TCNICAS CLSICAS PARA EL AISLAMIENTO DE LEVADURAS: OBTENCIN DE CULTIVOS PUROS Y PRUEBAS DE IDENTIFICACIN

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Portada: Cultivo en placa

Flavio Columela ver. 3.0

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1. INTRODUCCIN El aislamiento de un microbio consiste en obtener su cultivo puro, cultivo que procede de la multiplicacin de individuos de la misma especie y a partir de una sola clula. La obtencin del cultivo puro constituye el primer paso para la realizacin de estudios microbiolgicos de cualquier tipo y en cualquier industria. Estos estudios microbiolgicos en Enologa, suelen abordarse bajo tres aspectos fundamentales: el taxonmico, el fisiolgico, y el ecolgico. Con este triple enfoque se pretende llegar al conocimiento de cuales son las especies de levaduras que intervienen de manera activa en la fermentacin espontnea de nuestros mostos, de cual es la distribucin de tales especies en las diferentes comarcas productoras, y finalmente con el estudio tecnolgico preciso, descubrir las cualidades destacables en cada una de ellas, que podran tener un inters aplicado directo en la industria. 2. TECNICAS DE RECUENTO Y AISLAMIENTO (BANCO DE DILUCIONES) PROCEDIMIENTO Se toma 1 ml. de la muestra con pipeta estril, y se deposita su contenido en el primer tubo de ensayo con 9 ml. de suero Ringer estril. Dicho tubo se agita para homogeneizar la mezcla que constituye la dilucin 1/10. Con otra pipeta estril se repite esta operacin, pero partiendo de la dilucin 1/10, que se transfiere a otro tubo, tambin con 9 ml. de suero y que corresponde a la dilucin 1/100. La muestra se diluye cada vez ms utilizando una pipeta estril para cada dilucin, atendiendo a las fundadas sospechas sobre su contenido microbiano, y se efectan las siembras necesarias. De cada dilucin, o solamente de aquellas que sospechamos mas cercanas a la poblacin microbiana de la muestra, se deposita 1 ml. en cada placa.
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Cuando el medio de cultivo, OGGA AGAR DE MALTA. ya est estril y licuado, y mantenido en bao mara a 45C, se agrega a razn de 20 - 25 ml. por placa sembrada, dotando a cada una de ellas de un movimiento de rotacin uniforme para que el reparto de colonias resulte homogneo. Cuando el medio ha solidificado, se incuban las placas invertidas, en estufa a 27C durante 48 horas.

RECUENTO MICROBIANO Retiradas las placas de la estufa de cultivo, se cuentan las colonias desarrolladas en cada una de ellas, a ser posible en aquellas que contienen ms de 30 y menos de 300. Si el nmero de colonias sobrepasa las 300, incluso en la dilucin mayor, se divide la placa en segmentos, se cuenta el nmero de colonias presentes en cada uno de ellos, y el resultado se multiplica por el nmero de los mismos. Para reducir el error individual al mnimo, esta operacin puede realizarse en cmara cuadriculada, o utilizando lente de 2,5 x de . El resultado se expresa en colonias x ml. (n de colonias x factor de dilucin). AISLAMIENTOS El aislamiento de colonias se lleva a cabo tomando stas con aguja de platino, en las placas en las que se encuentran suficientemente distanciadas. A continuacin se transfieren a tubos de ensayo con mosto de uva estril de 10 B. Despus de su incubacin (a 27C durante 48 horas) y desarrollo, se siembran en tubos con agar de malta inclinado para su taxonoma y posterior conservacin.

ESQUEMA DEL PROCEDIMIENTO

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

Diluciones

9 ml. Sol. Ringer Mosto matriz

10

-2

10

-4

10

-6

10

-8

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml Siembra

20 ml 45 C Aislamiento Medio Ogga Agar-malta

Mosto estril 10 B.

Agar-malta
Clasificacin

Mosto uva
Liofilizacin

3. MEDIOS DE CULTIVO PARA AISLAMIENTO DE LEVADURAS Mosto-malta 1 Kg de malta molida se mezcla con 2,6 litros de agua y se calienta al bao M durante 3 horas a 45C y en agitacin. Pasado este tiempo la temperatura se eleva a 65C manteniendo esta temperatura durante 1 hora. A continuacin se deja enfriar y se realiza la mezcla con el mosto concentrado y sin SO2. Posteriormente se filtra y se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 3 - 5 minutos. Finalmente se diluye con agua hasta 6Be., se ajusta el pH a valor 5,4 y se agariza al 2%. Se homogeneza al B M y se esteriliza en el autoclave a 121C durante 15 minutos. Tambin puede prepararse a partir de extracto de malta de casas comerciales: ejemplo de ADSA DIFCO. Agar-Malta Se pesan; Extracto de malta .. 13 g / 100 ml. Agar .. 2 g para 100 ml. Para rellenar 6 cajas Petri son necesarios 200 ml de nutrientes, por lo tanto para ello se pesan 26 g de extracto de malta y 4 g de agar. Se calientan los 200 ml de agua sin llegar a hervir y se aade poco a poco y agitando el agar. Una vez disuelto se retira de la fuente calorfica y se aade el extracto de malta en caliente hasta su disolucin. Rpidamente (antes de que se enfre) se reparte entre las 6 cajas. Las cajas se cierran, se envuelven y se esterilizan en autoclave durante 15 min. a una temperatura de 121C.
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Medio Ogga Esta formado por: Glucosa ................................... 2,0 g. Extracto de levadura ........ 0,5 g. Agar ......................................... 2,0 g. Agua destilada .................... 100 ml. Despus de esterilizar el medio a 1 atmsfera, durante 15 minutos, se aaden 10 ml. de solucin de Terramicina al 0,1% para inhibir el crecimiento bacteriano. Es un medio ideal para la conservacin de levaduras. Solucin Ringer Formada por: Sodio Cloruro .............................. 0,225 g. Potasio Cloruro .. .. .. .. .. .. .. .. .. 0,011 g . Calcio Cloruro .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 0,012 g . Carbonato monosdico .. .. .. .. 0,005 g . Agua destilada .................... 100 ml. Se reparte, poniendo 9 ml. en cada uno de los tubos de 16 x 160 mm. y se esterilizan en autoclave durante 15 minutos a 121C. LM (para mantenimiento de colonias) Extracto de levadura 3 g Extracto de malta .. 3 g Peptona ... 5 g Glucosa . 10 g Agar 20 g (2%) Agua destilada 1 L.

4. CLASIFICACIN DE LEVADURAS Los trminos taxonoma y sistemtica marcan en su significado matices diferenciales claros. La palabra TAXONOMIA trata de los principios de clasificacin y el trmino SISTEMATICA, de los resultados que se obtienen al aplicar tales principios. Taxonoma y sistemtica son procesos en evolucin, y por tanto sujetos a cambios, tanto por la aparicin de nuevas especies, como por la introduccin de nuevos caracteres diferenciales. Un carcter es la respuesta que da una levadura a determinada prueba, si bien algunos de los caracteres que se toman en consideracin en la sistemtica, pueden ser cambiantes o variables. Ejemplo de cita obligada es el tipo de colonia "lisa" o "rugosa", que WICKERHAM (1964) reconoci que eran debidos a una mutacin de modelos de metabolismo fermentativo, a formas oxidativas, en los que estn implicados varios genes. Otra variabilidad clsica, consiste en la prdida de la capacidad de esporulacin en las cepas que se conservan en coleccin. Las cepas recin aisladas del mosto esporulan con facilidad en muchos medios. Cuando se mantienen mucho tiempo en un medio especfico, siempre el mismo, se restringen las condiciones de esporulacin hasta el punto de perderse por completo. Como criterios de clasificacin de levaduras, se sigue el examen de aquellos rasgos que son distintos en los diversos tipos. Los criterios taxonmicos ms importantes utilizados en la clasificacin de levaduras son los siguientes: MORFOLOGICOS Caractersticas de la reproduccin vegetativa - Gemacin - Biparticin - Combinacin de los dos procesos Caractersticas de las clulas vegetativas - Morfologa celular en medio slido. - Morfologa celular en medio lquido.
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CULTURALES Desarrollo en medio lquido. Formacin de velo. Desarrollo en medio slido. SEXUALES Formacin de esporas FISIOLOGICOS Y TECNOLOGICOS Utilizacin de compuestos carbonados - Fermentacin de azcares - Asimilacin de azcares - Hidrlisis o escisin de la arbutina - Desarrollo en presencia de etanol Asimilacin de nitratos Poder fermentativo. 5. PROCEDIMIENTO SISTEMATICO En la identificacin de cultivos puros de levaduras se sigue una tcnica bien definida, que responde a la indicada por la Escuela Holandesa de Kluiver en Delft, con ligeras modificaciones de la Escuela de Microbiologa Enolgica de Perugia, (CASTELLI T.,IIGO B, 1958). El procedimiento sistemtico se acomoda a los propuestos por LODDER J. (1952,1967,1970), BARNETT J.A., Y PANKHURST R.A. (1974), BARNETT J.A., PAYNE R.W., Y YARROW D. (1979), y KREGER VAN RIJ (1984), optando por unos procedimientos u otros, en funcin del nmero y tipos de test o pruebas a realizar. Las correspondencias de denominaciones entre estos sistemas de clasificacin citados, se reflejan en la Tabla n 1., sin embargo, en determinados casos, es preferible mantener las denominaciones antiguas en funcin de la importancia del criterio utilizado como test taxonmico. Adhirindonos al pensamiento del profesor Florenzano G. (1984), los cambios ltimamente producidos en el campo de la taxonoma de levaduras, y su repercusin en el tema enolgico, no han sido suficientes como para anular los fundamentos de la microbiologa enolgica, no encontrndose sta constreida por normas y dogmas, sino abierta y capaz de sincronizarse con todo tipo de progreso futuro.
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Los mtodos y procedimientos que se siguen para establecer los caracteres de una levadura, y que han de ser aplicados en la descripcin de una especie, han sido descritos en su mayor parte por WICKERHAM (1951) y LODDER - KREGER VAN R.J. (1952). Los caracteres fundamentales mnimos que se toman en consideracin para llevar a cabo esta descripcin estndar son los siguientes:

5.1. EXAMEN MACROSCOPICO y MICROSCOPICO Se realiza examen macroscpico y microscpico de los cultivos puros crecidos en medio slido (Agar de malta) y lquido (Mosto de Uva de 10 B). La observacin microscpica del cultivo crecido en agua de malta, se hace tomando el inoculo con agua estril y colocndolo en una gota de agua tambin estril, depositada sobre el portaobjetos. Se emplea microscopio de contraste de fase, anotando, Forma, Tamao Tipo de gemacin La observacin de levaduras en mosto de uva estril, se lleva a cabo a los tres das de la siembra, observando los mismos caracteres morfolgicos. En ptinas viejas se observa si hay presencia de esporas.

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5.2. FORMACIN DE RAMIFICACIONES PSEUDOMICELIARES Las ramificaciones pseudomiceliares provienen de la gemacin. Las clulas hijas forman agregados, y aunque entre ellas no aparecen septos definidos, s se perciben constricciones ms menos pronunciadas. Es caracterstico el hecho de que la clula terminal sea de igual tamao, o mas corta, que el resto. Para su observacin se sigue la tcnica de RIVALIER - SEYDEL (1932). En el fondo de las Placas Petri se coloca papel absorbente y un tubo de vidrio acodado sobre el que se deposita un porta. Despus de esterilizarlo en la estufa durante 2 horas a 120C, se aplican sobre el porta, trabajando en condiciones aspticas, unas gotas de agar-malta. La siembra se hace en estra, una vez que el medio est frio y solidificado. Sobre el papel se vierte agua estril para mantener la humedad del ambiente dentro de la Placa Petri. Las posibles ramificaciones se observan mediante el binocular a los 15 y los 30 das de la siembra. Muy a menudo, existe una diferenciacin apreciable entre las clulas que forman el pseudomicelio. Dependiendo de la forma, disposicin y estructura de las blastosporas, pueden distinguirse tres tipos de pseudomicelio: - Tipo MICOCANDIDA. Con blastosporas o menos ramificadas en los verticilos. - Tipo MICOTORULA. Con blastosporas redondas y con disposicin axial en los verticilos. - Tipo BLASTODENDRIUM. Con blastosporas alargadas y ramificadas en los verticilos.

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5.3. FORMACIN DE VELO Se prepara mosto de uva de 8 Beaum, diluyendo en agua destilada mosto de uva concentrado. Se ajusta el pH a 5, utilizando solucin de NaOH para subir el pH, o bien, solucin de ClH para bajarlo. Se esteriliza el mosto en el autoclave, a una atmsfera durante 10 minutos. Se deja enfriar y se filtra mediante un filtro de jarabe. Se reparten 10 ml. en cada uno de los tubos de 16 x 160 mm. Nuevamente se esteriliza en el autoclave, a media atmsfera durante 30 minutos. De esta forma tenemos un mosto claro y estril, preparado para la siembra. Dicha siembra se efecta pasando un asa de cada cultivo joven, de 48 horas, a un tubo de mosto de uva, realizando esta operacin por duplicado. El medio inoculado se mantiene durante un mes a la temperatura de 21C +/- lC. La primera observacin se lleva a cabo a los 2 das de la siembra. Se anotan los resultados de la siguiente manera: - Presencia de velo con el signo (V) - Presencia de islotes con el signo (I) - Presencia de anillo con el signo (A) - Ausencia de velo con el signo (-) El signo (S) se reservar para los casos en que se aprecie sedimento de la cepa en el mosto.

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5.4. FORMACIN DE ESPORAS La esporulacin se provoca cultivando las cepas en placas Petri estriles sobre un medio rico en glucosa en el que permanecen durante un perodo de dos das, pasndolas a continuacin a otro medio de cultivo, pobre en glucosa y que contiene acetato de potasio. MEDIO DE PREESPORULACION Glucosa ................................5,0 g. Extracto de levadura..1,0 g. Nutrient Broth (Difco).3,0 g. Agar...2,0 g. Agua destilada ..100 ml. Se esteriliza el medio y se enfra hasta los 45C. A continuacin se reparte en placas Petri, poniendo 20 ml. en cada una; o bien en tubos de ensayo, a razn de 6 ml. por tubo, esterilizndolos posteriormente. MEDIO DE ESPORULACION Acetato de potasio..0,98 g. Glucosa....0,1 g. Extracto de levadura0,25 g. Agar...2,0 g. Agua destilada ..100 ml. Al igual que en el caso anterior, el proceso de esterilizacin se realiza en el autoclave, a una atmsfera de presin durante 15 minutos. As mismo se enfra hasta los 45 C. y se ponen 20 ml en cada una de las placas Petri. Igualmente puede realizarse en tubos de ensayo. En el primer medio se mantienen las cepas a una temperatura de 28C. durante dos das. Seguidamente, las cepas a examinar se siembran en el segundo medio, en el que se mantienen por espacio de cinco das a una temperatura de 23C +/- 1.
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Pasado el perodo de incubacin en el segundo medio, se hace una preparacin en fresco, seguida de la observacin microscpica. En los casos poco claros se hace una tincin de esporas para facilitar la observacin microscpica: Se aplica una gota de la suspensin de la cepa a estudiar, se extiende en el porta y se fija a la llama del mechero, muy lentamente. Se aade verde malaquita, pasando por debajo del porta un hisopo encendido, mantenindolo hasta el momento en que se observa emisin de vapor. La formacin de vapor ha de mantenerse durante tres minutos, tras lo cual se lava con agua estril y se deja durante un minuto con Fuchsina Bsica. De nuevo se lava y se deja secar la preparacin para la observacin microscpica. Realizada esta prueba se puede asegurar que las cepas que resulten esporuladas, lo son, pero no, que las que no presentan esporas no sean capaces de producirlas en otras condiciones. Se toma en consideracin la presencia o ausencia de esporas, y si las hay, su nmero y forma. TINCIN DE ESPORAS Por el mtodo general conlleva los siguientes pasos: 1) Fijacin del frotis. 2) Aplicacin, durante 10 minutos, de solucin saturada de verde malaquita. 3) Lavar con agua durante 10 segundos. 4) Contrastar durante 15 segs. con una solucin de safranina al 0,25%. 5) Lavar con agua y secar 6) Examinar con aceite de inmersin, bajo objetivo de aumento ( 10x100) Solucin Verde Malaquita: Verde malaquita 0,01 g Agua destilada 100 ml. Solucin de Safranina: Safranina 0,25 g Agua destilada 100 ml.

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5.5. FERMENTACION DE AZCARES Esta prueba se realiza a partir de un cultivo joven (48 horas) y en un medio lquido. MEDIO PARA LA FERMENTACION DE AZUCARES Yeast Nitrogen Base (Difco) .......0,67 g. Azcar a examen 2,00 g. Agua destilada ............................... 100 ml. Se reparte en tubos de 16 x 160 mm. (que poseen en su interior una campanita Durham) a razn de 7ml en cada uno. Se esteriliza en el autoclave a 1 atmsfera, durante 15 minutos. Se siembran los tubos en duplicado con las especies a estudiar. La incubacin abarca un perodo de 15 das a una tempera tura de 28C. El gas resultante de la fermentacin, caso de que sta se produjera, sera recogido en la campana. En el caso del azcar RAFINOSA, una vez transcurrido el periodo de incubacin, se realiza una cromatografa de papel para las especies fermentativas en las que los resultados fueron positivos. La rafinosa est compuesta por tres azcares: MELIBIOSA FRUCTOSA - GLUCOSA - GALACTOSA SACAROSA Si es Melibiosa el compuesto que queda en el medio, la fermentacin ha sido 1/3; igual que si es Sacarosa el que queda libre. Sin embargo, el hecho de que quede Galactosa libre nos indica que la fermentacin ha sido 2/3. Es tambin posible que no queden restos de ningn azcar libres en el medio, lo cual indica que la Rafinosa ha sido totalmente fermentada: fermentacin 3/3.
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La cromatografa se realiza sobre papel "WHATMAN" n 1. Mediante una micropipeta se hacen tres aplicaciones sucesivas de cada uno de los cultivos fermentados en Rafinosa. En cada aplicacin hay que esperar a que la mancha anterior est completamente seca. Sobre el mismo papel y de igual forma se hacen otras aplicaciones de soluciones de azcares que pudieran aparecer como resultado de la fermentacin de la Rafinosa y solucin de Rafinosa misma. Estos azcares son: Sacarosa, Melibiosa, Galactosa y Fructosa. Se utilizan como patrones. Usando el mismo eluyente se satura el papel y se deja en una cubeta durante 12 horas. Una vez fuera de la cubeta, y completamente seco, se pulveriza el revelador-fijador sobre el papel. Despus se introduce el papel en la estufa hasta que aparezcan las manchas indicadoras. ELUYENTE PARA LA CROMATOGRAFIA DE PAPEL Butanol .. 60 ml Piridina ..40 ml Agua destilada ...30 ml Para cada cromatografa se aplican 50 ml aproximadamente. REVELADOR p-anisidina ..1 g ClH (1M)... 8 ml. Se enrasan hasta 100 ml con n-butanol y se aade sodio hidrosulfito (ditionito de sodio MERCK). (Disolver en el ClH y aadir a la mezcla panisidina + butanol ). Una vez seca la cromatografa se le aplica el revelador mediante un pulverizador y posteriormente se mete en estufa unos minutos a 110 C hasta aparicin neta de las manchas.

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5.6. ASIMILACIN DE AZCARES Esta prueba se realiza con las cepas que no han fermentado alguno de los azcares. Se trata de conocer las cepas que son capaces de metabolizarlos por va oxidativa. Se lleva a cabo en tubos de ensayo siguiendo la tcnica de CAPRIOTTI A. (1955), o bien en cajas Petri por el mtodo auxonogrfico, utilizando en ambos casos medios de cultivo slidos (A y B respectivamente). A. MEDIO PARA LA ASIMILACIN DE AZCARES

Yeast Nitrogen Base (Dfco) . 0,67 g. Azcar a examen ..1 g. Agar ..2 g. Agua destilada ..100 ml. Se lica el agar en bao de agua hirviendo. Se homogeneza y se reparte en tubos de 16 x 160 mm., poniendo 5 ml en cada uno de ellos. Despus se esteriliza durante 15 minutos a 121 C. Al sacar los tubos del autoclave se tumban para tener una superficie inclinada adecuada al criosolidificarse.

La siembre se hace de forma indirecta, pasando un asa de cultivo joven (de 48 horas) a un tubo que contiene 10 ml de agua destilada estril; se agita y se vierte el contenido sobre el medio de asimilacin. Se deja caer el sobrenadante y se cierra de nuevo el tubo del medio. A continuacin se incuban los tubos en estufa a 28 C durante 15 das.
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La existencia de crecimiento sobre la superficie del medio indica respuesta positiva, mientras que su ausencia se considera como resultado negativo. Esta misma prueba puede realizarse mediante el mtodo auxonogrfico, utilizando el medio de cultivo y tcnica que se describe a continuacin: B. MEDIO PARA EL METODO AUXONOGRFICO

Yeast Nitrogen Base 0,67 g. Agar ......2,0 g Agua destilada ....100 ml Se esteriliza en el autoclave en iguales condiciones de presin, temperatura y tiempo que el medio anterior. A continuacin se vierte en cada placa Petri estril una suspensin en agua estril de la cepa a estudiar, junto con 20 ml del medio fluidificado y a 45 C; a continuacin se agita rotativamente la placa de forma que el reparto de colonias resulte lo ms homogneo posible. Una vez solidificado el medio se colocan sobre l discos de papel absorbente Scheleicher & Schull impregnados en soluciones estriles de los azcares al 2%. Las placas se mantienen en estufa a 28 C, y a los 4 das se observa si se han producido halos de crecimiento alrededor de algunos de los discos de papel impregnado en los azcares a investigar.

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5.7. ESCISIN DE ARBUTINA Esta prueba se realiza para confirmar la existencia de la enzima

-glucoxidasa en las cepas a examen. Se sigue la tcnica de DIDDENS y

LODDER citada por LODDER y KREJER VAN RIJ (1952). El medio de cultivo slido utilizado tiene la composicin analtica siguiente: MEDIO PARA LA ESCISIN DE ARBUTINA Arbutina ....0,5 g Extracto de levadura . 0,1 g Agar ..2,0 g Agua destilada .100 ml. Para licuar el agar se pone en un bao de agua hirviendo. Se homogeneza agitndolo suave y lentamente, y se reparte en tubos (a razn de 5 ml. por tubo) que contienen cada uno una gota (0,1 ml. aproximadamente) de una solucin de Cloruro de hierro, en una proporcin de 1 g. por 100 ml. de agua destilada. Se esterilizan los tubos en el autoclave, a 1 atm. durante 15 min. Se deja un tubo o dos sin sembrar, como testigos, para compararlos con el posible cambio de color que experimentar el medio en los tubos sembrados. La siembra se realiza en estufa a partir de un cultivo joven de 48 horas, incubando los tubos sembrados a 27 C. A los 15 das se compara la tonalidad del medio con la de un tubo testigo que se conserva con medio estril como patrn. La sal frrica soluble, reacciona con la quinona libre procedente de la hidrlisis de la arbutina (hidroquinona - - D - glucopiransido), dando lugar a la aparicin de un color oscuro, consecuencia de la actividad de la enzima, o quedando en su coloracin original en caso negativo.
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5.8. ASIMILACIN DE NITRATOS Se sigue la tcnica de STELLING-DEKKER (1931). En este mtodo, como en la prueba de asimilacin, se observa el desarrollo por comparacin con un tubo testigo. Es necesario preparar 2 medios de cultivo diferentes, ambos agarizados, pero uno con nitrato de potasio y el otro carente de l. MEDIO PARA LA ASIMILACIN DE NITRATOS Yeast Carbn Base (DIFCO)..1,17 g KNO30,078 g Agar .. 2,00 g Agua destilada 100 ml Se lica en agua hirviendo y se reparte en tubos, 5 ml en cada uno de ellos. Se esterilizan en autoclave a 1 atm y durante 15 minutos. A continuacin se inclinan los tubos ya esterilizados. MEDIO PARALELO Yeast Carbn Base (DIFCO) .. 1,17 g Agar ..2,0 g Agua destilada ..100 ml Para su esterilizacin y reparto se sigue el mismo procedimiento que en el medio anterior. Una vez que se han esterilizado los tubos, se prepara una solucin de suero fisiolgico al 0,85% y, tras repartir 10 ml aproximadamente en cada tubo de ensayo, se esterilizan en autoclave a 1 atm. durante 15 min. Se siembra en el suero la cepa a estudiar, se agita y se vierte la suspensin en los dos tubos (el que contiene Nitrato de potasio y el que no), tirando el sobrenadante. La incubacin dura 15 das a 28 C., una vez cumplido este periodo de tiempo, se comparan cada uno de los dos cultivos pertenecientes al mismo microorganismo, y se observa si la presencia de Nitrato de potasio ha facilitado o no el crecimiento de la cepa sembrada. En el caso de que el crecimiento sea mayor en el medio que contiene nitrato, que en el que carece de l, se considera positivo el resultado de la prueba, cuando no se aprecie ninguna diferencia se anotar el resultado como negativo, pues se considera nula la influencia de nitrato.
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5.9. DESARROLLO EN PRESENCIA DE ETANOL Se sigue, como en el mtodo anterior, la tcnica de la escuela italiana de STELLING-DEKKER. La siembra se realiza sobre medio sinttico (Yeast Nitrogen Base: 0,67%), adicionado de un 3% de alcohol etlico como nica fuente de carbono. Los cultivos se mantienen, a 27 C, en observacin durante treinta das para apreciar la eventual existencia de desarrollo celular, y formacin de velo. 5.10. PODER FERMENTATIVO El poder fermentativo es la medida del porcentaje (v/v) de etanol que una cepa de levadura es capaz de producir. Para la realizacin de esta prueba se dispone de matraces de 100 ml., que se tapan con algodn cardado y se esterilizan a 180C durante dos horas. A partir de mosto de uva concentrado se prepara mosto de 12 Baum, previa dilucin del mismo con agua destilada, y medida de la graduacin con aremetro Baum graduado de 10 a 20. Se ajusta el pH a 5, usando soluciones de NaOH ClH, y se reparte en los matraces estriles de 100 ml a razn de 50 ml exactos por matraz. Posteriormente se tapa cada matraz con algodn y papel sulfurizado y se esterilizan en autoclave 15 minutos a 1 atmosfera. Las cepas a examen se han sembrado previamente en agar malta y a partir de estos cultivos jvenes se llevan a cabo las siembras en los matraces que contienen el mosto estril. Tras la inoculacin, se sustituye el tapn de algodn cardado por una vlvula Mller con cido sulfrico concentrado que evita la entrada de oxgeno, y permite la salida de CO 2 , as como la fijacin de otros productos de la fermentacin. Terminadas las siembras, se pesa cada matraz, operacin que se repite diariamente para de este modo, poder medir por diferencia de peso, el anhdrido carbnico formado, hasta que se alcance un peso constante.
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Calculando la diferencia entre la primera pesada y la ltima, y multiplicando esta diferencia por el factor 2,5, se obtiene un producto que es igual al poder fermentativo expresado en % de alcohol en volumen. El clculo de este factor se realiza a travs de los siguientes pasos: 180 g de glucosa producen al fermentar 88 g de CO2 + 92 g de etanol, por tanto a 1 g de CO2 le corresponde 1,04 g de etanol. Siendo la densidad del etanol 0,79, los 1,04 g ocupan un volumen de 1,3 ml de etanol. La diferencia de peso en gramos, multiplicada por 1,3 dar el volumen de etanol producido. V ml mosto..1,3 x P ml de etanol 100 ml mosto .. X ml de etanol Y siendo en este caso V = 50 ml ; X = 1,3 x 100 x P / 50 = 2,6 x P

En la prctica se multiplica por 2,5 dado que existe una contraccin de volumen al mezclarse el etanol que se produce con el medio acuoso.

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MORFOLOGA Y PRUEBAS TECNICAS

Velo Islotes No velo

48 horas

20 dias

Mosto uva Agar malta

Pseudomicelio

Observacin Microscpica

Clamidosporas

Siembra + 20 das

Blastosporas

Valvula con sulfrico Astrosporas Control de peso

PRUEBAS FISIOLGICAS

Mosto de Uva

48 horas

15 dias

Cepa a estudiar Cultivo joven + +

45 C

Fermentacin

AUXONOGRAMA

+
15 dias

Asimilacin

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