UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS EXACTAS

E INGENIERIAS

“USO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LA

DETERMINACIÓN DE INTOXICACIONES POR
BENZODIACEPINAS Y MONÓXIDO DE CARBONO”

CARRILLO LOZA JUAN PABLO

PEREZ GONZALEZ ALAN FERNANDO
PEÑA GONZALEZ HECTOR DAVID
¿Qué es la toxicología?
2
 3
Toxicología

La toxicología es el estudio de la

manera en que los venenos
naturales o los fabricados por el
hombre producen efectos nocivos
en los organismos vivos.
 4

Preguntas generales sobre

toxicología
¿Qué son efectos nocivos o perjudiciales? 5

Los efectos nocivos o

perjudiciales son aquellos que
atentan contra la supervivencia o
la función normal del individuo.
 6
¿Qué es la toxicidad?

 El término “toxicidad” se emplea para describir la naturaleza de los

efectos perjudiciales producidos y las condiciones necesarias para su
producción.

 La toxicidad ocurre toda vez que una sustancia entra en contacto con
una superficie corporal como la piel, los ojos o la mucosa del sistema
digestivo o respiratorio.
 7
¿Qué significa tóxico?

 Estetérmino se relaciona con los

efectos venenosos o mortales en el
cuerpo
 8

¿Qué es una toxina?

 Eltérmino “toxina” hace referencia a

sustancias tóxicas producidas
naturalmente.
¿Qué es un síntoma tóxico? 9

¿Qué es un efecto tóxico?

 Un síntoma tóxico es toda sensación o signo que indica la

presencia de un veneno en el sistema.

 El término efectos tóxicos hace referencia a los efectos en la

salud debido a la exposición a una sustancia tóxica.
¿Qué es toxicidad selectiva? 10

 Estosignifica que una sustancia química será

nociva para un tipo de materia viva pero no
para otra forma de vida, si bien las dos
coexisten cercanamente.
 11
Vías de
exposición AIRE

AGUA

SUELO
ALIMENTOS
¿Qué es una dosis? 12
¿Qué es dosis-efecto?

 La dosis es la cantidad real de una sustancia química que

ingresa al cuerpo.

 Dosis-efecto sugiere que una dosis, o un período de

exposición (a una sustancia química, fármaco o sustancia
tóxica), producirá un impacto (efecto) en el organismo
expuesto.
 13

¿Qué es una dosis umbral?

 Ladosis umbral sugiere que debe
existir una dosis o nivel de exposición
por debajo del cual no se observan
efectos nocivos o perjudiciales en una
población.
¿Qué es ‘susceptibilidad individual’? 14
¿Qué es una ‘subpoblación sensible’?

 La susceptibilidad individual describe las diferencias entre

las personas. Algunas personas son más vulnerables que
otras a ciertas afecciones de la salud.

 La subpoblación sensible es más vulnerable que la persona

común sana a enfermedades por exposición.
Subdisciplinas de la toxicología 15

 Toxicología ambiental
 Toxicología ocupacional (industrial)
 Toxicología reglamentaria
 Toxicología de los alimentos
 Toxicología clínica,
 Toxicología descriptiva
 Toxicología forense
 Toxicología analítica
 Toxicología mecanicista
 PRINCIPALES ESPECIALIDADES
TOXICOLÓGICAS
Toxicología

Analítica Farmacológica Social

Forense Clínica Ambiental

Laboral Farmacéutica Bromatológica

 FACTORES IMPLICADOS EN LA
INTOXICACIÓN
 La intoxicación es la acción de una sustancia tóxica en el organismo. El agente
xenobiótico debe pasar por un proceso toxicocinético que consta de:
1. Absorción
2. Distribución Absorción
3. Metabolismo
Excreci Distribuci
4. Excreción ón ón
Metabolis
mo

 Proceso toxicodinámico: el xenobiótico llega al receptor biologico especifico y

manifestar el daño.
CARÁCTER TÓXICO DEL AGENTE
XENOBIÓTICO
 Un agente que produce intoxicación puede ser de naturaleza química, física o
biológica.

 En la toxicología de alimentos se refiere de forma exclusiva a sustancias químicas.

 Un parámetro toxicológico que se obtiene a corto plazo es: la dosis media (DL ), se
50

expresa como la dosis administrada en mg de xenobiótico/kgpc)

 En la actualidad se maneja el potencial de toxicidad (PT), el cual depende de

factores como: especie animal y vía de administración.
 Vía o Ruta de Absorción
 Es bien conocido que un mismo agente tóxico puede producir efectos muy diferentes, dependiendo de la
ruta por la cual el sistema biológico lo absorba.

 Factores que permiten a los agentes xenobióticos atravesar membranas:

1. Concentración
2. Polaridad
3. Coeficiente de partición agua/lípido.
4. pH del medio.
 Vía o Ruta de Absorción
 Vías de administración y velocidad de absorción.

Vía Poder de penetración

Intravenosa Muy alto
Inhalatoria Muy alto
Intraperitoneal Alto
Subcutánea Alto
Intramuscular Alto
Gastrointestinal Bajo
Cutáneo o Tópica Muy Bajo
Tiempo de interacción de la Sustancia
Tóxica
 El efecto de un agente tóxico sobre un sistema biológico se traduce en una
alteración del equilibrio fisiológico (homeóstasis), por lo que una
intoxicación es una enfermedad y como tal debe considerarse bajo un
criterio patocrónico, o sea se debe observar la evolución en función del
tiempo y así podemos clasificarla como intoxicación aguda, crónica o sub
crónica.
 Tiempo de interacción de la Sustancia Tóxica

 La intoxicación aguda se define como la exposición hacia un agente xenobiótico que produce una
manifestación casi inmediata (en ocasiones en minutos) con una sola administración del tóxico, que puede llevar
al intoxicado a la muerte, o a una recuperación total o parcial, de la cual pueden quedar o no secuelas o lesiones
persistentes.

 Intoxicación subaguda se presenta con síntomas no mortales (en ocasiones) por la exposición repetitiva a
sustancias tóxicas.

 La intoxicación crónica se presenta como consecuencia a la repetida exposición hacia el agente tóxico.
 Excreción del agente tóxico.
 El grado de toxicidad de un xenobiótico va a depender del tiempo que este permanezca dentro del
organismo de un ser vivo.

 La excresion de los toxicos se realiza por medio de:

1. La orina
2. La Bilis
3. Las heces
4. Aire expirado (compuestos volátiles).
5. Leche, Sudor, Saliva.
Clasificación de los Tóxicos
Inhibidores de colinesterasa hepatotóxicos
Productores de MetaHb nefrotóxicos
hematotóxicos
sólidos
líquidos físicos
Tóxicos químicos
gaseosos
pulverulentos

mineral
hidrocarburos halogenados vegetal
aminas aromáticas animal
sintéticos
BENZODIACEPINAS
Epidemiología

 Infantiles

 Intentos de suicidio ( Adolescentes )

 Farmacodependencia en adultos ( uso y abuso)

Características generales

 efectos graves por sobredosis raros

 Liposolubles
 buena absorción oral (excepto clorazepato)
 Rápida aparición plasmática
 Unión a proteínas plasmáticas 80-99%
 biotransformación hepática
 eliminación 70-90 % por orina
 G lu c u r o n id a c ió n

Tem azepam O xazep am L o ra z e p a m D e r iv a d o 3 h id r o x i H id r o x it r ia z o la m H id r o x ia lp r a z o la m

N o rd a z e p a m N - d e s a lq u ilflu r a z e p a m T R IA Z O L A M ALPRAZO LAM

d em oxazep am
N - h id r x ie t ilflu r a z e p a m

d e s m e t ilc lo r d ia z e p o x id o
FLURAZEPAM

C L O R D IA Z E P O X ID O

D IA Z E P A M C LO R AZEPATO
Mecanismo de acción

 Potencian la neurotransmisión gabaérgica, intensificando la inhibición sináptica

 hay receptores para BZD :

Médula espinal, tallo encefálico, sist. Límbico, corteza cerebral y cerebelosa
Vida Media

 Acción Larga: 50 a 120 hs por metabolitos

 intermedia: 30 hs.

 Corta: 10 hs.

 Ultracorta: 5 hs.
Clasificación

Acción Acción Acción Acción

Larga Intermedia Corta ultracorta

Bromacepam Clonazepam Lorazepam Triazepam

Cloracepato Flunitrazepam Oxacepam Midazolam
Diazepam Nitrazepam Temacepam
Flurazepam Alprazolam
Clordiazepoxid
Clobazam
Clínica( Efectos principales)

 Ansiolíticos
 Sedantes (-actividad, - excitación, calma )
 Hipnóticos ( facilita el sueño ( no natural )
( sedación , hipnosis, NO anestesia general )
 elevación del umbral convulsivo
 relajante muscular central
Cuadro clínico (1)

 Vértigo
 ATAXIA
 nistagmo
 disartria
 somnolencia de leve a coma ( dependiente de la dosis y el tiempo transcurrido )
Cuadro Clínico (2)

 Desorientación temporo-espacial
 destreza motora diminuída
 hipotonía muscular
 Excitación paradojal ( en niños suele ser la primera manifestación previa o
concomitantemente a la ataxia )
Cuadro Clínico (3)

 Sequedad bucal y sabor amargo

 Efectos cardiovasculares leves ( hipotensión arterial, taquicardia, y disminución
del gasto cardíaco)
 Depresión respiratoria: rara si no se ingirió etanol concomitantemente o enf.
Pulmonar

 Estos dos últimos son más comunes vía EV

Otros efectos

 Farmacodependencia: abuso y dependencia.Los síndromes de abstinencia pueden

llegar al 45% (GyG)desde insomnio de rebote, ansiedad, hasta convulsiones

 Teratogenia ( paladar hendido)

 Síndrome de abstinencia del recién nacido
Diagnostico

 Cuadro clínico

 Laboratorio ( dosaje de BZD en orina y sangre )

Diagnóstico diferencial

 Etiología infecciosa en SNC ( Meningitis. Encefalitis)

 Intoxicación etílica aguda

 tumor cerebral
Tratamiento

 Tratamiento de rescate ( VP,CA, PS)

 Hidratación por vía ORAL

 Antídoto Flumazenil
FLUMAZENIL
Lanexat (R)
 Es una Imidazobenzodiazepina
 Antagonista competitivo de las BZD
 inhibe los efectos sobre el SNC de las BZD
 Vía EV, vida media menor a 1 hora
 Se excreta por orina
 Ampollas de 0.5 ml/ 0.5 mg
 Precaución en co-ingesta de epileptógenos (Teofilina ,Litio, Isoniacida
, Propoxifeno, IMAO, Cocaína
Flumazenil
(Dosis)
 0,2 mg a pasar en 30 segundos
 Si no se obtiene nivel de conciencia deseado nueva dosis de 0,3 mg en 30
segundos.
 Si es necesario pueden darse dosis posteriores de 0,5 mg durante 30 segundos a
intervalos de 1 minuto hasta dosis máxima acumulativa de 3 mg ( en casos raros
hasta 5 mg )
Flumazenil
efectos adversos
 Convulsiones ( + frecuente de los serios )

 Muerte ( en pacientes con dependencia a BZD o ingesta de grandes

cantidades de otras drogas como ATC )

 Naúseas y vómitos (4%)

Flumazenil
efectos adversos
 Vértigo y ataxia (10%)
 Dolor en sitio inyección,sudoración profusa cefalea, visión borrosa,agitación (3-9
%)
 Vasodilat.cutánea,parestesias,labilidad emocional ( 1-3 %)
INTOXICACION POR MONOXIDO
DE CARBONO
 Características del gas
• No olor característico
• Incoloro
• Poco irritante
• Densidad menor que el aire

Se produce en la combustión incompleta de materiales

orgánicos (derivados del petróleo, madera, gas doméstico ...)
Niveles normales de COHb

No fumadores:

2,3  1,3 % de COHb (1 - 3 %)

Fumadores:

4,6  4,4 % de COHb (4 - 6 %)

> 10 % = intoxicación por CO

 Fisiopatología

 Afinidad del CO por Hb (250 veces más que el O2): COHb

 Desviación izquierda de curva de la Hb

 entrega de O2 a tejidos

 Alcalosis respiratoria inicial

 Unión a mioglobina: rebote

 Citocromo Oxidasa
 Alteración de Citocromo Oxidasa

Disfunción mitocondrial y estrés oxidativo

Célula endotelial

Oxido nítrico

Peroxinitrito

AA excitatorios
 Fenómeno de REPERFUSION
 Generación de radicales libres
 Peroxidación lipídica después y no durante CO
Allopurinol pre exposición CO
 Mediación por Leucocitos secuestrados
Monoclonal anti-CD-18F(ab):
xantina oxidasa y peroxidación lipídica
 Vida media COHb: 320 minutos

 Hb fetal: mayor afinidad por CO

 Isquemia:

• Depresión miocárdica

• Vasodilatación periférica

• Arritmias ventriculares
Los tejidos más sensibles:
Principalmente cerebro, corazón y pulmón

“Todo paciente quien ha estado en contacto con CO y que ha

sufrido un síncope, lipotimia o ha sido encontrado
inconsciente, aunque esté consciente en el momento de la
exploración, tiene que considerarse como subsidiario de una
grave intoxicación por CO”

Factores: Niveles de COHb + grado de actividad +

necesidades tisulares de O2 + niveles séricos de Hb
 Clínica

LEVE MODERADA GRAVE MUY GRAVE

(COHb: 20-30%) (COHb: 40-60%) (COHb: >60%)

(COHb: 30-40%)

Mareo Ataxia Coma Edema

Visión borrosa Isq. miocard cerebral
Cefalea
Mionecrosis PIC
Nauseas Desorientación
Convulsiones Muerte
Vómito Fc y Fr
 Diagnóstico

• Historia de exposición potencial a CO

• Color rojo cereza de las mucosas en casos muy

graves

• Acidosis láctica

• Niveles de COHb
(no correlacionable: tº exposición + [ambiental] + oxígeno)
Gasometría

• Normal PaO2 (mide O2 disuelto en plasma)

• Pulsoximetría no sirve (no discrimina entre

la molécula de oxiHb y la de COHb)

• Técnicas de electroforesis: medicina legal

 Electrocardiograma

• Alteraciones segmento ST (inversión T)

• Trastornos de la conducción

• Disfunción sinusal-nodal (arritmia)

Tratamiento

 ABC
 O2 a alta concentración*
 VM cuando sea necesario
 Corregir Acidosis metabólica si pH < 7,20
 Monitorizar y tratar complicaciones (convulsiones...)
 O2 hiperbárico si mala evolución
Tratamiento

O2 a alta concentración

La vida media de la COHb es inversamente

proporcional a la FiO2 y al tiempo de
administración:
• 2 horas con FiO2 0,35
• 45 min con FiO2 de 1
Síndrome Neurológico tardío
 Degenerativo desmielinizante
 1-6 sem después de asintomático
 Manifestaciones neurosiquiátricas
 Gravedad según tiempo de exposición
Seguimiento a 3 años:
o 33% deterioro en la personalidad
o 43% compromiso de memoria
 Pronóstico
 30 % mueren
 11 % que sobreviven: déficit neurosiquiátrico
 33 % tienen déficit en memoria o personalidad
Marcadores pronósticos:

Inconsciencia
Inconscienciaalalingreso
ingreso
Edad Clínicacardiaca
cardiaca
Edadavanzada
avanzada Clínica
Acidosismetabólica
Acidosis metabólica
TAC
TACanormal
anormal
Fundamento de las
técnicas analíticas.
Cromatografía de gases.
Introducción.
 La cromatografía es un proceso de migración diferencial en el cual los
componentes de una mezcla son transportados por una fase móvil (gas o
líquido), y retenidos selectivamente por una fase estacionaria que puede
ser un líquido o un sólido.
 De acuerdo a la naturaleza de las fases involucradas y a los mecanismos
de separación, la cromatografía se divide en:
Cromatografía de gases.

 En la cromatografía de gases, la fase móvil es un gas y la estacionaria es

un sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido (cromatografía gas-
líquido).
 En la primera, el proceso de separación se lleva a cabo por adsorción
entre el gas que transporta al soluto y el soporte, que puede ser alúmina,
sílice gel, carbón, etc. y en la segunda, la partición se lleva a cabo entre
una fase estacionaria líquida que cubre a un sólido inerte, como sílice,
vidrio, etc. y el gas que transporta al soluto.
Cromatografía de gases: equipo.

Los gases más utilizados como transportadores son el helio, el nitrógeno y

algunos otros gases inertes, dependiendo su elección de las características
del detector con que cuente el aparato.

La columna generalmente es de vidrio o metal y está localizada en un

horno que se mantiene a una temperatura seleccionada, la cual determina el
tiempo de retención y en cierta manera la resolución y la eficiencia de la
columna.

La temperatura del detector debe controlarse para prevenir la condensación.

El uso de un determinado detector, depende de cada sustancia.
Cromatografía de gases: equipo.
El detector emite una señal proporcional a la concentración del soluto en
el gas transportador cuando éste sale de la columna, de manera que el
cromatograma para cada producto aparece un pico en forma de campana
a un determinado tiempo.

Los detectores más comúnmente utilizados en cromatografía de gases

son los de conductividad térmica, ionización de flama, ionización de
flama alcalina, captura de electrones y espectrómetro de masas.

Dependiendo de las necesidades y características del análisis se

selecciona el gas.
Cromatografía de gases: columnas.

Empacadas. Capilares.
• Hechas de vidrio. • Hechas de sílica fundida.
• Diámetro de 2-4 mm. • Diámetro de 0.2-0.5 mm.
• Longitud de 0.6-1.8 m. • Longitud de 5-60 m.
• La fase estacionaria con 5% (m/m) es la más • Fase estacionarias de 0.1-1 m de grosor.
común. • Ofrecen buena resolución con mezclas
• Puede usarse para sustancias de PM bajo complejas.
( fase estacionaria con 20%)
 CROMATOGRAFÍA DE GASES:
CROMATOGRAMA.
 El cromatograma típico de elución de dos sustancias donde:
 t1 y t2 son los tiempos de retención de las sustancias 1 y 2.
 h y h/2 son la altura total y la mitad de la altura del pico desde el ápice hasta la línea base.
 Wh/2 es el ancho del pico a la mitad de la altura y W1 y W2 son los anchos de las bases de
los picos 1 y 2, respectivamente.
 to es el tiempo muerto y corresponde al tiempo de retención para una sustancia que no es
retenida por la columna.
 El pico del aire es característico de los cromatogramas obtenidos con detector de
conductividad térmica y puede aparecer antes o coincidir con el pico del disolvente.
Cromatografía de gases: cromatograma.
Cromatografía de gases: procedimiento.

 Debido a que la cromatografía de gases es principalmente un método de

separación, no puede usarse para identificar compuestos sin comparar con una
sustancia de referencia (SRef).
 Para el análisis cualitativo, debe determinarse el tiempo de retención o el
volumen que la sustancia de referencia (velocidad de flujo por tiempo de
retención del pico) del pico de una sustancia conocida, inyectando al sistema
una solución de dicha sustancia.
Cromatografía de gases: procedimiento.

 Los fármacos pueden ser identificados de acuerdo a su retención relativa,

determinada por la siguiente fórmula:
 Retención relativa = (𝑡2 − 𝑡0 ) (𝑡1 −𝑡0) Donde:
 t2 = Tiempo de retención medido desde el punto de inyección del fármaco
en estudio.
 t1 = Tiempo de retención medido para una sustancia de referencia
determinados en la misma columna y a la misma temperatura.
 t0 = Tiempo de retención para un componente inerte que no se retiene en
su paso a través de la columna.
Cromatografía de gases: procedimiento.
 En la mayoría de los casos, los análisis farmacéuticos requieren de
comparaciones cuantitativas de un cromatograma con otro y en estas
condiciones, la cantidad inyectada es una fuente grande de error que puede
minimizarse por la adición de un estándar interno a la sustancia por analizar.
 La relación del área del pico de las sustancias de interés (problemas y estándar
de concentración conocida) al área del pico del estándar interno se compara de
un cromatograma a otro mediante las siguientes expresiones:
Espectrofotometría UV.
Fundamento.

 La espectrofotometría estudia los fenómenos de interacción de la luz con la

materia. En general, cuando una lámpara ilumina cualquier objeto, pueden
suceder algunos fenómenos: La luz puede ser emitida, reflejada, transmitida o
absorbida.
Fundamento.
 Desde que sabemos que la energía no puede ser destruida, la cantidad total de luz debe ser igual
al 100%; por lo tanto, cuando un objeto es iluminado, se puede medir cuánta radiación ha sido
reflejada o transmitida y podemos decir entonces cuánta fue absorbida, cuál es la cantidad que ha
interactuado con el objeto.
 Longitud de onda.
 Las longitudes de onda utilizadas en el laboratorio
comprenden a la luz visible y ultravioleta.

 Para entender mejor cómo se lleva a cabo el fenómeno

de la espectroscopía, es necesario entender lo que es la
radiación electromagnética y la Ley de Lambert-Beer.
Lectura de emisión de luz.
 Un espectrofotómetro es un instrumento utilizado para determinar a qué longitud de onda la muestra absorbe
la luz y la intensidad de la absorción. Aunque varían en el diseño, todos los espectrofotómetros consisten de
una fuente de luz, un selector de longitud de onda, un contenedor transparente en el cual se deposita la
muestra, un detector de luz y el medidor.
Método colorimétrico.
 Introducción.
 La colorimetría es una de las técnicas empleadas con mayor asiduidad en los laboratorios de Bioquímica.
Esta técnica suministra información cualitativa y cuantitativa sobre sustancias en disolución.
 El colorímetro es un instrumento diseñado para dirigir un haz de luz paralela monocromática a través de una
muestra líquida y medir la intensidad del haz luminoso emergente.
Fundamento.
 La fracción de luz incidente absorbida por una solución a una longitud de onda está relacionada
con el paso óptico y con la concentración de la especie absorbente. Estas dos relaciones están
combinadas en la ley de Lambert-Beer:
Log Io / I = ∈ c l
Fundamento.
 Donde Io e I son las intensidades de la luz incidente y emergente respectivamente, l el paso óptico de la
muestra absorbente (cm), c la concentración de la especie absorbente (moles/litro) y ∈ el coeficiente
de absorción molar (M-1 cm -1).
 La expresión log Io / I se denomina absorbancia y se designa por A (siendo adimensional).
Uso de la técnica.
 La aplicación obvia de la ley de Lambert-Beer es el uso del colorímetro para determinar la
concentración de una gran variedad de moléculas que absorben luz (carotenos, clorofila,
hemoglobina, etc.). La técnica se extiende a sustancias no coloreadas como azúcares o
aminoácidos después de alguna reacción capaz de convertir sustancias incoloras en derivados
coloreados.
Determinación de benzidiacepinas:
Espectrofotometria.
Técnica presuntiva: Inmunoensayo.
 El inmunoensayo enzimático de benzodiacepinas DRI de es un ensayo homogéneo destinado a la
determinación cualitativa y semicuantitativa de las benzodiazepinas en la orina humana.
 Este ensayo únicamente ofrece un resultado analítico cualitativo preliminar.
 Interpretación.
 Un resultado positivo, solo indica la presencia de benzodiazepinas y no se correlaciona necesariamente
con el alcance de efectos fisiológicos y psicológicos.
 Un resultado negativo de la prueba indica que las benzodiazepinas, o no están presentes, o están en niveles
inferiores al límite de detección de la prueba.
Determinación de benzodiacepinas:
Cromatografia.
Screening.

 Una primera etapa preliminar o screening, son métodos de

inmunoensayo, que es la identificación inicial, aplicable
para el análisis de drogas de abuso.

 Descarta las muestras negativas y una segunda etapa o

confirmatoria emplea otra técnica para muestras positivas.
Finalidad del screening.
 El screening cuenta con características de selectitividad, sensibilidad, rápidez y económia, en
caso de ser positiva es necesario confirmarse. Existe una gran cantidad de métodos aplicables
para el análisis drogas de abuso.
 Algunos métodos preliminares son test de color o inmunoensayos de panel, algunos de estos
métodos requieren instrumentación.
 Resultados del inmunoensayo.
 Las interferencias en pruebas de Inmunoensayo para
detección de benzodiacepinas se deben a los valores
inapropiados de corte (cut-off).

 Un bajo nivel de corte, habrá un exceso de

resultados negativos.
Nivel de corte.
 El nivel de corte es la cantidad de droga contenida en la orina necesaria para ser detectada por los
test recomendados por entidades internacionales como FDA, (Food Drug Administration),
SAMHSA (Substance Abuse and Mental Health Services Administration), que forma parte del
NIDA (U.S. National Institute of Drug Abuse).
Ejemplo.
 Un ejemplo para el nivel de corte de calibración en análisis de benzodiacepinas, utilizando es
Oxacepam ó Nordazepam como patrón de referencia el nivel de corte es de 200 a 300 ng/mL.
 Cromatografía de gases (CG).
 La cromatografía de gases GC (Gas chromatography), por sus siglas en inglés es un método recomendado
para benzodiacepinas, en especial en aquellas que se reordenan como 3-hidroxi (con múltiples apogeos
máximos, que se relacionan entre sí).
 El ácido de Clorazepato da un apogeo máximo, que tiene un valor de índice de retención que corresponde a
Nordazepam y Ketazolam con un apogeo máximo que es muy similar a Diazepam.
 Detectores específicos.
 Los detectores apropiados para el análisis de benzodiacepinas por GC incluyen el Detector de
Captación de Electrones (EDC) y Detector de Nitrógeno-Fósforo (NPD).
 El Detector de Ionización de Flama (FID), no tiene sensibilidad suficiente para el análisis de
benzodiacepinas en general. Los fragmentos de material biológico tienden a estar contaminados y no
es adecuado para Detectores de Nitrógeno-Fósforo (NPD).
 Cromatografía de gases acoplado con

espectrometría de masas.
La Cromatografía de Gas acoplado con la Espectrometría de Masas CG/MS (Gas Chromatography / Mass
Spectrometric), por sus siglas en inglés son métodos de confirmatorios empleados para benzodiacepinas.
 La separación e identificación del analito es obtenida comparando su tiempo de retención con una base de
datos de referencia de iones patrón.
 Curva de calibración.
 Cuando el analito es cuantificado, se realiza una curva de calibración al mismo tiempo que se están
corriendo las muestras y las muestras de la calibración deben estar en la misma matriz que las muestras por
cuantificar.
 Es importante realizar los procedimientos de derivatización, antes de proceder a los análisis
cromatográficos.
Determinación de monóxido
de carbono:
Colorimetría.
Aspectos generales.
 La sangre con monóxido de carbono tiene a veces un aspecto rojo cereza debido al contenido de
COHB, pero una coloración normal de ninguna manera excluye la intoxicación.
 Comparación visual.
 En muchos Laboratorios esta técnica se utiliza diluyendo sangre
con amoniaco y comparando contra un paciente normal, sin
embargo esta prueba es poco sensible y poco específica, ya que
la sangre con cianuro también puede ser de color rosa.

 Por lo que este test no es confiable, es inespecífico y poco

sensible.
Determinación de monóxido de carbono:
Espectrofotrometría.
Fundamento.
 La medición del porcentaje de COHB en la sangre por la técnica de espectrofotometría, se basa
en comparación de los espectros de absorción de COHB con la oxihemoglobina o la hemoglobina
reducida a una longitud de onda especifica.
 Fundamento.
 Ésta reducción con un agente como el ditionito de sodio
permite que la metahemoglobina y la oxihemoglobina se
reduzcan más no así la COHB.

 El CO posee mayor afinidad por la hemoglobina,

observándose diferencia máxima en los espectros a 540nm,
mientras que a 579nm que es el punto isosbéstico se presenta
la misma absorbancia.
 La siguiente figura muestra los espectros de absorción de las diferentes especies hemoglobínicas.
Método de Beutler & West.
 El método descrito por Beutler E & West C en 1984, se basa en la producción de 2 mezclas de
pigmentos por la reducción de oxihemoglobina y metahemoglobina con hidrosulfito de sodio, las
absorbancias de los diferentes pigmentos se miden a 420 y 432nm, los resultados son reproducibles y
estables si se mantiene un pH de 6,85 mediante el uso de soluciones buffer.
 Procedimiento.
 Cuando se agrega Ditionito de Sodio como agente reductor a la sangre tanto la oxihemoglobina como la
metahemoglobina pasan a la forma reducida, dando un espectro característico, mientras que la mayor
afinidad por el oxígeno que tiene la Carboxihemoglobina, evita que esta sea reducida, generando dos picos
en diferente longitud de onda.
 Las absorbancias de los pigmentos son medidas a 420 y 432nm, a un pH de 6,85, los diferentes picos de
absorción de la COHB.
 Paso a paso:
1. Utilizar sangre venosa tomada con Heparina de Sodio almacenada de 4 a 8°C.
2. Agregar 100uL de sangre a 12mL de la solución hemolizante y mezclar 3 veces
3. Dejar a Temperatura ambiente por 10 minutos
4. Tomar 100uL de este hemolizado y adicionarle 2.3mL de solución diluyente de COHB
5. Cubrir con parafilm, mezclar varias veces y dejar a temperatura ambiente por 10 minutos.
6. Leer las absorbancias a 420 y 432nm, utilizar como blanco solución diluyente de COHB.
 Usar la siguiente ecuación para calcular la fracción de COHB (SCO) en sangre:

 AR es el radio A420/A432 del hemolizado en solución diluyente COHB.

 Las tres constantes F1, F2, y F3 pueden ser calculadas de las absorbancias molares publicadas de
la COHB a 420 y 432nm.

 F1= 1.3330 - F2= 0.4787 - F3= 1.9939

 Determinación de
monóxido de carbono:
Cromatografía.
Fundamento.

 Esta técnica se basa en la mezcla de la sangre con soluciones para lisar los
eritrocitos y liberar el CO unido a la hemoglobina, luego según la cantidad hallada
se hace una relación con la hemoglobina de la muestra para conocer el porcentaje
de saturación de COHB.
Importancia del método.
 Este es el método de referencia pero tiene
como desventaja el costo y la alta tecnología
no disponible en la mayoría de laboratorios de
urgencias.

 En la siguiente tabla se muestran las

principales ventajas y desventajas de las
técnicas para el análisis de COHB.
Informe de
resultados.
Referencias.

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