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BMB
Informes
Generación y caracterización de un anticuerpo monoclonal contra
el MERS-CoV dirigido a la proteína espiga utilizando un complejo de
péptido sintético epítopo-CpG-ADN-liposoma
Parque Byoung Kwon1, Sony Maharjan1, Su In Lee1, Jinsoo Kim2, Joon Yong Bae3, Parque Man-Seong3y Hyung Joo Kwon1,2,*
1Centro de Investigación de Ciencias Médicas, Facultad de Medicina, Universidad Hallym, Chuncheon 24252,2Departamento de Microbiología, Facultad de
Medicina, Universidad Hallym, Chuncheon 24252,3Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina e Instituto de Enfermedades Virales, Universidad de
Corea, Seúl 02841, Corea
El coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV)
utiliza la glicoproteína de pico (S) para reconocer e ingresar a las
células objetivo. En este estudio, seleccionamos dos secuencias de
péptidos epitópicos dentro del dominio de unión al receptor (RBD) de la
proteína MERS-CoV S. Usamos un complejo que consiste en el péptido
epítopo de la proteína MERS-CoV S y CpG-DNA encapsulado en un
complejo de liposomas para inmunizar ratones y producimos los
anticuerpos monoclonales 506-2G10G5 y 492-1G10E4E2. Los datos de
Western Blot mostraron que ambos anticuerpos monoclonales
detectaron la proteína S e inmunoprecipitaron la forma nativa de la
proteína S. La inmunofluorescencia indirecta y el análisis confocal
sugirieron una fuerte reactividad de los anticuerpos hacia la proteína S
de las células Vero infectadas con el virus MERS-CoV. Además, el
anticuerpo monoclonal 506-2G10G5 redujo significativamente la
formación de placa en células Vero infectadas con MERS-CoV en
comparación con IgG de ratón normal y 492-1G10E4E2. Por lo tanto,
producimos con éxito un anticuerpo monoclonal dirigido contra el
dominio RBD de la proteína S que podría usarse en el desarrollo de
aplicaciones diagnósticas y terapéuticas en el futuro. [Informes BMB
2019; 52(6): 397-402]
INTRODUCCIÓN
El coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) es
un patógeno zoonótico mortal que causa la enfermedad respiratoria
aguda, MERS, en humanos (1-3). MERS-CoV, un betacoronavirus de linaje C,
apareció por primera vez en Arabia Saudita en junio de 2012 (3-5). Desde
entonces, los casos de infección humana por MERS-CoV se han
* Autor correspondiente. Teléfono: +82-33-248-2635; Fax: +82-33-241-3640;
Correo electrónico: hjookwon@hallym.ac.kr
https://doi.org/10.5483/BMBRep.2019.52.6.185
Recibido el 8 de agosto de 2018, Revisado el 5 de septiembre de 2018,
Aceptado el 11 de octubre de 2018
Palabras clave:Epítopo de células B, Lipoplex (O), MERS-CoV, Anticuerpo
monoclonal, Proteína Spike
ISSN: 1976-670X (edición electrónica)
Derechos de autorⓒ2019 por la Sociedad Coreana de Bioquímica y Biología Molecular
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) que
permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones y sin fines comerciales en cualquier medio, siempre que se cite debidamente la obra original.
BMB Rep. 2019; 52(6): 397-402
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informado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) de 27
países, en su mayoría de países de Oriente Medio (6). A nivel
mundial, hasta mayo de 2018, MERS-CoV ha causado un total de
2220 casos de infecciones con al menos 790 muertes individuales
(tasa de mortalidad: 35,6 %), y la mayoría se notificó en Arabia
Saudita (1844 casos con 716 muertes) (6) . Otro brote importante
fuera de Medio Oriente tuvo lugar en Corea del Sur en 2015, lo
que resultó en 186 casos con 36 muertes (7, 8). Una elevación en
la patogenicidad de MERS-CoV y la ausencia de vacunas o
terapias efectivas contra el virus podría ser una combinación
riesgosa que invite a una pandemia en el futuro. Por lo tanto, se
requieren con urgencia medidas terapéuticas ideales y efectivas
para la prevención y el tratamiento del MERS.
Informes anteriores han demostrado que los anticuerpos
monoclonales neutralizantes son candidatos potenciales para el
tratamiento de numerosas enfermedades, incluidas las infecciones
por virus, la disfunción inmunitaria y el cáncer (2, 9, 10). El genoma del
MERS-CoV consta de proteínas estructurales como la espiga (S), la
membrana (M), la envoltura (E) y la nucleocápside (N) (2, 11). La
glicoproteína S de MERS-CoV desempeña un papel crucial en la unión
viral y la posterior entrada en la célula huésped (12, 13). La
glicoproteína S se compone de dos subunidades: receptor que
reconoce S1 y fusión de membrana S2 (12, 13). La subunidad S1 de
MERS-CoV contiene el dominio de unión al receptor (RBD) que es
responsable de interactuar con el receptor celular dipeptidil peptidasa
4 (DPP4; también llamado CD26) en la membrana de la célula huésped
(13, 14). Las regiones de repetición de heptada (HR) 1 y 2 de la
subunidad S2 median la fusión entre las membranas viral y de la
célula huésped (12). Debido a la propiedad antigénica vital, la proteína
S ha sido el foco del desarrollo de estrategias terapéuticas contra
MERS (2, 11). Es importante destacar que la producción de
anticuerpos contra el RBD ha sido un factor determinante funcional
para la orientación diagnóstica y terapéutica prometedora (2).
Previamente generamos anticuerpos contra el virus de la hepatitis C
(15), virus de la gripe (16), virus sincitial respiratorio (17) y proteína
MERS-CoV M (18) mediante inmunización con un complejo de un
péptido epítopo de células B coencapsulado con ADN-CpG en una
dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE): colesterol hemi-
 Ab monoclonal a proteína S de MERS-CoV
Byoung Kwon Park,et al.
complejo de succinato (CHEMS) (denominado Lipoplex (O)). En este
estudio, seleccionamos nuevas secuencias peptídicas de epítopos de
células B, Spike-492 y Spike-492 (L506F), de la proteína-RBD MERS-CoV
S de cepas representativas de Corea del Sur y Arabia Saudita,
respectivamente. La secuencia peptídica del epítopo de células B,
Spike-492 (L506F), tiene una sustitución de un solo aminoácido de
fenilalanina por leucina en el residuo 506. Aquí, generamos
anticuerpos monoclonales, 506-2G10G5 y 492-1G10E4E2, específicos
contra la proteína S de MERS -CoV mediante la inmunización de
ratones con un complejo del péptido epítopo de células B y Lipoplex
(O). Nuestros datos muestran el potencial del anticuerpo monoclonal
506-2G10G5 para uso diagnóstico y terapéutico contra la infección
emergente por MERS-CoV.
RESULTADOS
Análisis del epítopo de células B y producción del anticuerpo
dirigido al epítopo de proteína S de MERS-CoV
La identificación y selección de epítopos de células B son uno de los
factores más importantes en la producción de anticuerpos basados en
epítopos. Por lo tanto, los epítopos de células B candidatos de la secuencia
de aminoácidos de la proteína MERS-CoV S se predijeron utilizando la
herramienta de base de datos y recursos de análisis de epítopos inmunes
(IEDB) basada en la predicción de epítopos, la accesibilidad de la superficie
y la escala de antigenicidad (http://tools. iedb.org/bcell). Porque la RBD
Figura 1.Producción del anticuerpo específico del epítopo de células B. (A)
Representación esquemática de la proteína MERS-CoV S. La proteína S
consta de subunidades S1 y S2. RBD, dominio de unión al receptor; FP,
péptido de fusión; HR1 y HR2, regiones 1 y 2 de repetición heptada; TM,
transmembrana; CP, cola citoplasmática. (B) Selección de la secuencia
peptídica del epítopo de células B usando el IEDB basado en la predicción
del epítopo, la accesibilidad de la superficie y el índice de antigenicidad. (C)
Análisis ELISA que muestra la generación de anticuerpos específicos MERS-
CoV Spike-492 o Spike-492 (L506F) utilizando sueros. Se aislaron sueros de
ratones BALB/c inmunizados con un complejo de péptido epítopo de
células B (Spike-492 o Spike-492 (L506F)) y Lipoplex (O).
398BMBInformes
El dominio dentro de la proteína S es responsable de la unión a la
célula huésped (2, 18), las secuencias peptídicas Spike-492 y
Spike-492 (L506F) correspondientes a los residuos de
aminoácidos 492-516 dentro del dominio RBD de MERS-CoV S Se
seleccionaron y sintetizaron proteínas (Fig. 1A y B). Para
determinar la eficacia de los péptidos como un epítopo de células
B, se formularon cada péptido y el complejo Lipoplex (O) y luego
se inmunizaron en los ratones BALB/c. Para rastrear los títulos de
anticuerpos, se realizó ELISA usando los sueros de los ratones
inmunizados. Ambos péptidos indujeron una producción robusta
de IgG específicas de péptido (Fig. 1C). Por lo tanto, los péptidos
epitópicos inmunogénicos se diseñaron y produjeron con éxito.
Figura 2.Purificación y caracterización del anticuerpo monoclonal
específico del epítopo anti-MERS-CoV Spike-492 (L506F). (A) El anticuerpo
monoclonal 506-2G10G5 purificado se analizó mediante SDS-PAGE. R,
condición reductora; NR, condiciones no reductoras. (B) El isotipo del
anticuerpo monoclonal 506-2G10G5 purificado se determinó mediante
ELISA. (C) La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal 506-2G10G5 al
péptido MERS-CoV Spike-492 (L506F) se midió mediante ELISA y la CE50valor
fue evaluado con el programa Sigma Plot. (DF) Los lisados de células Vero
infectadas y no infectadas con MERS-CoV se trataron con PBS (-) o PNGase F
(＋).Los lisados se inmunotransfirieron con el anticuerpo monoclonal
506-2G10G5 (D). Se realizó un análisis de transferencia Western usando el
anticuerpo monoclonal 506-2G10G5 después de la inmunoprecipitación de
los lisados con el anticuerpo monoclonal 506-2G10G5 (E). Los lisados se
sometieron a transferencia Western con un anticuerpo anti-actina (F). (G, H)
Reactividad cruzada de los anticuerpos monoclonales. Inmunoplacas de 96
pocillos recubiertas con los péptidos MERS-CoV Spike-492 (G) o Spike-492
(L506F) (H) e incubadas con el anticuerpo monoclonal 492-1G10E4E2 o
506-2G10G5. La reactividad de los anticuerpos para cada péptido se
determinó mediante ensayo ELISA.
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Producción y caracterización del anticuerpo monoclonal
específico del epítopo Spike-492 (L506F) o Spike-492 del MERS-
CoV
A partir de la fusión con células de mieloma SP2/0 y
esplenocitos de ratones inmunizados con el péptido
Spike-492 (L506F) o Spike-492 y Lipoplex (O ) complejo.
Para obtener el anticuerpo monoclonal a gran escala, se
recolectó líquido ascítico de los ratones inyectados con el
clon 506-2G10G5 (Fig. 2A) o el clon 492-1G10E4E2 (Fig.
S1A), y se purificaron los anticuerpos. A continuación, los
isotipos de los anticuerpos monoclonales 506-2G10G5 y
492-1G10E4E2 se determinaron mediante ELISA y se
encontró que eran IgG1 e IgG2a, respectivamente (Fig. 2B
y Fig. S1B). Las afinidades de unión de los anticuerpos
monoclonales dirigidos al péptido Spike-492 (L506F) y
Spike-492 se evaluaron mediante ELISA,
Detección de la proteína MERS-CoV S por el anticuerpo
monoclonal específico del epítopo Spike-492 (L506F) o
Spike-492 de MERS-CoV
Para caracterizar aún más si el anticuerpo monoclonal
506-2G10G5 o 492-1G10E4E2 reconoce la proteína S de MERS-
CoV, se realizaron transferencias Western e inmunoprecipitación
con células Vero infectadas y no infectadas con MERS-CoV. Los
resultados de la transferencia Western (Fig. 2D, Fig. S1D y Fig.
S2A) muestran que ambos anticuerpos monoclonales detectaron
una banda de proteína correspondiente a la proteína S en el
rango de peso molecular en las células Vero infectadas con
MERS-CoV, sin embargo, no hubo banda. se observó en las
células Vero no infectadas. El tratamiento con péptido-N-
glucosidasa (PNGasa F) resultó en la reducción del peso
molecular aparente de la banda de proteína S en comparación
con la muestra no tratada (Fig. 2D y Fig. S1D), lo que sugiere que
ambos anticuerpos monoclonales podrían reconocer la proteína
S en su forma glicosilada y desglicosilada. Además, se realizó
inmunoprecipitación para evaluar si los anticuerpos
monoclonales podían reconocer la proteína S en su forma nativa.
Ambos anticuerpos monoclonales inmunoprecipitaron la forma
nativa de la proteína S de lisados de células Vero infectadas con
MERS-CoV (Fig. S1E y Fig. S2B). Además, ambos anticuerpos
monoclonales reconocieron la banda de proteína desglicosilada
en el lisado inmunoprecipitado tratado con PNGasa F (Fig. 2E y
Fig. S1E). Para determinar aún más la reactividad cruzada de los
anticuerpos monoclonales 506-2G10G5 y 492-1G10E4E2 con cada
epítopo correspondiente, se realizó ELISA. El anticuerpo
monoclonal 506-2G10G5 mostró una notable reactividad cruzada
con los péptidos Spike-492 que fue mayor que el resultado
mostrado por el anticuerpo monoclonal 492-1G10E4E2 contra
Spike-492 (L506F) (Fig. 2G y H). Por lo tanto,
http://bmbreports.org
Ab monoclonal a proteína S de MERS-CoV
parque byoung kwon,et al.
Reactividad del anticuerpo monoclonal 506-2G10G5 o
492-1G10E4E2 a la proteína S en las células infectadas por
MERS-CoV Para confirmar aún más la reactividad del anticuerpo
monoclonal 506-2G10G5 o 492-1G10E4E2, realizamos un ensayo de
inmunofluorescencia indirecta (IFA) en células Vero no infectadas e
infectadas con MERS-CoV. La microscopía de fluorescencia mostró una
fuerte señal de fluorescencia en las células infectadas con virus
incubadas con cualquiera de los anticuerpos monoclonales, mientras
que no se observó fluorescencia con el control de anticuerpo
secundario o IgG de ratón normal (Fig. 3A y Fig. S3A). Para corroborar
aún más la especificidad de ambos anticuerpos monoclonales contra
la proteína S de MERS-CoV, se realizó microscopía confocal. Las células
Vero infectadas o no infectadas con MERS-CoV se tiñeron con la IgG
de ratón normal o el anticuerpo monoclonal 506-2G10G5 o
492-1G10E4E2. Las imágenes de microscopía confocal muestran
claramente la señal de fluorescencia dentro de la región citosólica de
las células infectadas con MERS-CoV teñidas con el anticuerpo
monoclonal 506-2G10G5 o 492-1G10E4E2. No se observó tinción en
las células incubadas con el
Fig. 3.Ensayo de inmunofluorescencia y microscopía confocal para la
detección de células infectadas por MERS-CoV con el anticuerpo
monoclonal Spike-492 (L506F). (A) Ensayo de inmunofluorescencia
indirecta. Una mezcla de células Vero infectadas y no infectadas con
MERS-CoV se tiñó con el anticuerpo monoclonal 506-2G10G5 o IgG de
ratón normal, seguido de incubación con el anticuerpo IgG anti-ratón
de cabra conjugado con Alexa488 (verde). Las células se contrastaron
con Hoechst 33258 para tinción nuclear (azul). Las imágenes se
tomaron utilizando un microscopio de fluorescencia. (B) Microscopía
confocal. Las células Vero se infectaron con MERS-CoV durante 2 días.
Las células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal 506-2G10G5 o
IgG de ratón normal y luego se incubaron con el anticuerpo IgG anti-
ratón de cabra conjugado con Alexa488 (verde). Los núcleos se
tiñeron con Hoechst 33258 (azul). Barra de escala, 10 -m.
BMBInformes399
 Ab monoclonal a proteína S de MERS-CoV
Byoung Kwon Park,et al.
IgG de ratón normal o control de anticuerpo secundario (Fig. 3B y Fig.
S3B). Estos resultados demuestran que ambos anticuerpos
monoclonales reconocen eficazmente la proteína MERS-CoV S en las
células infectadas por MERS-CoV.
El anticuerpo monoclonal 506-2G10G5 inhibió la infección por
MERS-CoV en células Vero
Dada la especificidad y la afinidad de unión del anticuerpo
monoclonal 506-2G10G5 o 492-1G10E4E2 hacia la proteína S de MERS-
CoV, investigamos las actividades inhibidoras de ambos anticuerpos
monoclonales contra la infección por MERS-CoV mediante un ensayo
de reducción de placa. En este ensayo, ambos anticuerpos
monoclonales inhibieron la formación de placa en comparación con la
IgG de ratón normal de una manera dependiente de la concentración.
Sin embargo, se observó una mejor inhibición de la formación de
placa cuando se trató con el anticuerpo monoclonal 506-2G10G5 en
comparación con el anticuerpo monoclonal 492-1G10E4E2 (Fig. 4A y
B). Por lo tanto, los resultados demuestran la eficacia del anticuerpo
monoclonal 506-2G10G5, lo que significa sus posibles aplicaciones
terapéuticas contra la infección por MERS-CoV.
DISCUSIÓN
Se ha demostrado que la infección por MERS-CoV puede ser un
peligro grave para la salud de la humanidad en todo el mundo (1,
3). A día de hoy, no se dispone de tratamientos eficaces contra la
infección por MERS-CoV, lo que contribuye a su alta tasa de
mortalidad (2). Claramente, se necesita un enfoque eficaz para
neutralizar la infección viral. En los últimos años ha habido un
aumento en el desarrollo de anticuerpos monoclonales para el
tratamiento efectivo de varios virus infecciosos como la rabia, el
VIH, el SARS-CoV, la influenza y el ébola (9, 19). Aquí, producimos
y caracterizamos la especificidad y funcionalidad de un
Figura 4.Inhibición de la infección por MERS-CoV por el anticuerpo
monoclonal 492-1G10E4E2 y 506-2G10G5. El MERS-CoV se preincubó
con anticuerpo monoclonal IgG de ratón normal 492-1G10E4E2 o
506-2G10G5 diluido dos veces en serie durante 30 min a 37ºC.oC. La
mezcla de virus y anticuerpos se añadió a las células Vero y se incubó
durante 1 h. Después de la incubación, el medio se reemplazó con
DMEM/F12 que contenía agar oxoid al 0,6 %. Las placas se tiñeron con
cristal violeta 4 días después de la infección. (A) Una imagen
representativa que muestra el ensayo de reducción de placa. (B)
Cualificación del ensayo de reducción de placas contra MERS-CoV
después del tratamiento con 100 g/pocillo a 0 g/pocillo de IgG de
ratón normal o anticuerpo monoclonal 492-1G10E4E2 o 506-2G10G5.
400 BMBInformes
anticuerpo monoclonal contra la proteína S de MERS-CoV.
En estudios anteriores, seleccionamos con éxito péptidos de
epítopos de células B y producimos anticuerpos basados en nuestra
propia estrategia utilizando epítopos y CpG-DNA encapsulados con un
complejo DOPE: CHEMS como adyuvante (20). En este estudio,
informamos la generación y caracterización de anticuerpos
monoclonales contra dos epítopos de células B seleccionados en los
péptidos Spike-492 y Spike-492 (L506F) de la proteína MERS-CoV S.
Nuestros datos demuestran que los clones de hibridoma
492-1G10E4E2 y 506-2G10G5, obtenidos de ratones inmunizados con
los péptidos Spike-492 o Spike-492 (L506F) y el complejo Lipoplex (O),
producen anticuerpos específicos para la proteína MERS-CoV S y con
reactividad cruzada recíproca con los epítopos que representan las
cepas de Corea del Sur y las cepas de Arabia Saudita.
La eficacia de los anticuerpos se evaluó en función de la afinidad de
unión y la actividad neutralizante. De los dos anticuerpos
monoclonales, 506-2G10G5 tenía una mayor afinidad de unión a los
péptidos Spike-492 y Spike-492 (L506F) que la del 492-1G10E4E2.
Además, 506-2G10G5 exhibió una mejor actividad de neutralización
que la de 492-1G10E4E2 demostrada por el ensayo de reducción de
placas. Teniendo en cuenta que el anticuerpo monoclonal
506-2G10G5 se genera contra la secuencia peptídica dentro del
dominio RBD, el anticuerpo podría tener un efecto terapéutico
potencial además de su valor diagnóstico. Sin embargo, se requiere
más evidencia experimental para determinar la función terapéutica
del anticuerpo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Línea celular y virus
Se obtuvieron células Vero, células de riñón de mono verde
africano, de la American Type Culture Collection (ATCC Inc.).
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) adquirido de
Life Technologies (Thermo Fisher Scientific Co.) con suplementos
de suero bovino fetal al 10% (FBS, Thermo Fisher Scientific Co.),
HEPES 25 mM, penicilina 100 U/ml y 100 -g/ Se usaron ml de
estreptomicina en el cultivo de células Vero. Las células se
incubaron en una atmósfera de CO al 5%2y 95% aire a 37oC.
MERS-CoV/KOR/KNIH/002_05_2015 se obtuvo de los Centros para
el Control y la Prevención de Enfermedades de Corea (Permiso
No. 1-001-MER-IS-2015001).
Preparación y síntesis de péptidos.
La selección, el análisis y la síntesis de los péptidos del epítopo de
células B de la proteína MERS-CoV S se realizaron como se
describió anteriormente (21). Las secuencias peptídicas del
epítopo de células B para la proteína MERS-CoV S se
seleccionaron como Spike-492 (492TKPLKYSYINKCSRLLSDDRTEVPQ
516) de la cepa MERS-CoV (MERS-CoV/KOR/KNIH/002_05_2015 (GI:
829021049)) y Spike-492 (L506F) (492TKPLKYSYINKCSRFL
SDDRTEVPQ516) de la cepa MERS-CoV (secuencia universal de
glicoproteína de Spike (GI: 510785803)), y sintetizado con un
sintetizador de péptidos automatizado (Peptron III-R24,
http://bmbreports.org

Peptron Inc.). Se preparó un complejo del péptido del epítopo de
células B y CpG-DNA (MB-ODN 4531 (O)) coencapsulado en DOPE:
CHEMS (denominado Lipoplex (O)) como se describió
previamente (17).
Inmunización de ratones
BALB/c de cuatro semanas (H-2b) se compraron ratones hembra
de Nara-Biotec Co. Ltd. Los ratones se mantuvieron en una
instalación para animales en condiciones libres de patógenos
específicos. Todos los experimentos que involucraron a los
animales se llevaron a cabo con la aprobación del Comité
Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de
Hallym (Hallym2016-51). Los ratones se inmunizaron por vía
intraperitoneal tres veces a intervalos de 10 días con 200 l del
péptido Spike-492 (50 g) o del péptido Spike-492 (L506F) (50 g) y
el complejo Lipoplex (O) (17, 22, 23).
Producción de anticuerpos monoclonales contra la proteína MERS-
CoV S
Los anticuerpos monoclonales se produjeron de acuerdo con el
método estándar como se describió previamente (24, 25). Los
esplenocitos aislados de los ratones se fusionaron con células SP2/0
de ratón (ATCC Inc.) en presencia de solución de polietilenglicol (PEG,
Sigma Chemical Co.). Para adquirir clones positivos que produzcan el
anticuerpo monoclonal específico MERS-CoV Spike-492- o Spike-492
(L506F), se utilizaron medio HAT (Sigma Chemical Co.) y medio HT
(Sigma Chemical Co.) para los cultivos y para la selección de células de
hibridoma. Para una producción a gran escala de los anticuerpos
monoclonales, se recogió líquido ascítico de ratones inyectados por
vía intraperitoneal con los hibridomas seleccionados y se purificó
mediante cromatografía en columna de proteína A como se describió
previamente (17).
Ensayos ELISA
Para medir el título de anticuerpos específicos del péptido
epítopo, se recubrieron inmunoplacas de 96 pocillos (Thermo
Fisher Scientific Co.) con 5 g/pocillo de los péptidos MERS-CoV
Spike-492 o Spike-492 (L506F). Los sueros de los ratones se
obtuvieron mediante sangrado retroorbital y se analizaron
como se describió anteriormente (22). Para identificar el
isotipo del anticuerpo monoclonal, se utilizó el anticuerpo
IgG anti-ratón conjugado con HRP (cada isotipo) (Southern
Biotechnology Associates Inc.). Para la detección de
reactividad cruzada, las inmunoplacas de 96 pocillos se
recubrieron con los péptidos MERS-CoV Spike-492 o
Spike-492 (L506F) y se incubaron con el anticuerpo
monoclonal 492-1G10E4E2 o 506-2G10G5 durante 2 h antes
de la incubación con el anticuerpo secundario. anticuerpo. La
absorbancia se evaluó con el lector de microplacas Spectra
Max 250 (Molecular Devices Co.
Western blotting e inmunoprecipitación Los lisados de células
Vero infectadas con MERS-CoV se procesaron en SDS-PAGE y luego se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa
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Ab monoclonal a proteína S de MERS-CoV
parque byoung kwon,et al.
como se describió anteriormente (26, 27), y se proporciona información
detallada en el Material complementario.
Digestión con péptido-N-glucosidasa F
Se lisaron células Vero infectadas y no infectadas con MERS-CoV con
tampón de lisis (0,5 % de SDS y 1 % de --mercaptoetanol) y se
hirvieron a 100oC durante 10 min. A continuación, los lisados se
sometieron a tratamiento con péptido-N-glucosidasa F (PNGasa F)
(Elpis Biotech Inc.) a 37ºC.oC durante 2 h y se hierve a 100oC durante
10 min. Después de la digestión, las muestras se detectaron con el
anticuerpo monoclonal 492-1G10E4E2 o 506-2G10G5 mediante
transferencia Western. Para la inmunoprecipitación, las muestras
digeridas con PNGasa F se incubaron con los anticuerpos indicados
durante la noche a 4oC seguido de análisis de transferencia Western
con el anticuerpo monoclonal 492-1G10E4E2 o 506-2G10G5.
Inmunofluorescencia indirecta y microscopía confocal Para el
análisis del ensayo de inmunofluorescencia indirecta, se sembró una
mezcla de células Vero infectadas y no infectadas con MERS-CoV en
una proporción de 3:1 en portaobjetos. A continuación, las células se
fijaron con acetona y se incubaron con el anticuerpo monoclonal de
ratón normal IgG, 492-1G10E4E2 o 506-2G10G5 a 37ºC.oC durante 2 h.
Las muestras se incubaron adicionalmente con anticuerpo IgG anti-
ratón de cabra conjugado con Alexa Flour 488 (Thermo Fisher
Scientific Co.). Finalmente, las muestras fueron montadas y analizadas
usando un microscopio de fluorescencia (1X70, Olympus Co.) (28, 29).
Para visualizar la microcopia confocal, células Vero (5 × 104) se
sembraron en cubreobjetos en placas de 12 pocillos y se infectaron
con MERS-CoV (0,1 MOI). Después de dos días, las células infectadas
se fijaron con paraformaldehído al 4 % y posteriormente se
bloquearon con BSA al 1 % y Triton X-100 al 0,1 % en PBS. Los
portaobjetos se incubaron en presencia del anticuerpo monoclonal
492-1G10E4E2 o 506-2G10G5 durante 2 h, se lavaron y luego se
incubaron con el anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con
Alexa Flour 488 durante 1 h. Se utilizó Hoechst 33258 (Thermo Fisher
Scientific) para teñir los núcleos. Los portaobjetos fueron examinados
por Carl Zeiss LSM710 (Carl Zeiss Co. Ltd.).
Ensayo de reducción de placa
6 × 105Las células Vero/pocillo se sembraron en placas de seis pocillos
(Thermo Fisher Scientific Co.) y se cultivaron durante 12 h. Antes de la
infección, el MERS-CoVirus se preincubó con anticuerpos
monoclonales IgG, 492-1G10E4E2 o 506-2G10G5 de ratón normal
diluidos en serie dos veces durante 30 minutos a 37ºC.oC. La mezcla
virus-anticuerpo se añadió a las células Vero con 500 l de PBS.
Después de 1 h de incubación, se eliminó el sobrenadante y se
añadieron 3 ml de medio DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific Co.)
que contenía agar oxoid al 0,6 %. Las placas formadas en cada pocillo
se tiñeron con cristal violeta (20) 4 días después de la infección. Se
contaron las placas y se calculó el porcentaje.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado por becas del National Research
BMBInformes401
 Ab monoclonal a proteína S de MERS-CoV
Byoung Kwon Park,et al.
Foundation (2016M3A9B6916708, 2009-0093812) financiado por
el Ministerio de Ciencia y TIC de la República de Corea. Byoung
Kwon Park recibió el apoyo del Programa de becas posdoctorales
de la Universidad de Hallym de 2017 (HLM-PF-2017-0001).
CONFLICTOS DE INTERÉS
Los autores no tienen intereses en conflicto.
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