Práctica 7: Transporte de Electrones en células

vegetales.
Objetivos:
• Observar el transporte de electrones utilizando sustancias aceptoras de electrones
artificiales.
Teoría:
La fase luminosa de la fotosíntesis sirve para producir un transporte de electrones desde
la molécula del agua hasta el NADP+, siendo la luz necesaria para este proceso ya que
proporciona la energía necesaria para que los electrones de la clorofila 680 del fotosistema II
sean transportados a través de la coenzima Q, plastoquinona, citocromo B, plastocianina y
citocromo f, hasta la clorofila a 700 del fotosistema I, quién al ser excitada por la luz, transporta
los electrones hasta el NADP+ y forma NADPH + H+. En este proceso la ruptura de una
molécula de agua (fotólisis) sirven para recuperar los electrones utilizados por la clorofila del
fotosistema II.
Durante el transporte de electrones, éstos son donados y recibidos por sustancias
naturales encargadas de hacerlo, sin embargo, esto también se puede hacer, si introducimos
sustancias artificiales que reciben electrones y que al hacerlo cambian de color, y así podemos
detectar este transporte. Una de estas sustancias es el diclorofenolindofenol (DCPIP) quien es
de color azul, pero al recibir un electrón se vuelve incoloro.
Los herbicidas son sustancias que interrumpen inhiben el transporte de electrones,
impiden la formación de ATP o sirven como aceptores de electrones, ocasionando trastornos
que llevaran a la planta a la muerte.

Materiales y Reactivos:
1. Cloroplastos aislados 7. Solución Stock de 2,6 diclorofenol
2. Hojas de espinaca frescas (10 gramos) indofenol (DCPIP) 2.2 x 10-2 M
3. Mortero, embudo, gasa 8. Solución de trabajo de DCPIP: Tomar
4. Centrifuga 2.7 mL del stock y llevar a 100 mL
5. Tubos de ensayo y pipetas con agua destilada.
6. Buffer fosfato de sodio 0.15 M, pH
7.0 (frío)

Mg. Ana Gutiérrez Román (agutierrez@unfv.edu.pe) 1

Dr. Oscar Nolasco Cárdenas (onolasco@unfv.edu.pe)
Procedimiento:
• Moler en el mortero 10 g de hojas de espinaca con 50 mL Buffer fosfato de sodio 0.15M
a pH7.0
• Filtrar con gasa y separar el filtrado.
• Centrifugar el filtrado a 800 rpm/5 min. y el sobrenadante trasvasarlo a un tubo limpio y
volver a centrifugar a 3000 rpm/5 min, quedarse con el precipitado.
• Resuspender el precipitado o residuo que contienen los cloroplastos con 20 mL de buffer
fosfato de sodio frío. Mantenerlos en frío.
• Preparar el siguiente set de tubos:
Tubos
Soluciones
1B 1 2B 2 3B 3 4B 4 5Bi1 5i1 6Bi2 6i2
Buffer Fosfato 0.15M, pH 7
2.0 2.0 1.7 1.7 1.5 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
(mL)
2.6 Diclorofenol indofenol
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
(DCPIP), 2.2 x 10-2 M (mL)
Solución Inhibidora 1 (mL) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.5 0.5 0.0 0.0
Solución Inhibidora 2 (mL) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.5 0.5
Cloroplastos (mL) 0.5 0.5 0.8 0.8 1.0 1.0 1.5 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0
Volumen final (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

• Al tubo # 1B, 2B,3B, 4B, 5Bi1 y 6Bi2 se le debe cubrir con papel aluminio o colocarlos
inmediatamente en la oscuridad.
• Los tubos # 1, 2, 3, 4, 5i1 y 6i2 deben dejarlos descubiertos y acercarlos a la fuente de
luz.
• Observar sus tubos durante 2, 5, 10 y 20 minutos.
• Anotar sus resultados, asignándole valores cualitativos a sus observaciones en cada
tiempo.
• Leer sus tubos en el espectrofotómetro a 610 nm, a los 10 minutos en una cubeta de vidrio,
calibrando el equipo con agua destilada. Para sus resultados cuantitativos utilizar el Factor
= 3.8667 y expresar sus resultados como µmoles de DCPIP.
Cuestionario:
1. Escriba la ecuación de reacción del DCPIP en el experimento.
2. Indique con un esquema los sitios donde los inhibidores que se han utilizado en la
práctica, actúan sobre el flujo de electrones.
3. Explique como se altera el proceso fisiológico observado
4. Para cada inhibidor explique su mecanismo de acción.
5. Identifique que otros compuestos pueden alterar el transporte de electrones, cuales
impiden la formación de ATP y cuales actúan como aceptores de electrones.
Bibliografía:
1. The Science of Paraquat
www.paraquat.com/AboutParaquat/TheScienceofParaquat/tabid/217/Default.aspx
2. Barr R. y Crane, F.L. (1976) Organization of Electron Transport in Photosystem II of
Spinach Chloroplasts According to Chelator Inhibition Sites 1 Plant Physiol. 57(3): 450–453

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Dr. Oscar Nolasco Cárdenas (onolasco@unfv.edu.pe)