BIOLOGIA MOLECULAR

CAPÍTULO 11: Manejo de muestras para análisis molecular 

Blanca Estela Bastidas RamÍrez; Elizabeth Gordillo Bastidas; Daniela Gordillo Bastidas; Jesús Javier García Bañuelos

Introducción

El material de interés en el análisis molecular es el ácido desoxirribonucleico (DNA,  deoxyribonucleic acid) y el ácido
ribonucleico (RNA). El DNA contiene los genes de un individuo y el RNA participa en la expresión de los genes. El
conocimiento de las características, propiedades e interrelaciones entre estas dos biomoléculas ha permitido la
implementación de técnicas en la investigación y en el diagnóstico molecular. Estas metodologías son útiles en la
identificación de individuos, detección de agentes infecciosos, determinación de carga viral, corroboración de
diagnósticos, monitoreo de tratamientos, análisis de mutaciones y estudio de polimorfismos, entre otras. Asimismo, el
análisis molecular permite profundizar en el conocimiento del proceso salud-enfermedad, con la finalidad de proponer
nuevas alternativas preventivas y terapéuticas que promuevan una mejor calidad de vida para los seres humanos.

Este capítulo pretende brindar al lector recomendaciones básicas para el manejo de muestras biológicas que se
someterán al estudio de ácidos nucleicos. Se explica cómo seleccionar, obtener y preservar la muestra; también se
mencionan algunos ejemplos específicos y las áreas de aplicación del análisis molecular.

Manejo de muestras

El análisis molecular debe llevarse a cabo por personal altamente capacitado en el área de la biología molecular. Sin
embargo, los resultados que se obtengan no sólo dependerán de la calidad del análisis molecular per se, sino que en
gran medida también dependerán de la calidad de la muestra analizada. De esta manera, la metodología utilizada, sea
simple o sofisticada, económica o costosa, no brindará los resultados esperados si no se tiene como punto de partida
una muestra manejada de forma correcta. Por lo general, para que una muestra llegue desde el sitio de la toma hasta el
laboratorio, se requiere de la participación de un equipo de trabajo, por lo qu

e es importante que cada individuo implicado en el proceso conozca las recomendaciones elementales para el manejo
adecuado de muestras. Éste implica tres pasos fundamentales: selección, toma y preservación de la muestra.

Selección de la muestra: ¿qué muestra debo elegir?

Se debe seleccionar la muestra que contenga el ácido nucleico de interés. De aquí surgen dos posibilidades: estudiar
ácidos nucleicos del individuo o ácidos nucleicos exógenos. En la figura 11-1 se señalan algunos casos en los que puede
aplicarse el análisis molecular y el tipo de muestra recomendada.

FIGURA 11-1

La selección del ácido nucleico y de la muestra adecuada dependerá de la información que se desee obtener. VHB, virus
de la hepatitis B; VHC, virus de la hepatitis C; VIH, virus de la inmunodeficiencia humana; VPH, virus del papiloma
humano: LCR, líquido cefalorraquídeo. Los asteriscos muestran la asociación entre microorganismos y la muestra para
realizar el análisis. En el caso de M. tuberculosis, la muestra puede ser expectoración, orina o LCR, si la infección se
encuentra en pulmón, vías urinarias o sistema nervioso central, de manera respectiva
CAPÍTULO 12: Extracción de ácidos nucleicos
Introducción

Los ácidos nucleicos, el DNA y RNA reciben su nombre del hecho de ser moléculas con características ácidas (como la
carga negativa en soluciones acuosas) y haberse localizado inicialmente en el núcleo celular, aunque ahora se sabe que
también se encuentran en la mitocondria. Para su estudio, los ácidos nucleicos deben aislarse del resto de los
componentes celulares, como lípidos y proteínas, que son más abundantes que los ácidos nucleicos. Asimismo,
dependiendo del objeto de estudio debe aislarse el DNA o el RNA; así, para estudios de niveles de expresión génica se
extraerá el RNA, mientras que para la búsqueda de modificaciones o alteraciones en la secuencia, el DNA.

Consideraciones para la extracción de ácidos nucleicos

La molécula de DNA, con independencia de la estabilidad química dada por su estructura helicoidal, es físicamente frágil,
por ser larga, tortuosa y con un peso molecular alto, lo que provoca que se someta a fuerzas hidrodinámicas que la
disgregan. En solución, el DNA, de doble cadena (dsDNA) se comporta como una estructura rígida enrollada de forma
aleatoria, regida por las repulsiones electrostáticas de los pares de bases y el esqueleto de fosfatos cargados
negativamente. Al pipetear, agitar o revolver el DNA se genera un flujo hidrodinámico que puede separar las dos
cadenas de DNA; entre más larga la molécula, más débil la fuerza requerida para esta ruptura. Por ello, obtener
fragmentos de DNA genómico es fácil, pero conforme se requieran tamaños moleculares elevados (> 150 kb) la técnica
se dificulta. Los fragmentos de DNA, por lo general obtenidos con las técnicas de extracción convencionales, oscilan
entre 100 y 150 kb y son adecuados para utilizarse en técnicas como Southern blot, reacción en cadena de la polimerasa
(PCR, polymerase chain reaction), electroforesis y construcción de genotecas.

Elección del método de extracción

La extracción de ácidos nucleicos es el primer paso para la mayoría de los estudios en biología molecular y para las
técnicas del DNA recombinante. En la actualidad, se dispone de múltiples metodologías de extracción, lo que permite
que los biólogos moleculares puedan seleccionar la técnica que más se ajuste a sus necesidades. La elección del método
de extracción suele realizarse en función de los siguientes criterios:

 Tipo de ácido nucleico que se va a extraer: DNA de cadena sencilla (ssDNA), dsRNA, RNA total, RNA mensajero
(mARN), RNA de interferencia (iRNA) o RNA ribosomal (rRNA).

 Organismo origen del ácido nucleico: mamíferos, plantas, procariotas o virus.

 Fuente del ácido nucleico: cultivo celular, tejido (por lo general biopsia), sangre (leucocitos), expectoración,
suero, orina, líquido cefalorraquídeo, etcétera.

 Técnica en que se utilizará el ácido nucleico extraído: según el uso que vaya a tener el ácido nucleico, los
requerimientos de rendimiento, pureza y tiempo de extracción variarán de acuerdo con la metodología que se
vaya a aplicar, como retrotranscripción, PCR, clonación, Northern blot, Southern blot, etcétera.

CAPÍTULO 13: Electroforesis
Introducción

En biología molecular, una gran cantidad de técnicas que se realizan comúnmente requiere el uso de la electroforesis,
lo que supone una parte importante del procedimiento sistemático del análisis (separación, purificación, preparación)
de los ácidos nucleicos y las proteínas. La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica cuya magnitud
depende del pH del medio en el que se encuentran; como consecuencia, pueden desplazarse cuando se someten a un
campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula. A diferencia de las proteínas, que pueden tener una
carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos sólo poseen carga negativa, debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo
tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. En el caso de las
proteínas, que suelen ser de carga neutra, se realiza pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de sodio
(SDS), que les confiere carga negativa; con ello se homogeneizan las proteínas de la muestra y todas migrarán hacia el
polo positivo; sólo se separarán por tamaño.

El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de
matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento generado por el campo eléctrico.

Elementos necesarios para una electroforesis

Para realizar una electroforesis se requiere de una serie de elementos descritos a continuación y enlistados en
la figura 13-1.
FIGURA 13-1

Elementos necesarios para una electroforesis. En la imagen se aprecian los elementos que se requieren para el
corrimiento electroforético y visualización del gel.

CAPÍTULO 14: Enzimas de restricción

Introducción

El descubrimiento, caracterización y aislamiento de los diferentes tipos de enzimas ha facilitado el estudio del genoma,
así como de la regulación de su expresión y de la correlación que existe en el desarrollo de diversas patologías. Hoy en
día es común la aplicación de técnicas de biología molecular en diversas disciplinas del área de ciencias de la salud que
tienen gran impacto, especialmente en la investigación clínica. Entre las enzimas que modifican a los ácidos nucleicos se
encuentran las nucleasas, enzimas capaces de cortar los enlaces fosfodiéster que unen a los nucleótidos en una cadena
de ácidos nucleicos. Las nucleasas se denominan endonucleasas si cortan el enlace fosfodiéster en nucleótidos
localizados dentro de la cadena del ácido nucleico; si cortan los enlaces de los nucleótidos que están en los extremos se
llaman exonucleasas.

Origen de las enzimas

En la década de 1950 algunos investigadores observaron un fenómeno de restricción y modificación del ácido
desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid) en ciertas cepas de bacterias que presentaban una replicación
restringida de bacteriófagos (virus que infectan bacterias) al ser infectadas por éstos. Los fagos que lograban replicar su
DNA en una cepa podían infectar con éxito otros cultivos de la misma cepa, pero no infectar otras cepas de la misma
especie.

En 1960, Stewart Linny y Werner Arber obtuvieron evidencias de que la degradación y la metilación del DNA detectada
en bacterias se debían a un fenómeno de defensa del hospedador en contra de los bacteriófagos. Descubrieron estas
enzimas al estudiar cepas de E. coli y observar que ciertas enzimas metilaban al DNA en una secuencia específica y otras
lo cortaban en la misma posición. Las enzimas con capacidad de corte se llaman enzimas de restricción y deben su
nombre a que “restringen” la permanencia de un DNA “exógeno” (por lo general proveniente de los bacteriófagos) en la
célula bacteriana que la expresa.
Las enzimas de restricción particularmente son endonucleasas que cortan los enlaces fosfodiéster del DNA en secuencias
específicas denominadas secuencia DIANA. Esta secuencia tiene una longitud de 4-8 pares de bases presentes en el
interior de una molécula de DNA; por lo común es palindrómica. Una secuencia palindrómica es aquella que se lee de la
misma manera en un sentido y en el otro, por ejemplo: 5′AATTCGAATT3′ 3′TTAAGCTTAA5′

Todas las especies de bacterias sintetizan uno o más tipos de enzimas de restricción; cada una reconoce una secuencia
particular, lo que asegura su protección.

En la actualidad, se ha descrito la composición bioquímica y genética de más de 5 000 sistemas de restricción/metilación

(R/M) en REBASE (http://rebase.neb.com), la base de datos más importante sobre enzimas de restricción. En ella se
encuentra la información de las enzimas en relación a sus secuencias de reconocimiento, sitios de corte, organismos de
los cuales se aislaron, secuenciación, estructura y casas ...

CAPÍTULO 15: Vectores de clonación y expresión

Introducción

Hasta la década de 1970, el ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid) era una molécula cuyo análisis era
sumamente problemático, ya que es demasiado larga y está formada sólo por cuatro diferentes monómeros. En esa
época la secuencia de nucleótidos del DNA sólo había podido estudiarse de forma indirecta a través de la secuencia de
aminoácidos en las proteínas o por su expresión en el ácido ribonucleico (RNA, ribonucleic acid). Por ello, el
descubrimiento de las enzimas de restricción facilitó el estudio del DNA, ya que gracias a ellas fue posible seccionar
moléculas grandes de DNA y separarlas en fragmentos. Cada uno de esos fragmentos se analizaba por separado y fue
posible multiplicarlos a través de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction;
véase el capítulo 17), e incluso determinar la secuencia de sus nucleótidos por secuenciación. Los procesos técnicos que
forman parte de la metodología del DNA recombinante son, en gran parte, adaptaciones de procesos naturales de la
genética microbiana o eucariota, mezclados con técnicas novedosas e ingeniosas. Gracias a la especificidad del
reconocimiento de las secuencias que pueden ser cortadas por las enzimas de restricción ha sido posible la
identificación, el aislamiento y la clonación de fragmentos de DNA provenientes de diferentes organismos, para producir
moléculas de DNA recombinante. El término clonación indica el acto de producir muchas copias idénticas de una
molécula de DNA, y antes del advenimiento de la técnica de PCR era la manera usual de multiplicar una secuencia
específica. En la actualidad, la clonación se emplea para la producción de moléculas recombinantes o para determinar
sus funciones en el organismo. La célula en la cual se introduce el ácido nucleico se denomina célula transformada y esta
variación en su genoma puede ser hereditaria.

Clonación

La clonación de DNA, o clonación molecular, es la introducción de un fragmento de DNA denominado  inserto dentro de

una molécula de DNA denominada vector, que puede replicarse de manera autónoma e independiente del genoma de la
célula hospedera. El resultado es la obtención de millones de copias de una  molécula recombinante o clona
molecular compuesta por DNA proveniente del inserto y del vector.

El inserto puede ser DNA obtenido de cualquier organismo y puede ser DNA genómico (gDNA), DNA complementario
(cDNA) producto de la retrotranscripción del RNA, un producto de PCR o un RNA obtenido por transcripción in vitro.

Vectores

Un vector se define como una molécula de DNA de doble cadena (dsDNA), con capacidad de albergar un fragmento de
DNA exógeno (de otro origen).

De acuerdo con su uso, los vectores se clasifican en vectores de clonación y vectores de expresión.

Vectores de clonación

Los vectores de clonación tienen como finalidad el almacenamiento de secuencias y la ..

CAPÍTULO 16: Técnicas de hibridación

Introducción
Al revelar los numerosos métodos mediante los cuales las células procesan, añaden, eliminan y transfieren
información genética, los biólogos moleculares abrieron el camino para el desarrollo de sus propias
manipulaciones genéticas. En los últimos años se han desarrollado técnicas que han permitido abordar el
análisis y la manipulación del ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid) de una forma antes
inimaginada. La tecnología del DNA recombinante ha hecho posible investigar más a fondo la estructura y la
función de los genes, en especial de los genes eucarióticos, inaccesibles por otros métodos. Cuando los
investigadores se enfrentaron por primera vez con el gran tamaño y la complejidad del DNA, incluso el del
virus más simple, la posibilidad de descifrar la información genética codificada parecía estar más allá de
toda esperanza. Se hizo evidente que para estudiar un gen individual, se le debía aislar del resto del
genoma, ya que cada gen representa una pequeña sección dentro de un cromosoma; en ese contexto, no
puede individualizarse. Para el aislamiento de un gen o de fragmentos más pequeños, el DNA debe
fragmentarse. Si bien la rotura del DNA puede realizarse de forma mecánica, por este medio la
fragmentación se produce al azar. La obtención de fragmentos específicos de DNA fue posible mediante un
método desarrollado a partir de herramientas propias de ciertos organismos procariotas, como lo son las
enzimas de restricción (véase capítulo 14). Para avanzar hacia un estudio más detallado del DNA se necesitó
una metodología que permitiera obtener grandes cantidades de fragmentos específicos de DNA. Estos
fragmentos podían ser DNA genómico, DNA complementario (cDNA) o DNA obtenidos a partir de
oligonucleótidos sintéticos. A menudo, antes de que un determinado fragmento de DNA o de RNA
mensajero (mRNA) pueda manipularse de cualquier modo, primero debe localizarse. Los cromosomas,
incluso los de las células eucarióticas más simples, contienen una enorme cantidad de DNA, por lo que
localizar un segmento específico es como tratar de encontrar la proverbial aguja en el pajar. Para localizar
fragmentos específicos se utilizan las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. Entre las técnicas de
hibridación más comunes se encuentran Southern blot, Northern blot, Slot blot, Dot blot, hibridación in
situ, hibridación en solución y citometría de flujo. Antes de abordar cada metodología es importante
mencionar algunos aspectos básicos que facilitarán el entendimiento técnico de estas herramientas de la
biología molecular, como son la electroforesis de ácidos nucleicos y la definición de sondas.

Electroforesis de ácidos nucleicos

La electroforesis es una técnica analítica de separación de macromoléculas. La separación tiene lugar
debido a la diferente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas cuando se someten a la
influencia de un campo eléctrico como consecuencia de su relación carga/masa. Los ácidos nucleicos son
moléculas cargadas de manera negativa, debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. La
naturaleza del enlace fosfodiéster de las cadenas polinucleotídicas condiciona la carga de un ácido
nucleico, ...

CAPÍTULO 17: Reacción en cadena de la polimerasa

Introducción

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polimerase chain reaction) se considera una de las técnicas más sensibles y
específicas de las pruebas moleculares. En 1986, el doctor Kary Mullis desarrolló esta técnica en los laboratorios de
CETUR Corporation, en Estados Unidos, lo que le hizo valedor del premio Nobel en 1993. La idea se fundamentó en la
necesidad de obtener un gran número de copias de fragmentos específicos de ácido desoxirribonucleico
(DNA, deoxyribonucleic acid) de manera rápida y económica, los cuales no podían obtenerse por otros métodos hasta
ese momento. Esta técnica se basa en una replicación exponencial in vitro de una molécula de DNA genómico (gDNA) o
DNA complementario (cDNA), mediante ciclos repetidos, que constan de tres temperaturas. En cada uno de los ciclos las
moléculas se duplican hasta que los reactivos se agotan.

La longitud del producto amplificado la delimitan los iniciadores, también llamados primers u oligonucleótidos, de cuyo
diseño adecuado depende el éxito de la PCR. Los iniciadores deben ser específicos, no formar estructuras secundarias ni
hibridaciones inespecíficas entre ellos u otra parte de la cadena.

Características de la amplificación in vitro y requerimientos necesarios para la PCR

La amplificación in vitro de la PCR se apega a las mismas reglas de la replicación realizada en la célula; esta técnica se
basa en una secuencia que le sirve de molde y, por complementariedad, sintetiza la cadena antiparalela. También, la
síntesis de la cadena sigue la dirección 5′-3′, ya que requiere de un nucleótido con el extremo 3′ libre que proporcione el
grupo OH para la adición del siguiente nucleótido, con lo que se forma el enlace fosfodiéster.

Para que se lleve a cabo la PCR se requiere una cadena de gDNA o cDNA que sirva de molde, una enzima DNA
polimerasa, cofactores necesarios para la actividad correcta de la DNA polimerasa, desoxinucleótidos (dNTP) para la
síntesis del producto de PCR y oligonucleótidos o primers. Estos componentes se colocan en un tubo de ensayo en un
equipo llamado termociclador. El orden de adición suele iniciar con el DNA molde, los otros reactivos y terminar con la
DNA polimerasa (sobre todo si se emplea una DNA polimerasa termolábil).
La función de cada uno de estos elementos en la reacción se describe a continuación y se enlistan en la figura 17-1.

FIGURA 17-1

Componentes de la reacción de PCR. Para que se lleve a cabo la reacción en cadena de la polimerasa se requiere una
cadena de gDNA o cDNA que sirva de molde, una enzima DNA polimerasa, Mn +2 o Mg+2 necesarios como cofactores para
la enzima, dNTP o desoxinucleótidos y oligonucleótidos para el inicio de la síntesis. Estos reactivos se mezclan y se
someten en el termociclador a los ciclos de amplificación.