuentro con el virus y si la afinidad de las MBC se modifica
durante una infección heteróloga secundaria.
Respuesta de células B de memoria a largo plazo
Los Abs de memoria IgG se generan principalmente a través de reacciones dependientes de células T. Muchos de los Abs de memoria conmutada de clase no neutralizantes durante la
infección por DENV se dirigen contra epítopos que se encuentran principalmente en partículas inmaduras, como prM y E Ags ( 7 , 8 , 15 , 27 , 28 , 104 ). Estas respuestas de Ab
potencialmente potenciadoras y no neutralizantes son las actividades funcionales dominantes que se destacan para los Abs específicos de DENV codificados por MBC, que
predominan en la circulación incluso dos o más décadas después de la infección por DENV ( 103 ). Además, incluso los Abs neutralizantes pueden actuar, al menos in vitro., como
potenciadores cuando se encuentran en concentraciones subneutralizantes ( 7 , 15 , 102 , 103 ). Además, los Abs de memoria con conmutación de clases neutralizantes constituyen
una pequeña fracción de la actividad de neutralización y unión anti-DENV en sueros inmunes humanos y se dirigen preferentemente a EDIII ( 4 , 7 , 8 , 15 , 98 ). Curiosamente, los Abs
específicos de serotipos de DENV neutralizantes más potentes se unieron a epítopos conformacionales complejos que se encuentran solo en las partículas virales intactas ( 2 , 5 , 101
, 102 ).
Se ha informado que la respuesta de células B detectada temprano después de la infección primaria por DENV es predominantemente específica de serotipo, mientras que las
respuestas detectadas temprano después de la infección secundaria son predominantemente de reacción cruzada de serotipo ( 56 , 59 ). Los Abs detectados durante la infección
secundaria reconocen múltiples serotipos de la proteína E de DENV y tienen mayor avidez por los epítopos heterólogos. Incluso después de la infección por DENV, es posible observar
en pacientes posconvalecientes (6 meses después de la infección primaria) células B reactivas a proteínas E heterólogas en momentos tardíos, que estaban ausentes antes (durante la
fase aguda) ( 62). Además, los PB, que se generaron a partir de un grupo muy diverso, madurado por afinidad y seleccionado de MBC y que no proliferaron extensamente antes de
diferenciarse en PB, también pueden conducir a la pérdida de especificidad del dengue debido a esta proliferación limitada ( 63 ). Por lo tanto, podríamos preguntarnos: ¿el DENV
está induciendo una supervivencia preferencial y / o generación de MBC con reactividad cruzada para asegurar una infección exitosa durante los encuentros secundarios?
En el caso de la última vacuna DENV (CYD-TDV), aunque se dispone de pocos datos sobre la generación de memoria inmunitaria a largo plazo, muy recientemente se ha comprobado
en individuos tras 5 años de vacunación que las CMM específicas de DENV son escasas en sangre y segregan bajas cantidades de Abs cuando se estimula. Los Abs circulantes
mostraron títulos bajos 5 años después de la vacunación, y estos Abs de individuos vacunados tenían una eficacia in vivo limitada contra DENV2. Aunque el tamaño de la muestra era
demasiado pequeño para obtener conclusiones definitivas, la memoria inmunitaria después de la vacunación con CYD-TDV parece relativamente baja ( 105 ).
Cómo llegan los Ags de dengue a los folículos de ganglios
linfáticos regionales
Como se mencionó anteriormente, el DENV inoculado cutáneamente infecta ratones inmunocompetentes e induce una fuerte respuesta GC ( 50 ). Por otro lado, los MBC de larga duración se generan a través de GC ( 69), y DENV Ags dentro de los folículos de células B probablemente
sean necesarios para impulsar estas respuestas de GC. Sin embargo, no está claro cómo DENV o DENV Ags llegan primero a los ganglios linfáticos de drenaje (DLN) regionales al sitio de inoculación y luego a los folículos de células B dentro de estos ganglios regionales. De hecho,
todavía no está claro, y bajo un escrutinio reciente, cómo es que muchos otros Ags llegan a los folículos e inician la activación de las células B. Se han descrito algunos mecanismos que destacan dónde y cómo las células B foliculares se encuentran con Ags. Primero es cómo los Ags
están llegando a los DLN; a este respecto, se sabe que el tamaño de Ag es un factor importante, por ejemplo, Ags particulado (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, perlas inertes recubiertas con Ag, etc.) y los CI grandes están unidos por macrófagos del seno subcapsular
(SCS).a través de la linfa aferente y, en algunos casos, transportan estos Ags a las células B subyacentes ( 106 - 109 ). Los macrófagos murinos del LN SCS facilitan la activación de las células B in vivo al recolectar y mostrar Ags nativos ( 108 , 110 ). Por el contrario, los Ags pequeños
(menos de 70 kDa) se canalizan rápidamente hacia los folículos a través de conductos. Los conductos de NL constituyen una derivación de fluido eficaz entre el SCS y el lumen de los vasos sanguíneos donde las sustancias de bajo peso molecular alcanzan el lumen de las vénulas de
endotelio alto ( 111 ). Se propone que los pequeños Ags entren en los folículos a través depequeños espacios en el piso del seno LN donde están unidos por células B afines o que la mayoría de los Ag transmitidos por los linfáticos ingresan primero a los folículos a través de
conductos ( 107 , 112 , 113 ). Los resultados también han demostrado que las células B afines podrían absorber Ags directamente de los conductos, posiblemente en los espacios entre las células reticulares fibroblásticas y el conducto, según lo identificado por microscopía
electrónica ( 107 ).
Por otro lado, en cuanto a la distribución de Ags dentro del DLN, es importante si el encuentro con ese Ag es por primera vez o si es un segundo encuentro con el mismo Ag. Los estudios sobre la captura temprana de Ag mostraron que mientras la mayoría de los Ags quedan
atrapados y degradados en la región medular durante su primer encuentro, en un desafío posterior, los complejos Ag-Ab quedan atrapados inicialmente en el piso del SCS ( 114 , 115 ). En ambos casos, pequeñas cantidades de Ag logran infiltrarse en el folículo y pueden ser retenidas
allí en las células dendríticas foliculares (CDF) durante períodos de tiempo prolongados ( 115 , 116 ). Los macrófagos SCS capturan y presentan Ag intacto en forma de CI, virus y partículas similares a virus, para activar las células B foliculares (106 , 108 , 109 ). Sin embargo, cómo es
que las células B vírgenes se activan en el primer encuentro con Ag, y cómo “deciden” entrar en los folículos para someterse a reacciones de GC, o no, aún no está claro para muchos Ags y completamente desconocido para DENV.
Además, los estudios clásicos han sido muy instructivos al describir la absorción de Ags por las FDC ( 116 ). Las FDC son más prominentes durante las reacciones de GC, y la retención de FDC de Ags es esencial para la selección clonal de células B dentro de GC ( 107 ). No está claro si
la retención de Ag también es necesaria para el mantenimiento de la memoria DENV y las células B efectoras. Algunos estudios apoyan el papel de la persistencia de Ag en el mantenimiento de la memoria de las células B ( 107 , 117). Sin embargo, se desconoce cómo y si los DENV
Ags se localizan o persisten en las FDC durante las infecciones primarias o secundarias. ¿Se retienen los DENV Ags en las FDC después de una infección primaria por DENV? ¿Y si es así, por cuánto tiempo? ¿Participan en la maduración por afinidad y la selección de las células B y en la
generación de Abs con reactividad cruzada durante una infección heteróloga secundaria?
En el modelo murino inmunodeficiente (ratones AG129), se ha demostrado que los macrófagos del SCS son importantes para controlar la propagación del DENV. Estos macrófagos SCS contenían proteína NS1, lo que probablemente implica que están atrapando DENV Ags ( 118
). Además, hemos demostrado la presencia de proteínas DENV E, prM y NS3 dentro de los folículos de células B y GC, lo que indica que los Ags de DENV están alcanzando los DLN y también plantean la posibilidad de que DENV incluso se esté replicando en estos compartimentos de
tejido linfoide ( 50 ) . Sin embargo, no está claro cómo los DENV Ags finalmente están llegando a los LN. Nosotros y otros hemos encontrado células dendríticas cutáneas (DC) infectadas con DENV en explantes de piel sana de cadáver y no cadáver humanos infectados ex vivo ( 119 -
121 ). Las CD son células centinelas especializadas que captan Ags en sitios periféricos y viajan a los DLN y las transportan a áreas de CD donde las células B que migran hacia los folículos también pueden encontrar estas Ags ( 122 ). Es muy probable que el DENV esté llegando a las
DLN también a través de las CD cutáneas o por la circulación linfática, pero esto debe demostrarse formalmente ya que casi nada se ha explorado al respecto. Muy recientemente, mediante citometría de flujo, fue posible encontrar en ratones inmunodeficientes infectados por DENV
intradérmicamente [ratones con inactivación del receptor IFN-α / β (IFNAR)], DC migratorias infectadas con DENV en el nódulo de drenaje de la piel. Esto sugiere que las CD dérmicas pueden ser portadoras de DENV y probablemente iniciar la respuesta inmune antiviral adaptativa (
121). Sin embargo, no se ha evaluado exactamente dónde (y cómo) se localiza el DENV dentro de los DLN después de la infección cutánea. Es posible que las CD infectadas con DENV se localicen en la zona interfolicular o en la zona de células T dentro de las DLN, lo que permitiría la
activación de células B tanto foliculares como extrafoliculares.
Para explorar cómo DENV (de la piel) podría llegar a los DLN, hicimos experimentos preliminares de seguimiento de DENV etiquetado u ovoalbúmina (OVA, como control) tras la inoculación cutánea. Según lo informado por otros ( 123 , 124 ), OVA se encontró en el SCS de DLN muy
temprano (1 h) después de la inoculación, pero no DENV, que solo se observó más tarde en DLN (datos no publicados). El marcado doble reveló que los macrófagos aparentemente atrapaban el DENV cuando llegaba a los DLN, ya sea por linfa o en células que podrían transferir el Ag
a los macrófagos. Las CD concebibles e infectadas con la piel podrían estar transportando DENV directamente a los DLN ( 121 ). Todo esto sugeriría que el DENV derivado de la piel ingresa a DLN a través delinfa y que en estadios bastante tempranos, el DENV entrante parece
contenido por macrófagos en el área subcortical, un fenómeno también descrito para otros Ags como Salmonella adelaide flagella ( 114 ).
Consideraciones finales
A pesar del hecho de que las respuestas de Ab son generadas por las células B, sabemos sorprendentemente poco sobre las
respuestas de las células B (agudas, crónicas o de memoria) y los mecanismos celulares que generan estos Abs durante las
infecciones por DENV, tanto en humanos como en modelos animales. Se supone que las células B y T participan tanto en la
protección como posiblemente en la potenciación putativa de la enfermedad. Conocer qué epítopos están impulsando las
diferentes respuestas de Ab y cómo es que se establecen afinidades de Ab mayores o menores durante la infección y si estos
eventos influyen en la protección o patogénesis durante la enfermedad, podría ser de gran utilidad para diseñar de manera
más eficiente, y particularmente en el caso del dengue, vacunas más seguras. Esto podría ser especialmente relevante en la
situación actual de infecciones por virus concomitantes, como Zika y Chikungunya, donde es necesario aclarar la posible
participación de la memoria inmunológica del DENV en el resultado de estas infecciones. Es de destacar que recientemente
se describió que la vacuna DENV más avanzada (CYD-TDV) “camina sobre la cuerda floja” ya que el perfil de seguridad a corto
plazo era benigno [la eficacia informada al comienzo de los ensayos clínicos fue del 30,2% (125 )], pero después de 25 meses
de vigilancia de la enfermedad, fue difícil extraer conclusiones definitivas ( 126 , 127 ). Además, parece necesaria una
inmunidad previa para la eficacia de esta vacuna ( 125 , 126 ). Necesitamos comprender mejor estos hallazgos antes de que
esta vacuna pueda declararse segura. Por lo tanto, una mayor comprensión de las respuestas de las células B en sus
diferentes etapas y compartimentos durante las infecciones naturales por DENV es fundamental para desarrollar estrategias
que contrarresten mejor el aumento, no solo de las infecciones por DENV, sino también de otras enfermedades virales
emergentes relacionadas.

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Revisión de tema: Linfocitos B y dengue

Dora Emilia Fierro Rodríguez

 Virus endémico en mas de 100 países.

Dengue sin signos

La proteína M se forma primero como un precursor llamado proteína M

 La proteína estructural E tiene tres dominios (EDI-III).

¿Están las células B infectadas con DENV?

¿Están infectados solo en sangre periférica o también en

La inoculación cutánea de DENV induce una mayor cantidad de células GC B

Distribución in situ de proteínas DENV dentro de GC en DLN

Activación de células B policlonales después de la infección por dengue.

Respuestas de células B a largo plazo (memoria) y abs de memoria

Subconjuntos de células B humanas tienen funciones reguladoras

 Definir la distribución de subconjuntos de células B en la fase

≥ 2 años Hospital Kanta Bopha en En las 96 h del inicio de la

 En total, 81 pacientes con dengue positivos.

 Hemograma completo disponibles para 59 niños incluidos.

 Donantes sanos de la misma edad y sexo ( n = 29).

Concentraciones de CD40L y su asociaci ón con el Producción de citocinas en células B de

 Respuesta funcional de células B funcionalmente deteriorada en pacientes con dengue.

 Marcado aumento en los porcentajes de plasmablastos y células plasmáticas en

 No hay diferencias en las concentraciones plasmáticas de APRIL.

 Disminución de dos veces en las células CD24 hihi CD38 hihi dentro de la población de células

 Observamos un aumento de la expresión de CD32B y LILRB1 en células CD19 ++ CD27 -- B directamente ex

Un hombre blanco de 40 años, de profesión ingeniero, nacido en Estados Unidos.

 2 semanas antes de la presentación de los síntomas, estuvo de vacaciones en Borakai.

 Signos de picadura en antebrazo derecho (insecto desconocido) y desarrolló un pequeño nódulo.

 Se realizó un diagnóstico presuntivo de dengue agudo.

Recuento de glóbulos blancos de 5800/ µl (rango de referencia, 4,1-10,9).

La biopsia y el aspirado de médula ósea fueron normales.

Inmunoglobulinas policlonales y otras proteínas séricas estaban presentes en su orina.

• Pruebas serológicas para el virus del dengue

• Se mantuvieron las pruebas de función hepática levemente elevado.

Dora Emilia Fierro Rodríguez

Virus de ARN monocatenario de sentido positivo (familia Flaviviridae).

Potenciación de la infección dependiente de anticuerpos

Anticuerpos de reacción cruzada pueden aumentar la infección

Mecanismos de neutralización y potenciación por anticuerpos

Niveles más bajos de ocupación de epítopos: Ac pueden mejorar

La magnitud de la respuesta de plasmablastos en pacientes con dengue aumenta

Una cuestión clave relacionada con la función de los plasmablastos en el

En promedio, más del 70% de los plasmablastos en los individuos

Los Ab específicos de DENV producidos por plasmablastos reaccionaron con

En los pacientes infectados con DENV-3 con enfermedad grave en nuestro

Otros estudios revelaron frecuencias significativamente más altas de

Experimental and Molecular Pathology 97 (2014) 208–210

Primer caso que se conoce de mielofibrosis asociada al dengue.

La trombocitopenia es una manifestación constante del dengue.

• Un varón de 52 años previamente sano ingresó en nuestro hospital por anemia, trombocitopenia,

• Recordó haber tenido picaduras de mosquitos mientras estaba en Vietnam. Fue evaluado en

A los dos meses:

Las tomografías computarizadas de tórax, abdomen y pelvis:

Los estudios de laboratorio en la admisión:

Anticuerpos séricos contra el dengue:

A los dos meses:

El examen de la médula ósea se hizo al 4 de hospitalización.

Tres días después del alta:

1. Controles sanos (+/-)

RT PCR tr dengue carga viral y caracterización de serotipo (plasma o suero? - cantidad)

Qué es importante evaluar en células infectadas con dengue

Apoptosis, ROS, carga viral en células infectadas con dengue

Lo que se conoce y qué debemos mejorar para conocer

Transmitido por los mosquitos vectores Aedes aegypti y en menor medida Aedes